牛 恒,邱 爽

(云南省第一人民醫(yī)院乳腺甲狀腺外科,云南 昆明 650032)

根據(jù)2019年國家癌癥中心發(fā)布的2015年中國惡性腫瘤流行情況分析,乳腺癌已經(jīng)成為了女性惡性腫瘤中發(fā)病率最高的癌癥,達到45.29/10萬,同時其死亡率達到8.16%[1],嚴重威脅著女性生命健康。臨床研究顯示,癌癥轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為乳腺癌患者死亡的主要原因[2-3]。大量研究表明,Circular RNA(CircRNA)廣泛參與了乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[4-6]。最近研究顯示,Fibronectin type III domain-containing protein 3B circular RNA (CircFndc3b)參與了食管癌、胃癌等腫瘤細胞的增殖、侵襲等生物學(xué)過程[7-8]。如Hong等[8]發(fā)現(xiàn)CircFndc3b通過調(diào)節(jié)E-cadherin和CD44的表達,促進胃癌細胞的遷移和侵襲。然而CircFndc3b在乳腺癌細胞中的生物學(xué)功能目前研究報道較少。因此,我們探究了CircFndc3b在調(diào)控乳腺癌細胞侵襲和遷移中的作用,同時對CircFndc3b的作用機制進行了初步探究,以期為乳腺癌的發(fā)病機理研究和臨床治療提供新的靶點。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

總RNA提取試劑盒和TaKaRa一步法熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司;干擾序列和引物的設(shè)計和合成由生工生物工程(上海)股份有限公司提供;胎牛血清、Lipofectamine 2000、培養(yǎng)基、實時熒光定量PCR儀購自賽默飛世爾科技公司;Western blotting相關(guān)試劑購自上海恪敏生物科技有限公司;E-cadherin鼠單克隆抗體、N-cadherin鼠單克隆抗體、GAPDH鼠單克隆抗體、HRP標記的二抗購自杭州華安生物技術(shù)有限公司;RIPA解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Transwell實驗試劑盒購自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司。

1.2 細胞

人乳腺癌細胞系(MCF-7、MDA-MB-231、BT474以及BT20)和MCF-10A人正常乳腺上皮細胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫;MCF-7細胞、BT20細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中,MDA-MB-231細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基中,BT474細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,MCF-10A細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中,在37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至70%～80%融合度時,進行傳代培養(yǎng)。

1.3 轉(zhuǎn)染

對數(shù)生長期的MCF7和MDA-MB-231細胞接種于 6 孔板(1×105個/孔)中,70%～80%細胞融合度時進行轉(zhuǎn)染,將含有CircFndc3b siRNA的Lipofectamine 2000和MCF7、MDA-MB-231細胞進行孵育(si-CircFndc3b組),同時設(shè)置Ctrl組(僅Lipofectamine 2000處理),48 h后收集MCF7和MDA-MB-231細胞,進行后續(xù)相關(guān)研究。

1.4 熒光定量PCR實驗

收集對數(shù)生長期的各組細胞,經(jīng)過總RNA提取試劑盒提取總RNA后,利用TaKaRa 一步法熒光定量PCR試劑盒檢測CircFndc3b以及miRNA-5702和miRNA-7106-5p水平。反應(yīng)條件:45 ℃,10 min;95 ℃,5 min;95 ℃,10 s;60 ℃,45 s;共40次循環(huán)。GAPDH mRNA作為CircRNA內(nèi)參、U6作為miRNA內(nèi)參,最后根據(jù)2-ΔΔCt法計算相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 Transwell實驗

在Transwell小室底部加入培養(yǎng)基和基質(zhì)膠(體積比1∶1)的混合物0.1 mL,37 ℃孵育4 h后加入0.1 mL的MCF7和MDA-MB-231細胞懸液(1×106個/mL),同時下室加入培養(yǎng)基0.5 mL,培養(yǎng)48 h后,進行4%多聚甲醛固定和結(jié)晶紫室溫染色。顯微鏡下隨機選取5個視野進行細胞計數(shù)。

1.6 劃痕實驗

MCF7和MDA-MB-231細胞分別接種于6孔板中,細胞生長至融合度95%以上時,利用移液器槍頭(200 μL)在單層MCF7和MDA-MB-231細胞上進行劃痕,經(jīng)PB清洗散落細胞后,加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h(37 ℃),在0 h、24 h時候進行取樣拍照并計算遷移程度。遷移程度=(0 h兩側(cè)距離-24 h兩側(cè)距離)/0 h兩側(cè)距離。

1.7 Western blotting實驗

收集不同處理的MCF7和MDA-MB-231細胞,經(jīng)RIPA裂解液處理0.5 h(4 ℃)后,進行總蛋白提取。取蛋白樣品50 μg進行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)移至PVDF膜后進行5%脫脂奶粉封閉,清洗后加入E-cadherin鼠單克隆抗體、N-cadherin鼠單克隆抗體、GAPDH鼠單克隆抗體,4 ℃搖床孵育過夜后進行TBST洗膜,然后加入HRP標記的二抗,室溫孵育120 min,TBST洗膜后進行ECL顯色以及曝光和定影。利用Image J軟件測定灰度值。

1.8 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 CircFndc3b在乳腺癌細胞中高表達

通過qRT-PCR,發(fā)現(xiàn)CircFndc3b在人乳腺癌細胞系(MCF-7、MDA-MB-231、BT474以及BT20)表達水平顯著高于MCF-10A人正常乳腺上皮細胞(均P<0.01);且CircFndc3b在MDA-MB-231細胞中水平最高,其次為MCF-7細胞,結(jié)果見圖1(a)。轉(zhuǎn)染siRNA后,MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞中CircFndc3b水平顯著降低(均P<0.01),結(jié)果見圖1(b)。

2.2 CircFndc3b促進乳腺癌細胞侵襲和遷移

Transwell實驗結(jié)果顯示,敲低CircFndc3b表達后,MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞的侵襲細胞數(shù)量顯著降低(均P<0.01),結(jié)果見圖2。劃痕實驗表明,敲低CircFndc3b表達后,MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞的遷移距離顯著低于Ctrl組(均P<0.01),結(jié)果見圖3。Western blotting檢測侵襲和遷移相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn),敲低CircFndc3b表達導(dǎo)致MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞中E-cadherin表達明顯升高,而N-cadherin表達顯著降低(均P<0.01),結(jié)果見圖4。

圖1 CircFndc3b在乳腺癌細胞中高表達

圖2 Transwell實驗檢測CircFndc3b對MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞侵襲能力的影響

2.3 CircFndc3b靶點預(yù)測及初步驗證

利用miRDB數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)CircFndc3b具有47個潛在的靶點miRNAs,其中miRNA-5702和miRNA-7106-5p的評分超過90分,結(jié)果見圖5(a)。qRT-PCR檢測顯示,敲低CircFndc3b后,MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞中miRNA-5702和miRNA-7106-5p表達水平顯著升高(均P<0.01),結(jié)果見圖5(b)、圖5(c)。

圖3 劃痕實驗檢測CircFndc3b對MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞遷移能力的影響

圖4 Western blotting檢測CircFndc3b對MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞E-cadherin和N-cadherin表達的影響

圖5 CircFndc3b靶點預(yù)測及初步驗證

3 討論

CircFndc3b是一種侵襲相關(guān)的circRNA,并且其參與惡性腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學(xué)過程[9-10]。Luo等[11]研究發(fā)現(xiàn)CircFndc3b促進了食管癌細胞增殖和遷移。然而Liu等[12]則發(fā)現(xiàn)侵襲相關(guān)的CircFndc3b通過miR-1178-3p/G3BP2/SRC/FAK軸抑制了膀胱癌的進展。此外,CircFndc3b調(diào)控乳腺癌細胞侵襲和遷移的作用目前尚未被完全闡明。因此,我們對CircFndc3b調(diào)控乳腺癌細胞侵襲和遷移的作用進行了探究,同時對CircFndc3b結(jié)合的miRNAs進行了預(yù)測和初步驗證,以期為乳腺癌的發(fā)病機理研究和臨床治療提供新的靶點。

首先,我們探究了CircFndc3b在乳腺癌細胞中的表達。qRT-PCR結(jié)果顯示4種人乳腺癌細胞系(MCF-7、MDA-MB-231、BT474以及BT20)中CircFndc3b表達水平均顯著高于MCF-10A人正常乳腺上皮細胞,和Hong等[8]在胃癌中的研究結(jié)果相近,表明CircFndc3b可能作為致癌基因而促進乳腺癌發(fā)展。隨后我們選取了CircFndc3b表達量較高的MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞進行CircFndc3b敲低并探究了CircFndc3b在乳腺癌細胞發(fā)生和發(fā)展中的作用。

臨床研究發(fā)現(xiàn)癌癥轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡率較高的主要原因之一[13-14]。因此,了解乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機制有助于新藥的研發(fā)以及乳腺癌患者的臨床治療。大量研究顯示circRNA的異常表達影響了腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力[15-16]。此外有研究報道顯示,提高CircFndc3b表達促進了食管癌細胞以及胃癌細胞的侵襲和遷移能力。但我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),敲低CircFndc3b表達后,MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞的侵襲細胞數(shù)量明顯減少,同時遷移的距離明顯降低,表明CircFndc3b參與了乳腺癌細胞的侵襲和遷移。進一步發(fā)現(xiàn),敲低CircFndc3b表達后,MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞E-cadherin表達明顯升高,而N-cadherin表達顯著降低,從而更加證實了上述結(jié)論。因此,檢測CircFndc3b表達水平將有助于乳腺癌患者的預(yù)后評估以及制定合理的臨床治療方案,同時對闡明乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機制具有重要意義。

研究顯示,海綿miRNAs是circRNA發(fā)揮調(diào)控作用的主要機制之一[17-18]。Liang等[19]的研究顯示circ-ABCB10通過海綿miR-1271促進乳腺癌的增殖和進展。此外,CircFndc3b也被發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)控miR-1178-3p、miR-99a等miRNAs[7,12]。而利用miRDB數(shù)據(jù)庫進行預(yù)測發(fā)現(xiàn),CircFndc3b和47個潛在的靶點miRNAs具有結(jié)合位點。進一步檢測評分最高的2種miRNAs發(fā)現(xiàn),敲低CircFndc3b表達導(dǎo)致miRNA-5702和miRNA-7106-5p表達水平顯著升高,表明CircFndc3b可能通過影響miRNAs表達而發(fā)揮促進乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用。

綜上所述,研究發(fā)現(xiàn)CircFndc3b在乳腺癌細胞中高表達,且促進了乳腺癌細胞的侵襲和遷移。CircFndc3b發(fā)揮促進乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用可能是通過調(diào)控miRNAs表達實現(xiàn)的。CircFndc3b為乳腺癌轉(zhuǎn)移、預(yù)后評估以及臨床治療提供了新的靶點。然而CircFndc3b在乳腺癌組織中的表達以及通過何種miRNAs發(fā)揮促進乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用后續(xù)仍是研究的重點。