黃樣增，張 昆，陳言枧，吳長(zhǎng)輝，姚渭溪，陳冠敏，李 曄

(1.福建仙芝樓生物科技有限公司 藥用菌栽培與深加工國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福州 350002;2.福建省疾病預(yù)防控制中心，福州 350001)

薏苡仁油是從禾本科植物薏苡(Coixlacryma-jobiL. var.ma-yuan(Roman.)Stapf)的干燥成熟種仁[1]中提取的，薏苡仁含有2%～8%的薏苡仁油。張棟霞[2]、謝春英[3]等發(fā)現(xiàn)薏苡仁油中的主要成分有薏苡內(nèi)酯(又稱薏苡素)、脂肪酸甘油酯、甾醇、角鯊烯及維生素E等，具有增強(qiáng)免疫力[4]和抗腫瘤[5]等作用，其應(yīng)用前景十分廣闊。但是，目前對(duì)于薏苡仁油的遺傳毒性報(bào)道較少，缺乏相關(guān)研究數(shù)據(jù)。遺傳毒性研究是非臨床安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，包括致突變性、致癌性、致畸性。本試驗(yàn)按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》，通過(guò)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn))、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和小鼠精子畸形試驗(yàn)對(duì)薏苡仁油的致突變性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為薏苡仁油的開發(fā)利用以及安全食用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品

薏苡仁油軟膠囊，薏苡仁按照《中國(guó)藥典》檢測(cè)合格后，采用圖1生產(chǎn)工藝流程制備薏苡仁油(密度為0.87 g/L)，直接經(jīng)壓丸后制得。藥理取薏苡仁油軟膠囊內(nèi)容物，即薏苡仁油。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

選用上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供的清潔級(jí)健康ICR小鼠200只，體重25～30 g；清潔級(jí)SD大鼠80只，體重67～85 g，雌雄各半。許可證號(hào)為SCXK(滬)2012-0002。小鼠、大鼠飼養(yǎng)于福建省疾病預(yù)防控制中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)為SYXK(閩)2012-0008。

注：超臨界CO2萃取條件為萃取壓力25 MPa、萃取溫度60℃、分離壓力6.5 MPa、分離溫度45℃、CO2流量100 L/h、萃取時(shí)間4 h。

圖1 薏苡仁油生產(chǎn)工藝流程

1.1.3 菌株

鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型菌株TA98、TA97、TA102和TA100，由福建省疾病預(yù)防控制中心贈(zèng)送(購(gòu)于復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院)，經(jīng)鑒定符合要求后再進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.4 儀器與試劑

電子天平，BSC-1360ⅡA2生物安全柜，SHP-250生化培養(yǎng)箱，DK-S28電熱恒溫水溫箱，SS-325型自動(dòng)高壓滅菌器，自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀，Olympus CH顯微鏡。

絲裂霉素C(MMC)，2，4，7-三硝基芴酮(2，4，7-TNFone)，2-氨基芴(2-AF)，1，8-二羥基蒽醌，三氮化鈉(NaN3)，二甲基亞砜(0.055 MPa，20 min滅菌)，環(huán)磷酰胺(40 mg/kg)，大豆油。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn))

釆用多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿作為體外代謝活化系統(tǒng)。稱取樣品5.0 g加二甲基亞砜至100 mL作為高劑量受試物，量取高劑量受試物20 mL加二甲基亞砜至100 mL攪拌均勻作為次高劑量受試物，以下3個(gè)劑量如此類推配制，由高到低配成5 000、1 000、200、40、8 μg/皿5個(gè)劑量，經(jīng)0.103 MPa、20 min滅菌，同時(shí)設(shè)自發(fā)回變組、陽(yáng)性對(duì)照組和溶劑(二甲基亞砜)對(duì)照組，每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)平皿。在頂層瓊脂中加入0.1 mL受試物溶液、0.1 mL測(cè)試菌株增菌液和0.5 mL S-9混合液(當(dāng)需要代謝活化時(shí))，混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上，于37℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)1次。如果樣品的回變菌落數(shù)是溶劑對(duì)照組回變菌落數(shù)2倍以上，并具有劑量反應(yīng)關(guān)系則定為試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。

1.2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

選取50只體重25～30 g健康小鼠，雌雄各半，各性別小鼠隨機(jī)按體重分成5組，每組5只。鑒于動(dòng)物、人的種屬和個(gè)體之間的生物學(xué)差異，安全系數(shù)通常為100，因此試驗(yàn)設(shè)3個(gè)劑量組為4.35、8.70、17.40 g/kg，相當(dāng)于成人推薦量的130、261、522倍，另設(shè)陽(yáng)性(環(huán)磷酰胺)對(duì)照組、溶劑(大豆油)對(duì)照組。分別稱取樣品2.5、5.0、10.0 mL各加大豆油至20 mL配成3個(gè)濃度，各組動(dòng)物分別按體重0.02 mL/g間隔24 h灌胃給予不同濃度的受試物及對(duì)照物2次，末次灌胃6 h后脫頸椎處死動(dòng)物，取胸骨骨髓用小牛血清稀釋涂片，經(jīng)甲醇固定，Giemsa染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)，微核發(fā)生率以含微核PCE率計(jì)，按χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。同時(shí)計(jì)數(shù)200個(gè)PCE，求出 PCE(嗜多染紅細(xì)胞)/NCE(正染紅細(xì)胞)值。

1.2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)

選用體重25～30 g雄性性成熟小鼠25只，隨機(jī)按體重分成5組，每組5只，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)劑量組為4.35、8.70、17.40 g/kg，相當(dāng)于成人推薦量的130、261、522倍，另設(shè)溶劑對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。分別稱取樣品2.5、50、10.0 mL各加大豆油至20 mL配成3個(gè)濃度，各組動(dòng)物分別按0.02 mL/g灌胃給予不同濃度的受試物及對(duì)照物，連續(xù)5 d。于首次灌胃后35 d，處死動(dòng)物，取雙側(cè)附睪尾按標(biāo)準(zhǔn)程序制片、染色，顯微鏡下每只動(dòng)物觀察1 000個(gè)完整精子，記錄各類畸形精子數(shù)，計(jì)算精子畸形率，按χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn))(見表1、表2)

由表1、表2可見，陽(yáng)性對(duì)照組菌株的回變菌落數(shù)均超過(guò)自發(fā)回變組和溶劑(二甲基亞砜)對(duì)照組2倍以上，而該樣品受試物各劑量組的回變菌落數(shù)均未超過(guò)溶劑對(duì)照組回變菌落數(shù)的2倍。說(shuō)明Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)(見表3)

由表3可見，該樣品各劑量組PCE(嗜多染紅細(xì)胞)/NCE(正染紅細(xì)胞)未少于溶劑對(duì)照組的20%，提示骨髓紅細(xì)胞系統(tǒng)的增殖并無(wú)明顯抑制，對(duì)嗜多染紅細(xì)胞微核的觀察無(wú)明顯影響。陽(yáng)性(環(huán)磷酰胺)對(duì)照組微核發(fā)生率明顯高于溶劑對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而樣品各劑量組與溶劑對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明該樣品未表現(xiàn)出使小鼠骨髓PCE微核率上升的致突變效應(yīng)。

表1 樣品Ames試驗(yàn)結(jié)果(第一次)

表2 樣品Ames試驗(yàn)結(jié)果(第二次)

表3 樣品小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

注：*表示與溶劑對(duì)照組相比P<0.01。下同。

3.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)(見表4)

由表4可見，陽(yáng)性(環(huán)磷酰胺)對(duì)照組與溶劑(大豆油)對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而樣品各劑量組與溶劑對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可見樣品對(duì)小鼠精子畸形率未產(chǎn)生明顯改變，提示該樣品對(duì)小鼠精子不產(chǎn)生畸變作用。

表4 樣品小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

采用反映基因突變的Ames試驗(yàn)、反映染色體損害的小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和反映生殖細(xì)胞突變的小鼠精子畸形試驗(yàn)研究薏苡仁油的致突變性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，薏苡仁油對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核無(wú)明顯增多作用，對(duì)雄性小鼠生殖細(xì)胞無(wú)遺傳損傷作用，也不具有基因致突變作用。因此，在本試驗(yàn)條件下，薏苡仁油未顯示有致突變性。試驗(yàn)表明薏苡仁油對(duì)人體無(wú)致突變作用。