葉廣英,章金輝,李 杰,劉海林,王再花
廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所 廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點(diǎn)實驗室,廣州 510640
糖尿病(diabetes mellitus)是當(dāng)今社會一種主要慢性疾病,一般分為Ⅰ型和Ⅱ型,后者約占90%,主要特征是高血糖[1]。長期高血糖會增加組織器官功能負(fù)擔(dān),尤其血管損傷,進(jìn)而誘發(fā)多種急慢性疾病,降低血糖是治療糖尿病的關(guān)鍵[2]。臨床降血糖藥物-胰島素類似物,磺酰脲類,雙胍類,噻唑烷酮等效果顯著,多引發(fā)副作用,開發(fā)安全可靠的降血糖藥物成為研究熱點(diǎn)[3]。
許多研究發(fā)現(xiàn)天然多糖多具降血糖活性[4]。作為治療糖尿病的中藥處方-黃芪,多糖是主要活性成分,體外研究表明黃芪多糖(APS)通過AMP-AMPK-AS160途徑刺激L6肌管對葡萄糖的攝取,降低血糖水平[5]。具有降血糖活性的中國傳統(tǒng)食補(bǔ)品枸杞,研究表明枸杞主要通過多糖來促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖和胰島素分泌達(dá)到降低血糖的效果[6]。此外,麥冬、靈芝、當(dāng)歸、人參等許多植物中的多糖也具有降血糖活性[7]。一般認(rèn)為,天然多糖主要通過促進(jìn)血漿中胰島素水平升高,胰高血糖素水平下降;提高胰島素敏感性;抑制消化系中糖苷酶活性;保護(hù)胰島細(xì)胞等機(jī)制實現(xiàn)降血糖[3]。天然多糖為降血糖藥物開發(fā)提供了豐富的資源。
石斛作為傳統(tǒng)名貴藥材和滋陰品,多糖是其主要生物活性物質(zhì)。2015版藥典將鐵皮石斛(D.officinale)、金釵石斛(D.nobile)、鼓槌石斛(D.chrysotoxum)和流蘇石斛(D.fimbriatum)四種石斛納入藥材使用[8]。研究表明,霍山石斛(D.huoshanense)多糖能有效降低糖尿病大鼠的血糖含量[9]。金釵石斛多糖對四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠降血糖效果顯著[10]。此外,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)金釵石斛、鐵皮石斛和霍山石斛多糖均能明顯降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的血糖[11]。降血糖的石斛多糖資源,具有顯著開發(fā)價值。
為尋找更為經(jīng)濟(jì)的天然多糖石斛,本課題組對多種石斛屬植物的多糖含量進(jìn)行了比較分析,發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)云南藥材-大苞鞘石斛(騰沖石斛)產(chǎn)量高,單株莖重是鐵皮石斛的3~5倍,而多糖含量與鐵皮石斛(38%,DW)相當(dāng),是優(yōu)良的多糖植物,具有潛在的開發(fā)價值[12]。本文在原有研究基礎(chǔ)上,對大苞鞘石斛多糖的化學(xué)特征和降血糖活性進(jìn)行分析,并與傳統(tǒng)的鐵皮石斛和金釵石斛進(jìn)行比較,為其降血糖多糖的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
試驗材料為大苞鞘石斛(D.wardianumWarner)、鐵皮石斛(D.officinaleKimura et Migo)和金釵石斛(D.nobileLindl.)。鐵皮石斛由云南野生鐵皮石斛經(jīng)廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所組培繁育而來;大苞鞘石斛和金釵石斛采于云南,栽培于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所溫室大棚內(nèi)(均由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所徐曄春研究員鑒定)。取兩年生石斛莖,切成小段,蒸餾水洗凈,于105 ℃殺青15 min,然后降溫至60 ℃,烘干至恒重。粉碎機(jī)磨成粉末,過60目篩,保存于干燥器中備用。
實驗小鼠:90只SPF級雄性KM小鼠,8周齡,雌雄各半,體重20±2 g,由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供,實驗動物質(zhì)量合格證編號:SCXK(粵)2019-0035。所有動物均飼養(yǎng)在SPF級屏障環(huán)境IVC籠中,所有動物自由采食和飲水。
主要試驗試劑:胰蛋白酶(1∶250細(xì)胞培養(yǎng)級,250 U/mg),上海伯奧生物科技有限公司;透析袋(截留分子量為7.0 kDa),威佳生物科技有限公司美國進(jìn)口分裝;Cellulose-DEAE-52,北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司;核糖(ribose,SH-B21897-100mg)、鼠李糖(rhamnose, BW1833-20mg)、阿拉伯糖(arabinose,SH-B21891-100mg)、木糖(xylose,BW1831-20mg)、甘露糖(mannose,BW1745-20mg)、葡萄糖(glucose,BW1731-100mg)、半乳糖(galactose,SH-B21893-100mg)等單糖標(biāo)準(zhǔn)品均為中國藥檢所生產(chǎn),含量為99.0%;無水乙醇、正丁醇、石油醚(沸點(diǎn)60~90 ℃)、丙酮、葡萄糖及其它試劑均為分析純。透析袋(截留相對分子量為7.0 kDa),威佳生物科技有限公司美國進(jìn)口分裝。填料DEAE-52纖維素葡聚糖凝膠Sephadex-100購于sigma公司。
BAO-150A鼓風(fēng)干燥箱(施都凱儀器設(shè)備有限公司);冷凍干燥機(jī)(VIRTIS Freeze mobile 25 L,美國Long Island Scientific 公司);RE-52 AAB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海嘉鵬科技有限公司);SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠);離心機(jī),5415D型(德國Eppendorf公司);SBS-100 數(shù)控計滴自動部分收集器(上海滬西分析儀器廠);UV-2405 型紫外可見分光光度計(日本島津公司);氣相質(zhì)譜儀(HP6890GC/HP5973iMSD,安捷倫公司);液相色譜儀(安捷倫G1311C)。
1.4.1 多糖的提取與純化
粗多糖提取[13]:樣品粉末,料液比(1∶10),用石油醚(沸程60~90 ℃)80 ℃索氏回流提取1 h,回收溶劑后,提取殘渣并揮干溶劑;然后所得濾渣再加80 %的乙醇水溶液(料液比1∶10)80 ℃回流提取1 h,減壓抽濾的濾渣,揮干溶劑,得脫脂干粉;脫脂干粉再用蒸餾水(料液比1∶10),80 ℃提取2 h,減壓抽濾,收集濾液;最后減壓濃縮至原體積1/20后,加入8倍濃縮液體積的預(yù)冷無水乙醇,4 ℃靜置過夜,12 000 rpm離心,收集沉淀得石斛粗多糖DCPs(大苞鞘石斛粗多糖DWCP、鐵皮石斛粗多糖DOCP和金釵石斛粗多糖DNCP)。
精多糖制備:將1.0 g粗多糖溶于25 mL蒸餾水中,按Sevag法去除蛋白[14],胰蛋白酶250 U/g粗多糖樣品,30 ℃酶解5 h后,90 ℃滅活15 min,冷卻后加1/3體積的Sevag溶液(氯仿:正丁醇體積比為4∶1)振蕩10 min,靜置,收集上層水相。然后,裝入透析袋(截留分子量為7.0 kDa)中,蒸餾水透析24 h。再加4倍體積預(yù)冷無水乙醇,4 ℃靜置過夜,12 000 rpm離心,收集沉淀,凍干得石斛精多糖DPPs(大苞鞘石斛精多糖DWPP、鐵皮石斛精多糖DOPP和金釵石斛精多糖DNPP)。
精多糖分級:精多糖溶于10倍的蒸餾水中,上樣量6.0 mL;用DEAE-52柱層析(2.6 cm×50 cm)的NaCl梯度洗脫去除陰離子雜質(zhì)(以硫酸顯色法測定洗脫管中多糖含量,合并后凍干)。然后,再將所得多糖溶于10倍的蒸餾水中,上樣量6.0 mL,用Sephadex-100柱層析(2.6 cm×50 cm)水洗進(jìn)一步純化(以硫酸顯色法測定洗脫管中多糖含量,合并后凍干),得石斛水溶性多糖DPPs-I(大苞鞘石斛水溶性多糖DWPP-I、鐵皮石斛水溶性多糖DOPP-I和金釵石斛水溶性多糖DNPP-I)。
1.4.2 多糖的分子量測定
采用凝膠滲透色譜法(gel permeation chromatography,GPC)測定多糖分子量的大小[15]。
GPC條件:色譜柱為TSK SWXL 4000-3000(2柱串聯(lián)),(8 mm,7.8×300 mm),柱溫35 ℃;流動相為0.05 mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH 6.7,加0.05% NaN3);流速為0.5 mL/min;示差折光檢測器1260RID(安捷倫),恒溫35 ℃;進(jìn)樣量為20 μL,用安捷倫GPC分析模塊B.01.01進(jìn)行分析。
多糖分子量測定:取已知相對分子質(zhì)量為738、5 800、1.22×104、2.37×104,4.8×104、1.0×105、1.86×105、3.8×105的多糖標(biāo)樣,用0.05 mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH6.7,加0.05% NaN3)溶解,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,進(jìn)行GPC分析。樣品保留值RT或Ve與其分子量M存在著對應(yīng)的函數(shù)關(guān)系即logM = A+BRT(Ve),式中A,B為常數(shù)。然后被測樣在相同條件下測出RT(Ve)值,計算出分子量。
1.4.3 多糖的單糖組成分析
單糖組成分析[16]。分別稱取10.0 mg三種石斛DPPs和DPPs-I樣品于水解管中,加2.0 mL的2 mol/L H2SO4溶液中水解,然后用飽和Ba(OH)2溶液中和,過濾后的清液蒸干水分。將水解樣品轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中,氮?dú)獗Wo(hù),加25 mg NaBH4,加入3 mL雙蒸水充分溶后,室溫避光還原過夜。加乙酸使其pH值為5,減壓蒸干后,再加入甲醇減壓蒸干,使NaBH4徹底除去。凍干后加入1 mL 吡啶和5 mg 鹽酸羥胺,密封,90 ℃水浴反應(yīng)30 min。取出冷卻至室溫,加入0.5 mL 醋酸酐,90 ℃繼續(xù)反應(yīng)30 min 進(jìn)行乙?;?,冷卻至室溫,0.22 μm 有機(jī)膜過濾后,得衍生化產(chǎn)物。各種單糖標(biāo)樣同上進(jìn)行乙?;?/p>
GC-MS測定條件:儀器為HP6890GC/HP5973iMSD氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀,具體的GC分析條件為:色譜柱:OV-1(0.25 μm,15 m ×0.20 mm);柱溫:起始溫度80 ℃,保持1 min,以10 ℃/min的升溫速率升至250 ℃;進(jìn)樣口溫度250 ℃,載氣He,流速0.6 mL/min,進(jìn)樣量0.2 μL;MS條件:EI離子源,電子能量70 eV,掃描范圍29~450 u,四極桿溫度150 ℃,離子源溫度230 ℃,電子倍增器電壓1 500 V,GC/MS接口溫度280 ℃。
1.4.4 多糖的降血糖活性分析
糖尿病動物模型建立[17]:KM小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,禁食12 h,正常飲水,稱取體重,腹腔注射1%四氧嘧啶300 mg/kg,72 h后尾靜脈取血,測空腹血糖,選擇血糖值大于15 mmol/L的小鼠為糖尿病模型鼠。
動物分組及其處理:把模型鼠隨機(jī)分成模型組(M-CK)、陽性藥物治療組(P-CK)、多糖組(大苞鞘石斛DWPP,DWPP-I;鐵皮石斛DOPP,DOPP-I;金釵石斛DNPP,DNPP-I),每組10只。正常組(CK)為未注射四氧嘧啶,模型組為注射四氧嘧啶的糖尿病模型小鼠,陽性藥物資料組為糖尿病模型小鼠20 mg/kg的阿卡波糖溶液灌胃;已有研究表明鐵皮石斛多糖具有降血糖活性的給藥濃度為200 mg/kg,金釵石斛多糖則為500 mg/kg,因此為比較三種多糖的降血糖效果的多糖組,采用每天給予(灌胃)300 mg/kg的多糖給藥濃度[15,16],正常組和模型組則用相同體積的生理鹽水進(jìn)行灌胃處理。試驗中,飼料和飲水中不給予胰島素和任何降血糖的藥物。試驗周期為4周。
血糖測定方法:于各組試驗動物灌胃2周和4周,每組小鼠尾靜脈取血,血糖儀測定空腹血糖。
1.4.5 計算分析
所有數(shù)據(jù)由平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用Origin 9.0進(jìn)行作圖,IBM SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,Duncan多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗(P<0.05)。
通過提取,獲得大苞鞘石斛、鐵皮石斛和金釵石斛的粗多糖,簡稱DCPs,分別命名為DWCP、DOCP和DNCP。通過Sevag除蛋白法獲得精多糖,簡稱DPPs,分別命名為DWPP、DOPP和DNPP。再經(jīng)DEAE-52柱層析水洗純化和Sephadex-100柱層析進(jìn)一步分級純化得石斛水溶性多糖,簡稱DPPs-I,分別命名為DWPP-I、DOPP-I和DNPP-I。
表1 三種石斛多糖的得率Table 1 Comparison of the polysaccharide yields from three Dendrobium species
注:得率為初始石斛干粉(DW)的百分比;abc表示三種不同石斛多糖得率間的差異顯著性(P<0.05)。
Note:The yield is the percentage of the initialDendrobiumdry powder (DW);abcindicate significant differences of different polysaccharide yields within threeDendrobiumspecies (P<0.05).
由表1可知,大苞鞘石斛粗多糖和精多糖得率是最高,顯著高于鐵皮石斛和金釵石斛,其中大苞鞘石斛粗多糖得率達(dá)到24.3 %,為鐵皮石斛的1.35倍,金釵石斛的2.67倍。大苞鞘石斛精多糖得率為14.1 %,則是鐵皮石斛的1.5倍,金釵石斛的3.42倍。100 g大苞鞘石斛干粉可得精多糖14.12 g,顯著高于鐵皮石斛和金釵石斛,說明大苞鞘石斛多糖產(chǎn)量更高,開發(fā)潛力更大。
分子量是影響天然多糖活性的重要特征數(shù)據(jù)[4],通過GPC方法,用多糖標(biāo)準(zhǔn)品校正后對所得多糖組分進(jìn)行分析,精多糖和水洗精多糖的凝膠色譜圖通過計算機(jī)程序擬合計算得DPPs和DPPs-I的數(shù)均分子量和重均分子量,DPPs數(shù)均分子量和重均分子量的范圍分別為14.0~22.2和24.1~76.9 kDa,分布寬度指數(shù)D在1.73~3.46之間(表2)。從數(shù)均分子量上看,DOPP(22.2 kDa)和DNPP(22.2 kDa)一致,而DWPP(14.0 kDa)最小。從重均分子量上看,所有精多糖的重均分子量(Mw)均高于數(shù)均分子量(Mn);其趨勢與數(shù)均分子量基本一致,DNPP(76.9 kDa)最高,其次為DOPP(42.5 kDa),最低為DWPP(24.1 kDa);就分布寬度而言,DNPP(3.46)最高,DWPP(1.73)最低。與DPPs 相比,DPPs-I數(shù)均分子量和重均分子量較低,分別為4.55~13.1和12.0~26.4 kDa,分布寬度指數(shù)D在2.01~3.46之間(表2)。從數(shù)均分子量上看,DOPP-I(13.1 kDa)最大,其次為DWPP-I(4.69 kDa),DNPP-I(4.55 kDa)最低;從重均分子量上看,所有多糖組分的重均分子量均高于數(shù)均分子量,其趨勢與數(shù)均分子量基本一致,DOPP-I(26.4 kDa)和DWPP-I(13.8 kDa),最低為DNPP-I (12.0 kDa);就分布寬度而言,DWPP-I(2.94)最高,DOPP-I(2.01)最低,彼此間相差不大,且數(shù)值較小,分子分布較為均一。通過比較表明大苞鞘石斛多糖的分子量更小,與報道中的活性多糖分子大小接近[18]。
表2 三種石斛多糖的分子量及其分布Table 2 The molecular weight and distribution of polysaccharides of three Dendrobium species
單糖是多糖的基本單位,單糖組成是多糖的重要化學(xué)特性,對生物活性有著重要的影響[19]。通過衍生的GC-MS方法,測定了多糖中單糖的組成,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)單糖的峰面積算出各種單糖的占比(表3)。大苞鞘石斛的DPPs和DPPs-I單糖組成中,甘露糖和葡萄糖為主要單糖,鐵皮石斛和金釵石斛多糖的單糖組成也以甘露糖和葡萄糖為主。藥典中甘露糖含量是鐵皮石斛的重要指標(biāo),通過比較,大苞鞘石斛多糖的甘露糖含量在75%~80%之間,與鐵皮石斛多糖相似;尤其兩者水溶性精多糖的甘露糖含量基本一致。金釵石斛多糖的甘露糖占比相對較低,其精多糖和水溶性精多糖的甘露糖組成均低于70%,低于大苞鞘石斛多糖和鐵皮石斛多糖。通過單糖組成分析,結(jié)果表明大苞鞘石斛多糖的在甘露糖含量、甘露糖/葡萄糖比例方面,與鐵皮石斛多糖更接近。
表3 石斛多糖的單糖組成及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)Table 3 The monosaccharide composition and mass fraction of three Dendrobium polysaccharides (%)
從多糖分子量和單糖組成上看,大苞鞘石斛多糖與鐵皮石斛多糖相近,為進(jìn)一步比較在降血糖活性方面的差異,本文以四氧嘧啶誘導(dǎo)的高血糖小鼠為模型,對三種石斛多糖的降血糖進(jìn)行比較,結(jié)果如圖1。
圖1 石斛多糖對小鼠血糖的影響 Fig.1 Effects of Dendrobium polysaccharides on mice blood glucose level注:A:大苞鞘石斛多糖;B:鐵皮石斛多糖;C:金釵石斛多糖;D:三種石斛水溶性多糖的降血糖效果比較。CK是正常組,M-CK是模型組,P-CK是陽性對照;圖A、B和C中不同小寫字母表示同組內(nèi)不同處理時間的差異顯著性(P<0.05),圖D中不同小寫字母表示同一處理時間內(nèi)不同處理間的差異顯著性(P<0.05)。Note:A:The polysaccharides from D. wardianum; B:The polysaccharides from D. officinale;C:The polysaccharides from D. nobile;D:Hypoglycemic effects of three water-soluble polysaccharides.CK was normal group,M-CK was control group,P-CK was positive control.In figure A,B and C,different lowercase letters indicate significant differences in different treatment times.within the same group (P<0.05).In figure D,different lowercase letters indicate significant differences in different treatment group within the same time (P<0.05).
由圖1中可以看出,與正常組(CK)相比,試驗各組小鼠初始血糖水平顯著升高(P<0.05),說明糖尿病模型建立成功。分別給藥 2周和4周后,和模型組(M-CK)相比,陽性對照組(P-CK)及石斛多糖組均能顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖水平。在給藥2周后,石斛多糖的降血糖作用要顯著低于陽性對照組(14.64 mmol/L);在給藥4周后,除了大苞鞘石斛(6.5 mmol/L)多糖與陽性對照組(6.34 mmol/L)在降血糖作用方面沒有顯著差異,其它石斛多糖的降血糖作用都要顯著小于陽性對照組(圖1D)。大苞鞘石斛多糖方面,在給藥2周后,DWPP(17.44 mmol/L)、DWPP-I(16.46 mmol/L)在降血糖方面沒有顯著差異;在給藥4周后,DWPP-I(6.50 mmol/L)降血糖作用要顯著高于DWPP(8.00 mmol/L)。鐵皮石斛多糖方面,給藥2周后,DOPP-I(16.90 mmol/L)的降血糖作用與DOPP(17.80 mmol/L)無顯著差異;給藥4周后,DOPP(8.08 mmol/L)和DOPP-I(7.68 mmol/L)的降血糖效果無顯著差異,并低于陽性對照。金釵石斛多糖方面,在給藥2周后,在降血糖作用方面DNPP-I(15.78 mmol/L)>DNPP(16.98 mmol/L),具有顯著差異性;在給藥4周后,在降血糖作用方面DNPP-I(7.80 mmol/L)>DNPP(8.84 mmol/L),具有顯著性差異。從給藥4周的降血糖效果上看,大苞鞘石斛多糖與陽性對照相近,好于金釵石斛多糖和鐵皮石斛多糖(圖1-D)。
多糖是石斛類中藥材的主要藥效成分[8],與藥典中的鐵皮石斛和金釵石斛同屬同組的大苞鞘石斛,通過比較表明其精多糖得率是鐵皮石斛的1.5倍,金釵石斛的3.42倍,而多糖含量與鐵皮石斛相當(dāng),可見開發(fā)潛力大。在活性多糖的構(gòu)效關(guān)系中,分子量和單糖組成是影響多糖生物活性的2個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)信息;分子的大小是多糖具備生物活性的必要條件,是多糖形成高級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ),一般認(rèn)為多糖的分子量大小多與免疫活性有關(guān),大苞鞘石斛多糖的分子量均小于鐵皮石斛和金釵石斛,但是仍在已報道的降血糖植物多糖的3.2 ~59 kDa之間[20]。天然多糖的抗氧化活性多由單糖組成決定,多糖的抗氧化活性則是降血糖中的一種作用機(jī)理;大苞鞘石斛多糖的單糖組成與鐵皮石斛多糖基本一致,其中甘露糖的含量均達(dá)到75%以上,這與藥典中以甘露糖含量作為衡量鐵皮石斛有效成分標(biāo)準(zhǔn)是一致的[8]。通過比較,在分子量和單糖組成方面,大苞鞘石斛多糖更接近于鐵皮石斛。
本研究以四氧嘧啶誘導(dǎo)的高血糖小鼠為模型,發(fā)現(xiàn)大苞鞘石斛、鐵皮石斛和金釵石斛的多糖均具有降血糖活性,給藥2周后的血糖降低效果與報道的鐵皮石斛、霍山石斛、金釵石斛等給藥12天的效果基本一致[11],但顯著低于陽性藥物對照,而給藥4周后,大苞鞘石斛多糖的降血糖效果顯著優(yōu)于與鐵皮石斛多糖和金釵石斛多糖,且在給藥4周的效果比較,且與陽性藥物對照差異不顯著。
本文通過大苞鞘石斛多糖與鐵皮石斛、金釵石斛多糖的比較研究,發(fā)現(xiàn)大苞鞘石斛多糖得率顯著高于后兩者,多糖的分子量相對較低,但單糖組成與鐵皮石斛一致。除具較高生物量外,大苞鞘石斛多糖在給藥4周后的降血糖活性顯著優(yōu)于鐵皮石斛和金釵石斛,可作為鐵皮石斛多糖的潛在替代品。此外,大苞鞘石斛莖粗且長,可作優(yōu)良的親本,為降血糖的石斛多糖資源開發(fā)提供育種資源。