姜?；?，唐 凱，張化為，姜 祎，宋小妹，黃文麗，鄧 翀

陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開發(fā)工程技術(shù)研究中心 陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室，咸陽 712046

肝臟是人體內(nèi)新陳代謝的中心站，被喻為“人體最大的化工廠”。肝損傷包括物理性肝損傷、化學(xué)性肝損傷、酒精性肝損傷、環(huán)境性肝損傷等[1]。臨床上保護(hù)肝臟的特異性藥物數(shù)量少，且易產(chǎn)生毒副反應(yīng)，而具有多成分、多靶點作用的中藥及中藥方劑對于肝損傷有一定的促進(jìn)再生和修復(fù)作用，但大多作用機(jī)制尚不十分清楚。因此探討保肝中藥治療肝損傷的多靶點、多途徑作用機(jī)制是目前的研究熱點之一。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是建立在計算機(jī)虛擬計算、高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析等技術(shù)基礎(chǔ)上，利用了生物信息學(xué)方法，研究多成分-多靶點-多疾病的整合機(jī)制，因而具有整體性和系統(tǒng)性的優(yōu)勢，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方及單味藥的作用機(jī)制研究中[2]。

南五味子為木蘭科植物華中五味子(Schisandrasphenanthera.Rehdet Wils.)的干燥成熟果實，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功效[3]，含有有木脂素、多糖、三萜、揮發(fā)油等化學(xué)成分[4]。近年來，臨床和實驗研究表明南五味子具有保肝作用[5]，其中木脂素類具有降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[6]。南五味子多糖能夠致小鼠急性肝損傷后的ALT和AST水平明顯降低，使小鼠肝臟損傷的到有效改善[7]。南五味子能夠促進(jìn)膽汁分泌，使肝內(nèi)有毒物質(zhì)加速排泄，南五味子中含有多種活性成分能夠使SOD、GSH-Px等酶的生物活性增強(qiáng)，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)生物合成、抗脂質(zhì)過氧化、促進(jìn)肝糖原生成、保護(hù)肝細(xì)胞膜等作用，同時南五味子能夠促進(jìn)肝臟解毒過程，使肝臟收到良好的保護(hù)，并能夠使受肝損傷組織再生，能夠使外界因素導(dǎo)致肝組織中不斷升高的轉(zhuǎn)氨酶有效降低[8]。但對南五味子而言究竟哪些成分都發(fā)揮保肝功效，其治療肝損傷的作用機(jī)制均不清楚。基于此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，整理南五味子活性成分、關(guān)鍵靶點、作用通路之間的關(guān)系，結(jié)合分子對接驗證的方法，探討南五味子保肝的作用機(jī)理，從而為南五味子對治療肝損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 南五味子活性成分的篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)和一些已發(fā)表的文獻(xiàn)中檢索南五味子的所有化學(xué)成分，通過OB(口服生物利用度)≥20%，DL(類藥性)≥0.1及Lipinski原則[9]篩選出活性成分。

1.2 南五味子靶點的整理

在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索活性成分對應(yīng)的2D結(jié)構(gòu)式，通過Swiss數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)進(jìn)行靶點的預(yù)測富集，將TCMSP數(shù)據(jù)庫檢測到的靶點與其整合，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)，搜索靶點的基因名，去重整合。

1.3 收集疾病相關(guān)靶點

在Genecard與OMIM中搜索關(guān)鍵詞“hepatic injury”，整合肝損傷疾病相關(guān)靶點的基因名。然后通過Venny2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)把南五味子的活性成分的預(yù)測靶點與肝損傷疾病的靶點繪制韋恩圖并取交集，整理共同的靶基因。

1.4 構(gòu)建關(guān)鍵靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)收錄了計算、實驗、文獻(xiàn)等方法的蛋白相互作用關(guān)系，是目前常用構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)庫。將上述分析取到的關(guān)鍵靶基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，選擇物種為人，得到南五味子治療肝損傷的PPI網(wǎng)絡(luò)，在構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點的大小和顏色深淺反映自由度(degree)值大小，邊粗細(xì)反映組合分?jǐn)?shù)(combine score)大小。分析PPI網(wǎng)絡(luò)，計算網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點度值，度值越大代表節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越處于核心地位。用其得到的“TSV”文件通過Cytoscape(版本3.2.1)中NetworkAnalyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.5 構(gòu)建“藥物成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)并分析

Cytoscape3.2.1(可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析軟件)是構(gòu)建與研究中藥網(wǎng)絡(luò)的常用軟件。導(dǎo)入南五味子活性成分與肝損傷相關(guān)疾病的靶點，構(gòu)建“藥物成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)。

1.6 關(guān)鍵靶點的GO分析與KEGG富集分析

使用半編程性質(zhì)的腳本軟件R project，可以用于實現(xiàn)多種生物信息分析與結(jié)果可視化。使用其生物學(xué)分析功能，對南五味子治療肝損傷的關(guān)鍵靶點進(jìn)行GO與KEGG分析，設(shè)置P<0.05，Q<0.05，其中GO分析包括生物過程(BP)、細(xì)胞成分(CC)和分子功能(MF)分析，分析結(jié)果以柱形圖的形式予以展示。

1.7 活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接驗證

將上述篩選出的南五味子的活性成分在PubChem平臺中查詢其結(jié)構(gòu)式，并通過SMILES導(dǎo)出，在DISCOVERY STUDIO軟件中打開并在Macromolecules模塊下對每個小分子進(jìn)行優(yōu)化處理，PPI網(wǎng)絡(luò)中“degree”值前20的靶點作為受體，在PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)中下載其靶點的蛋白結(jié)構(gòu)，然后導(dǎo)入DISCOVERY STUDIO軟件進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)常規(guī)預(yù)處理，接著選擇Libdock對接模塊中設(shè)定docking preference為user specified，設(shè)定minimum LibDockscore為105分，其他參數(shù)取默認(rèn)值，進(jìn)行分子對接。打分函數(shù)LibDock Score分?jǐn)?shù)越高，其對接的結(jié)合的活性越好。

2 結(jié)果

2.1 南五味子活性成分的篩選

一共整理了南五味子的化學(xué)成分共149個，經(jīng)篩選，共有31個活性成分納入研究(見表1)。

表1 南五味子的主要活性成分Table 1 Main active ingredients of Schisandra sphenanthera

2.2 收集南五味子有效活性成分的作用靶點

通過TCMSP和Swiss檢索的靶點，收錄的南五味子中成分的作用靶點共1 639個。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫收集作用靶點的基因名，刪除無效與重復(fù)靶點，共獲取南五味子有效活性成分作用靶點537個。

2.3 收集肝損傷疾病的相關(guān)基因

檢索OMIM和Genecard數(shù)據(jù)庫，整理并去重，共收集到肝損傷相關(guān)疾病靶點3 493個。將上述南五味子有效成分的作用靶點映射到其中，共獲得交集358個，見圖1，將其定義為南五味子治療肝損傷的“關(guān)鍵靶點”。

圖1 南五味子作用靶點與肝損傷相關(guān)靶點交集Fig.1 Intersection of target of S.sphenantheraand related target of hepatic injury

2.4 構(gòu)建并分析關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

將上述358個關(guān)鍵靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建成分與疾病靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，PPI網(wǎng)絡(luò)中包含節(jié)點308個，邊2 036條。將其“TSV”文件導(dǎo)入Cytoscape，構(gòu)建南五味子與肝損傷靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，并通過R語言制作柱形圖，其中展示了PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree值較高的前20位，見圖2，將其定義為“核心靶點”。選取 degree值排名前六的核心靶點：PIK3CA、APP、SRC、MAPK1、MAPK3、STAT3。其中PIK3CA(磷脂酰肌醇-3-激酶)在細(xì)胞的生長、增殖、凋亡、血管生成、自吞噬等過程中發(fā)揮著極其重要的生物學(xué)功能[10]，MAPK1與MAPK3(絲裂原活化蛋白激酶)調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長、分化、對環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理或病理過程[11]，STAT3(信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3)具有顯著的抗凋亡和促有絲分裂活性,能夠上調(diào)一系列細(xì)胞存活及增殖相關(guān)基因[12]。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)中degree值較高的靶點Fig.2 Targets with higher degree in PPI networks

2.5 構(gòu)建“藥物成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)并分析

將南五味子活性成分、關(guān)鍵靶點輸入Cytoscape軟件，構(gòu)建“藥物成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)，在網(wǎng)絡(luò)圖中，藍(lán)色圓形代表活性成分所作用的靶點，綠色棱形代表南五味子中所含有的活性成分。分析網(wǎng)絡(luò)圖，可知網(wǎng)絡(luò)圖中共包含節(jié)點(node)388個，節(jié)點與節(jié)點之間的作用關(guān)系，即邊(edge)1 267條，展示了南五味子治療肝損傷多成分、多靶點的作用。

2.6 GO生物學(xué)過程富集與KEGG通路富集分析

分析358關(guān)鍵靶點主要富集的細(xì)胞學(xué)組分、分子功能與生物學(xué)過程。主要進(jìn)行靶點在生物學(xué)過程的分析，結(jié)果顯示南五味子治療肝損傷的關(guān)鍵靶點共在2 794個GO term上富集。其中所涉及的生物信息學(xué)功能與過程包括positive regulation of MAPK cascade、response to toxic substance、peptidyl-serine phosphorylation等生物學(xué)過程密切相關(guān)。圖4展示了前20位GO分析BP的結(jié)果。

對南五味子治療肝損傷的358個關(guān)鍵靶點進(jìn)行KEGG富集分析，分析結(jié)果顯示共富集在168條通路上，其中包括Neuroactive ligand-receptor interaction、Proteoglycans in cancer、Prostate cancer、EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance、Hepatitis B、ErbB signaling pathway等信號通路。見圖5，展示了前20位KEGG通路富集分析結(jié)果。其中參與EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance通路的核心靶點有9個，分別為EGFR、PIK3CA、MAPK1、JAK2、AKT1、STAT3、MAPK3、JAK1、SRC(圖6)，在排名前五的信號通路里核心靶點存在數(shù)量最高，因此，將此信號軸作為南五味子對肝損傷治療發(fā)揮藥效的通路之一。并且PIK3CA、MAPK1、STAT3三個靶點在前10的信號通路里涉及到4個以上的信號通路，這些通路主要涉及到炎癥的發(fā)生、氧化應(yīng)激、癌細(xì)胞的抑制等生物學(xué)過程。

圖3 南五味子成分與靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Compounds-targets interaction network of S.sphenanthera

圖4 關(guān)鍵靶點的GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis for key targets

圖5 關(guān)鍵靶點的KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of key targets

圖6 EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥Fig.6 EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance

2.7 分子對接結(jié)果

將南五味子31個活性成分與導(dǎo)致肝損傷疾病重點相關(guān)的靶蛋白PIK3CA、MAPK1、STAT3做分子對接。在DISCOVERY STUDIO中對接并計算RMSD(均方根偏差)，普遍認(rèn)為RMSD≤0.2 nm時能說明此方法能較好的重現(xiàn)結(jié)合模式，對接的結(jié)果比較可靠[13]。當(dāng)對接大于105或者高于原配體的打分值時，可認(rèn)為對接有較好的結(jié)合活性，結(jié)果顯示出南五味子活性成分中有14個成分與PIK3CA有較好的的結(jié)合活性，有15個成分與MAPK1有較好的結(jié)合活性，有12個成分與STAT3有較好的結(jié)合活性。見表2。其中新南五味子酸C(neokadsuranic acid C)與PIK3CA和STAT3結(jié)合(圖7和8)，和STAT3結(jié)合五味子酯乙(interiotherin B)與MAPK1結(jié)合(圖9)其對接效果較好。

表2 分子對接結(jié)果Table 2 Molecular docking results

續(xù)表2(Continued Tab.2)

靶點名稱Target namePBD IDMOLID化合物Composition對接分?jǐn)?shù)LibDock scoreMOL009226Schisantherin J107.734MOL009228Schisantherin M116.231MOL009235Angusifolin B107.446MOL000492(+)-Catechin107.924MOL000432Linolenic acid115.775MOL000749Linoleic119.706

圖7 PIK3CA與neokadsuranic acid C對接Fig.7 The molecular docking of PIK3CA and neokadsuranic acid C

圖8 STAT3與neokadsuranic acid C對接Fig.8 The molecular docking of STAT3 and neokadsuranic acid C

3 討論

經(jīng)本次實驗文獻(xiàn)挖掘，發(fā)現(xiàn)安五脂素((+)-anwulignan)、長南酸(changnanic acid)、胡蘿卜苷(daucosterol)、亞麻酸(linolenic acid)新南五味子酸C(neokadsuranic acid C)、五味子酯乙(interiotherin B)等31種具有潛在抗肝損傷成分，其涉及到治療肝損傷的機(jī)制包含抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞纖維化、細(xì)胞凋亡等[14]。

根據(jù)KEGG通路分析表明了肝損傷的相關(guān)通路可能通過及神經(jīng)信號傳遞通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)、癌癥蛋白多糖信號通路(Proteoglycans in cancer)、前列腺癌信號通路(Prostate cancer)、EGFR酪氨酸激酶抑制和耐藥信號通路(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、乙型肝炎病毒信號通路(Hepatitis B)、ErbB信號通路(ErbB signaling pathway)等信號通路起治療作用。其中富集到EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance通路上的關(guān)鍵靶點有EGFR、PIK3CA、MAPK1、JAK2、AKT1、STAT3、MAPK3、JAK1、SRC，在排名前五的信號通路里存在數(shù)量最高，EGFR(表皮生長因子受體)屬于是受體型酪氨酸激酶(RTKs)家族的成員之一[15]，是一個巨大的跨膜糖蛋白，EGF可以刺激細(xì)胞分裂，與組織的修復(fù)和再生有關(guān)。EGF與EGFR結(jié)合，激活酪氨酸激酶區(qū)，使其磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞的分裂增殖及正常細(xì)胞的惡性突變，它在細(xì)胞的凋亡、增殖、分化、遷移和細(xì)胞周期循環(huán)發(fā)揮著十分重要的作用[16,17]。有研究表明，在肝損傷和修復(fù)過程中，ErbB1的表達(dá)升高[18]，從早期炎癥和肝細(xì)胞增殖到纖維化發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)化，EGFR信號通路在肝損傷和炎癥中都擔(dān)任著重要的角色[19]，故以此通路為切入點進(jìn)一步尋找南五味子治療肝損傷的作用靶標(biāo)。

圖9 MAPK1與interiotherin B對接Fig.9 The molecular docking of MAPK1 and interiotherin B

挖掘到潛在抗肝損傷成分的核心靶點為EGFR、PIK3CA、MAPK1、JAK2、AKT1、STAT3、MAPK3、JAK1、SRC等，其中PIK3CA、MAPK1、STAT3三個靶點在前10的信號通路里涉及到4個以上的信號通路，這些通路主要涉及到炎癥的發(fā)生、氧化應(yīng)激、癌細(xì)胞的抑制等生物學(xué)過程?；诖吮狙芯恳訮IK3CA、MAPK1、STAT3為靶點，與31個潛在抗肝損傷成分進(jìn)行分子對接分析，對其生物活性進(jìn)行預(yù)測。

機(jī)體遭受有害刺激引起活性氧簇(ROS)生成增加或從而導(dǎo)致氧化-抗氧化失衡，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)(OS)[20]。氧化應(yīng)激可激活MAPK/ERK、PI3K/Akt、JAK/STAT、Nrf2/ARE、Wnt/β-catenin 等一系列信號通路及其相關(guān)響應(yīng)因子，造成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分代謝及相關(guān)因子表達(dá)異常，從而介入骨節(jié)、心血管、肝、腎等組織器官ECM代謝異常疾病的發(fā)生發(fā)展[21,22]。另外MAPK、STAT激活的信號通路對于維持細(xì)胞的正常生理功能以及在炎癥反應(yīng)中占有重要地位，如LPS可以誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞產(chǎn)生致炎因子TNF-α、IL-1、IL-6等均與這些信號通路緊密相關(guān)[23]。表明PIK3CA、MAPK1、STAT3三個靶點與肝損傷密切相關(guān)。

通過相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建可直觀的顯示出南五味子治療肝損傷的多成分、多靶點、多途徑等共同作用的特點，符合中醫(yī)藥治療疾病的特點，相比于西藥單基因-單靶點的作用機(jī)制，優(yōu)勢明顯。本研究通過分子對接驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)靶點預(yù)測的可靠性，為后續(xù)進(jìn)一步驗證奠定了基礎(chǔ)，所得結(jié)果也與現(xiàn)有文獻(xiàn)報道高度符合，但本研究結(jié)果只是理論上的預(yù)測，藥物在體內(nèi)作用機(jī)制的確認(rèn)仍需要進(jìn)一步通過整體動物實驗的驗證。