王 林，李煥勇，梁 妮，陳能花

1暨南大學(xué)分析測試中心，廣州 510632；2珠海市斗門區(qū)新盈中等職業(yè)學(xué)校，珠海 519100；3暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所，廣州 510632

闊鱗鱗毛蕨Dryopterischampionii(Benth.) C.Chr.為鱗毛蕨科(Dryopteridaceae)鱗毛蕨屬(Dryopteris)植物，廣泛分布于我國山東、江蘇、浙江、江西、福建、河南、湖南、湖北、廣東、香港、廣西、四川、貴州、云南、西藏等地，日本、朝鮮也有分布[1]。該植物作為中藥資源被收錄于《中國中藥資源志要》，具有清熱解毒、止咳平喘的功效，可用于治療感冒、氣喘、便血、燒燙傷等病癥[2]?，F(xiàn)代研究顯示，闊鱗鱗毛蕨中主要含有間苯三酚、脂肪酸、甾醇等化學(xué)成分，其中間苯三酚是其特征性成分，并對多種腫瘤細(xì)胞顯示出較強(qiáng)的抑制活性[2,3]。前期本課題組對該植物95%乙醇提取物的石油醚萃取部位進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)其中部分間苯三酚化合物表現(xiàn)出顯著的抑菌活性[4,5]。為了進(jìn)一步研究分析闊鱗鱗毛蕨的化學(xué)成分，尋找活性成分，本實驗對闊鱗鱗毛蕨95%乙醇提取物中的乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行了研究。

1 儀器與材料

Bruker AV-500/400型核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司)；JASCO P 2000旋光儀(日本JASCO公司)；Agilent 6210 LC/MSD TOF高分辨質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；Shimadzu LC-20AD型分析型高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；Shimadzu LC-20AP型制備型高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；EYALA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYALA公司)。

柱層析材料：硅膠(80～100,200～300目，青島海洋化工廠)、ODS(Merck公司)、Sephadex LH-20(Pharmacia公司)；硅膠GF254薄層預(yù)制板(煙臺化學(xué)工業(yè)研究所)；分析和制備高效液相所用試劑為色譜級；其他均為分析純。

實驗所用藥材闊鱗鱗毛蕨(地上部分)于2014年4月采自貴州省貴陽市，經(jīng)暨南大學(xué)藥學(xué)院周光雄教授鑒定為鱗毛蕨科鱗毛蕨屬植物闊鱗鱗毛蕨Dryopterischampionii的地上部分，藥材標(biāo)本(No.2014041705)存于暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所。

2 提取與分離

取干燥闊鱗鱗毛蕨地上部分藥材(10 kg)，充分粉碎，經(jīng)95%乙醇于室溫下浸漬提取4次，合并所得提取液，減壓濃縮得粗提物(1.12 kg)。將所得粗提物加適量水進(jìn)行混懸，并依次用體積比約3∶1的石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，分別減壓回收得石油醚(0.25 kg)、乙酸乙酯(0.35 kg)萃取部位。取乙酸乙酯萃取部位浸膏進(jìn)行硅膠柱層析(200～300目)，以石油醚-乙酸乙酯為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫(100∶0→0∶100)，經(jīng)TLC檢測分析合并后得14個餾分(Fr.1～Fr.14)。其中餾分Fr.6～Fr.7分別經(jīng)Sephadex LH-20柱層析(100%甲醇)純化得到子餾分(Fr.6-S1～Fr.6-S8，F(xiàn)r.7-S1～Fr.7-S10)。純化后的子餾分Fr.6-S6經(jīng)制備型高效液相[甲醇-水(0.1%乙酸)=53∶47]得到化合物3(6.0 mg)，4(5.6 mg)，6(5.2 mg)和7(8.5 mg)；Fr.7-S4經(jīng)制備型高效液相[甲醇-水(0.1%乙酸)=53∶47]得到化合物2(10.0 mg)和5(11.2 mg)。餾分Fr.9和Fr.10分別通過ODS柱層析并以甲醇-水(20∶80→100∶0)梯度洗脫進(jìn)行純化，得到子餾分(Fr.9-O1～Fr.9-O17，F(xiàn)r.10-O1～Fr.10-O15)。純化后的子餾分Fr.9-O3通過制備型高效液相[甲醇-水(0.1%乙酸)=30∶70]分離得到化合物1(16.2 mg)；子餾分Fr.9-O7通過制備型高效液相[甲醇-水(0.1%乙酸)=35∶65]得到化合物13(13.2 mg)；Fr.9-O13通過制備型高效液相[甲醇-水(0.1%乙酸)=40∶60]得到化合物8(10.8 mg)和9(11.3 mg)；Fr.10-O10通過制備型高效液相[甲醇-水(0.1%乙酸)=39∶61]分離得到化合物10(9.2 mg)和11(8.8 mg)；Fr.10-O13通過制備型高效液相[甲醇-水(0.1%乙酸)=40∶60]分離得到化合物12(6.5 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物2黃色粉末；HR-ESI-MS：m/z309.037 2[M+Na]+(calcd for C15H10O6Na，309.037 0)；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.30(2H，overlapped，H-2′，6′)，6.87(1H，d，J=8.1 Hz，H-5′)，6.45(1H，s，H-3)，6.37(1H，d，J=1.9 Hz，H-8)，6.16(1H，d，J=1.9 Hz，H-6)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：165.9(C-2)，103.8(C-3)，183.7(C-4)，163.1(C-5)，100.1(C-6)，166.2(C-7)，95.0(C-8)，159.3(C-9)，105.2(C-10)，123.6(C-1′)，114.1(C-2′)，146.9(C-3′)，150.9(C-4′)，116.7(C-5′)，120.2(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報道數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為木犀草素。

化合物3黃色粉末；HR-ESI-MS：m/z273.076 7[M+H]+(calcd for C15H13O5，273.075 7)；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.31(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.82(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，5.90(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，5.88(1H，J=2.1 Hz，H-8)，5.35(1H，dd，J=13.0，3.0 Hz，H-2)，3.15(1H，dd，J=17.1，13.0 Hz，H-3a)，2.72(1H，dd，J=17.1，3.0 Hz，H-3b)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：80.5(C-2)，44.0(C-3)，197.8(C-4)，164.9(C-5)，97.1(C-6)，168.4(C-7)，96.2(C-8)，165.4(C-9)，103.3(C-10)，131.1(C-1′)，129.0(C-2′，6′)，116.3(C-3′，5′)，159.0(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報道數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為柚皮素。

化合物4黃色粉末；HR-ESI-MS：m/z289.070 8[M+H]+(calcd for C15H13O6，289.070 7)；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.92(1H，s，H-2′)，6.79(2H，s，H-5′，6′)，5.90(1H，d，J=1.8 Hz，H-6)，5.88(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，5.29(1H，dd，J=12.8，3.0 Hz，H-2)，3.10(1H，dd，J=17.1，12.8 Hz，H-3a)，2.72(1H，dd，J=17.1，3.0 Hz，H-3b)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：80.5(C-2)，44.1(C-3)，197.7(C-4)，165.5(C-5)，97.0(C-6)，168.5(C-7)，96.2(C-8)，164.8(C-9)，103.3(C-10)，131.8(C-1′)，114.7(C-2′)，146.5(C-3′)，146.9(C-4′)，116.2(C-5′)，119.2(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報道數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為圣草酚。

化合物5黃色粉末；HR-ESI-MS：m/z303.050 2[M+H]+(calcd for C15H11O7，303.049 9)；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.68(1H，d，J=2.2 Hz，H-2′)，7.55(1H，dd，J=8.4，2.2 Hz，H-6′)，6.88(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.41(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.19(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：146.8(C-2)，135.8(C-3)，175.9 (C-4)，156.2(C-5)，98.2(C-6)，163.9(C-7)，93.4(C-8)，160.8(C-9)，103.1(C-10)，122.0(C-1′)，115.1(C-2′)，145.1(C-3′)，147.7(C-4′)，115.6(C-5′)，120.0(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報道數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為槲皮素。

化合物6黃色粉末；HR-ESI-MS：m/z271.061 2[M+H]+(calcd for C15H11O5，271.060 1)；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.86(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，6.94(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，6.59(1H，s，H-3)，6.46(1H，br s，H-8)，6.21(1H，br s，H-6)；13C NMR (125 MHz，CD3OD)δ：166.3(C-2)，103.8(C-3)，183.9(C-4)，163.3(C-5)，100.2(C-6)，166.1(C-7)，95.1(C-8)，159.4(C-9)，105.3(C-10)，123.3(C-1′)，129.4(C-2′，6′)，117.0(C-3′，5′)，162.8(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報道數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為芹菜素。

化合物7黃色粉末；HR-ESI-MS：m/z309.038 5[M+Na]+(calcd for C15H10O6Na，309.037 0)；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.09(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.91(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，6.39(1H，br s，H-8)，6.18(1H，br s，H-6)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：148.0(C-2)，137.2(C-3)，177.4(C-4)，162.5(C-5)，99.3(C-6)，165.7(C-7)，94.5(C-8)，158.3(C-9)，104.5(C-10)，123.8(C-1′)，130.7(C-2′，6′)，116.3 (C-3′，5′)，160.5(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報道數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為山奈酚。

化合物8黃色粉末；HR-ESI-MS：m/z431.113 6[M+H]+(calcd for C21H21O11，431.112 9)；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.07(2H，d，J=8.9 Hz，H-2′，6′)，6.90(2H，d，J=8.9 Hz，H-3′，5′)，6.41(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.21(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，5.26(1H，d，J=7.5 Hz，H-1″)，3.71(1H，dd，J=11.8，2.3 Hz，H-6″a)，3.55(1H，dd，J=11.8，5.5 Hz，H-6″b)，3.43(2H，m，H-4″，5″)，3.20(2H，m，H-2″，3″)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：159.1(C-2)，135.5(C-3)，179.5(C-4)，163.1(C-5)，99.9(C-6)，166.1(C-7)，94.8(C-8)，158.5(C-9)，105.7(C-10)，122.8(C-1′)，132.3(C-2′,6′)，116.1(C-3′，5′)，161.6(C-4′)，104.1(C-1″)，75.7(C-2″)，78.1(C-3″)，71.4(C-4″)，78.4(C-5″)，62.6(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為黃芪苷。

化合物9黃色粉末；HR-ESI-MS：m/z457.074 4[M+Na]+(calcd for C20H18O11Na，457.074 1)；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.53(1H，d，J=2.1 Hz，H-2′)，7.51(1H，dd，J=8.4，2.1 Hz，H-6′)，6.91(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.40(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，6.21(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，5.47(1H，s，H-l″)，4.34(1H，dd，J=3.0，0.7 Hz，H-2″)，3.92(1H，dd，J=5.2，3.0 Hz，H-3″)，3.87(1H，m，H-4″)，3.50(2H，m，H-5″)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：159.4(C-2)，134.9(C-3)，180.0(C-4)，163.1(C-5)，99.9(C-6)，166.1(C-7)，94.8(C-8)，158.6(C-9)，105.6(C-10)，123.0(C-l′)，116.4(C-2′)，146.4(C-3′)，149.9(C-4′)，116.8(C-5′)，123.1(C-6′)，109.5(C-l″)，83.3(C-2″)，78.7(C-3″)，88.0(C-4″)，62.5(C-5″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為廣寄生苷。

化合物10黃色粉末；HR-ESI-MS：m/z487.085 7[M+Na]+(calcd for C21H20O12Na，487.084 7)；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.57(2H，overlapped，H-2′，6′)，6.85(1H，d，J=8.9 Hz，H-5′)，6.40(1H，br s，H-8)，6.20(1H，br s，H-6)，5.47(1H，d，J=7.0 Hz，H-1″)，3.57(2H，overlapped，H-6″)，3.22(2H，overlapped，H-2″，3″)，3.08(2H，overlapped，H-4″，5″)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：156.3(C-2)，133.3(C-3)，177.4(C-4)，161.2(C-5)，98.7(C-6)，164.1(C-7)，93.5(C-8)，156.2(C-9)，104.0(C-10)，121.6(C-1′)，115.2(C-2′)，144.8(C-3′)，148.5(C-4′)，116.2(C-5′)，121.2(C-6′)，100.8 (C-1″)，74.1(C-2″)，76.5(C-3″)，69.9(C-4″)，77.6(C-5″)，61.0(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報道數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物11黃色粉末；HR-ESI-MS：m/z431.112 7[M+H]+(calcd for C21H21O10，431.112 9)；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：8.04(2H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′)，6.90(2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′)，6.78(1H，s，H-3)，6.28(1H，s，H-6)，5.01(1H，d，J=4.2 Hz，H-1′′)，3.80(2H，m，H-6′′)，3.53(1H，m，H-2′′)，3.39(1H，overlapped，H-4′′)，3.26(2H，overlapped，H-3′′，5′′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：164.0(C-2)，102.5(C-3)，182.1(C-4)，160.4(C-5)，98.2(C-6)，162.6(C-7)，104.6(C-8)，156.0(C-9)，104.1(C-10)，121.6(C-1′)，129.0(C-2′，C-6′)，115.8(C-3′，C-5′)，161.2(C-4′)，73.4(C-1″)，70.9(C-2″)，78.7(C-3″)，70.6(C-4″)，81.9(C-5″)，61.3(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報道數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為牡荊素。

化合物12黃色粉末；HR-ESI-MS：m/z433.114 5[M+H]+(calcd for C21H21O10，431.112 9)；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.97(2H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′)，6.95(2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′)，6.87(1H，s，H-3)，6.83(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.45(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，5.40(1H，d，J=5.0 Hz，H-1′′)，3.73(1H，dd，J=10.5，5.0 Hz，H-6′′a)，3.47(2H，overlapped，H-2′′，6′′b)，3.26(1H，overlapped，H-4′′)，3.19(2H，overlapped，H-3′′，5′′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：163.0(C-2)，103.1(C-3)，182.0(C-4)，156.9(C-5)，99.5(C-6)，164.3(C-7)，94.8(C-8)，161.1(C-9)，105.3(C-10)，121.0(C-1′)，128.6(C-2′，6′)，116.0(C-3′，5′)，161.4(C-4′)，99.9(C-1′′)，73.1(C-2′′)，76.4(C-3′′)，69.5(C-4′′)，77.2(C-5′′)，60.6(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報道數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物13黃色粉末；HR-ESI-MS：m/z779.180 6[M+Na]+(calcd for C36H36O18Na，779.179 4)；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.44(1H，d，J=15.9 Hz，H-7′′′′)，7.35(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，7.24(1H，dd，J=8.4，1.8 Hz，H-6′)，7.21(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′′′′，6′′′′)，6.93(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.68(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′′′′，5′′′′)，6.16(2H，s，H-6，8)，6.06(1H，d，J=15.9 Hz，H-8′′′′)，5.74(1H，br s，H-1′′)，4.52(1H，dd，J=11.8，2.0 Hz，H-6′′′a)，4.46(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′′′)，4.39(1H，br d，J=2.2 Hz，H-2′′)，4.15(1H，dd，J=11.8，6.2 Hz，H-6′′′b)，3.92(1H，dd，J=9.8，3.0 Hz，H-3′′)，3.73(1H，m，H-5′′)，3.46(1H，m，H-5′′′)，3.40(1H，t，J=9.8 Hz，H-4′′)，3.32(3H，overlapped，H-2′′′，3′′′，4′′′)，1.09(1H，d，J=6.2 Hz，H-6′′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：158.2(C-2)，136.7(C-3)，179.5(C-4)，163.0(C-5)，99.7(C-6)，165.5(C-7)，94.8(C-8)，158.3(C-9)，105.9(C-10)，122.8(C-1′)，117.0(C-2′)，146.2(C-3′)，149.6(C-4′)，116.3(C-5′)，123.0(C-6′)，102.5(C-1′′)，83.6(C-2′′)，71.7(C-3′′)，73.5 (C-4′′)，71.9(C-5′′)，17.7(C-6′′)，107.1(C-1′′′)，75.1(C-2′′′)，77.5(C-3′′′)，71.9(C-4′′′)，75.2(C-5′′′)，64.3(C-6′′′)，126.9(C-1′′′′)，130.9(C-2′′′，6′′′′)，116.6(C-3′′′′，5′′′′)，160.9 (C-4′′′′)，146.6(C-7′′′′)，114.6(C-8′′′′)，168.9(C-9′′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報道數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為槲皮素-3-O-6-反式-對香豆?；?β-D-葡萄糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷。

4 結(jié)果與討論

本實驗對闊鱗鱗毛蕨地上部分的乙醇提取物進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，從乙酸乙酯萃取部位分離鑒定了13個黃酮類化合物，均為首次從該植物中得到。闊鱗鱗毛蕨為鱗毛蕨屬植物，被收錄于《中國中藥資源志要》，具有清熱解毒、止咳平喘的功效。目前僅有少量文獻(xiàn)報道對其化學(xué)成分的研究，且主要集中于其揮發(fā)性成分和間苯三酚類結(jié)構(gòu)，同時其藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)也主要以間苯三酚類成分作為評價指標(biāo)。本實驗通過對闊鱗鱗毛蕨極性中等的乙酸乙酯部位進(jìn)行分離純化，得到了多種黃酮類結(jié)構(gòu)，豐富了該植物的化學(xué)成分類型，同時也可為尋找新的生物活性和臨床應(yīng)用的開發(fā)提供重要的依據(jù)。

黃酮類化合物是泛指一類以兩個苯環(huán)通過中間三個碳原子連接而形成的結(jié)構(gòu)為基本母核的化合物，根據(jù)結(jié)構(gòu)中間三碳鏈的氧化程度可將其進(jìn)一步分為黃烷醇、黃酮、黃酮醇、二氫黃酮和二氫黃酮醇等[18]。該類化合物廣泛存在于自然界植物中，是多種中藥和天然藥物的活性成分之一，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎等多種藥理活性[18]。如表兒茶素結(jié)構(gòu)中存在的酚羥基，可提供氫質(zhì)子與自由基結(jié)合，形成穩(wěn)定的氫鍵，抑制自由基連鎖反應(yīng)，發(fā)揮抗氧化作用[19]；柚皮素可干擾金黃色葡萄球菌和大腸桿菌膜脂成分的變化，以及改變細(xì)胞膜的通透性，同時還能作用于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的基因組DNA，使其發(fā)生聚集，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20]；槲皮素可與流感病毒的血球凝集素相互作用從而抑制流感病毒入侵宿主細(xì)胞[21]；黃芪苷可通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、NF-κB等相關(guān)信號通路的激活，降低促炎細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)揮抗炎作用[22]。黃酮類化合物作為重要的天然有機(jī)化合物，具有多種生物活性，應(yīng)用廣泛，臨床上可被用于感染性疾病、慢性炎癥等疾病的治療，工業(yè)領(lǐng)域可被制作成營養(yǎng)粉或食療粉等保健品，還可作為天然的甜味劑和抗氧化劑等[23-25]。

鱗毛蕨科的鱗毛蕨屬為我國的蕨類大屬之一，該屬植物廣泛分布于全國各地，其最初的藥用價值主要是作為驅(qū)蟲藥使用，而隨著對該屬植物研究的不斷深入，更多的化學(xué)成分及其藥理功效被發(fā)現(xiàn)，其中較低極性的間苯三酚類成分一直被認(rèn)為是該屬植物的特征性成分及藥理活性的主要成分，而較中等極性及含量較高的常見黃酮類成分則易被忽視。因此本實驗從闊鱗鱗毛蕨研究中對具有多種顯著藥理活性的黃酮類成分的發(fā)現(xiàn)，則可促進(jìn)對該藥用植物的開發(fā)和應(yīng)用，并為其提供一定的指導(dǎo)和科學(xué)依據(jù)，使該蕨類資源能得到充分有效的利用。