李 靜，金倫喆，金洪光

1九江學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，九江 332000；2韓國圓光大學(xué)藥學(xué)院，益山 54641；3九江學(xué)院，九江 332000

炎癥是免疫防御反應(yīng)中的重要環(huán)節(jié)，也是臨床中最常見的病癥之一。多數(shù)疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中都伴隨有炎癥反應(yīng)[1]。炎癥反應(yīng)與許多慢性疾病如關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、哮喘、阿爾茨海默病、心血管疾病、癡呆、癌癥、肥胖及Ⅱ型糖尿病等密切相關(guān)[2]。小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布廣泛，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要免疫細(xì)胞，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在腦缺血、神經(jīng)退行性疾病等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用[3]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞表型發(fā)生改變并釋放一系列致炎性因子如一氧化氮(NO)，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)，前列腺素E2(PGE2)，白介素類(ILs)，腫瘤壞死因子(TNF-α)，環(huán)氧合酶-2(COX-2)等，引起炎癥反應(yīng)和組織損傷[4]。

白術(shù)根莖具有利尿、抗炎、抗腫瘤、抗衰老、止痛、調(diào)節(jié)免疫、降血糖以及抑制代謝活化酶等作用[5]。蒼術(shù)酮是白術(shù)主要提取物之一，已有研究表明蒼術(shù)酮對(duì)于LPS誘導(dǎo)的RAW264.7有顯著抗炎活性作用[6-8]。但是蒼術(shù)酮對(duì)于神經(jīng)炎性反應(yīng)影響及其機(jī)制尚無研究報(bào)道。

本研究以LPS誘導(dǎo)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2建立細(xì)胞炎癥模型，研究蒼術(shù)酮預(yù)處理對(duì)神經(jīng)炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響并探索其相關(guān)信號(hào)通路。

1 材料及方法

1.1 藥材及試劑

白術(shù)藥材(根莖生品，韓國)；BV2細(xì)胞(韓國圓光大學(xué)藥學(xué)院)；ELISA試劑盒(R&D systems，美國)；anti- iNOS、COX-2、MAPK、NF-κB抗體(Cell Signaling Tecnology，美國)；二抗(Santa Cruz Biotechnology，德國)。

1.2 蒼術(shù)酮的制備及結(jié)構(gòu)鑒定

取干燥白術(shù)根莖(生品)切片2.00 kg，甲醇回流提取2 h，共3次，合并提取液，濃縮后得總浸膏。浸膏加適量蒸餾水分散后，用正己烷萃取回收溶劑后得正己烷萃取物(8.95 g)。再經(jīng)硅膠柱色譜分離，以正己烷、正己烷-乙酸乙酯、氯仿-甲醇梯度洗脫，得到Fr.H.1～Fr.H.7共7個(gè)組分。組分Fr.H.1經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，以正己烷洗脫，得到Fr.H.1.1～Fr.H.1.6共6個(gè)組分。組分Fr.H.1.1經(jīng)硅膠柱色譜分離，以正己烷洗脫，得蒼術(shù)酮。結(jié)構(gòu)經(jīng)NMR法進(jìn)行鑒定。

1.3 細(xì)胞存活率檢測(cè)(MTT法)

BV2細(xì)胞于含有10%胎牛血清的RMPI培養(yǎng)液、37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。將BV2細(xì)胞種植于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入蒼術(shù)酮終濃度為2.5、5、10、20、40、80、160和320 μM，每組6孔，孵育24 h。細(xì)胞處理結(jié)束后，加入終濃度0.5 mg/mL MTT溶液，于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)3 h，吸除上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶液(DMSO)，室溫振蕩15 min，于590 nm處檢測(cè)吸光度值。

1.4 細(xì)胞上清液NO及PGE2、IL-6、TNF-α水平檢測(cè)

調(diào)整細(xì)胞懸液為1×105/mL，加入24孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，加入蒼術(shù)酮終濃度為10、20、40和80 μM，對(duì)照組加入等體積RMPI培養(yǎng)基，每個(gè)樣品重復(fù)三次，培養(yǎng)3 h后，除對(duì)照組外均加入LPS終濃度為1 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取上清液。Griess法檢測(cè)NO濃度，上清液加入同體積Griess reagent A及Griess reagent B 1∶1混合溶液，混勻后于540 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)所測(cè)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品NO濃度。ELISA法檢測(cè)上清液中PGE2、IL-6、TNF-α含量，按照ELISA檢測(cè)試劑盒說明書分別檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中炎癥因子水平。

1.5 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

1.5.1 COX-2、iNOS總蛋白提取方法

調(diào)整細(xì)胞懸液為1×106/mL，加入6孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，加入蒼術(shù)酮終濃度為10、20、40和80 μM，對(duì)照組加入等體積RMPI培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 h后，除對(duì)照組外加入LPS終濃度為1 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后提取蛋白，提取液為細(xì)胞裂解液。

1.5.2 MAPK、NFκB總蛋白提取方法

調(diào)整細(xì)胞懸液為1×106/mL，加入6孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，加入蒼術(shù)酮終濃度為10、20、40和80 μM，對(duì)照組加入等體積RMPI培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 h后，除對(duì)照組外加入LPS終濃度為1 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)30 min后提取蛋白，提取液為裂解液與磷酸酶抑制劑混合液比率為100∶3。

1.5.3 蛋白檢測(cè)

總蛋白上樣，應(yīng)用7.5%或12%SDS-PAGE濃縮膠及分離膠進(jìn)行垂直電泳，45V恒流90 min轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，4℃條件下與一抗溶液孵育過夜，含0.05% Tween-20 TBS溶液洗膜3次，加入二抗溶液于室溫條件下孵育1 h，洗滌后ECL顯色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 蒼術(shù)酮結(jié)構(gòu)鑒定

1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.06(1H，s，H-12)，4.88(1H，d，J=1.6 Hz，H-15b)，4.72(1H，d，J=1.6 Hz，H-15a)，2.38～2.44(4H，m，H-3β，6α，9α，9β)，2.31(1H，t，J=13.2 Hz，H-6β)，2.11(1H，dd，J=11.0，5.0 Hz，H-5α)，2.05(1H，td，J=13.2，4.0 Hz，H-3α)，1.97(3H，s，H-13)，1.62～1.72(2H，m，H-1β，2α)，1.57(1H，tt，J=13.2，3.6 Hz，H-2β)，1.52(1H，td，J=12.4，3.6 Hz，H-1α)，0.78(3H，s，H-14)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：149.9(C-4)，149.5(C-8)，137.0(C-12)，119.6(C-7)，116.2(C-11)，107.4(C-15)，45.8(C-5)，42.0(C-1)，39.4(C-9)，37.4(C-3)，36.7(C-10)，23.7(C-2)，21.0(C-6)，17.6(C-14)，8.3(C-13)。

2.2 蒼術(shù)酮對(duì)BV2細(xì)胞存活率的影響

正常對(duì)照組與蒼術(shù)酮2.5～80 μM藥物組之間細(xì)胞存活率無顯著差異，160和320 μM藥物組細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.001)。表明蒼術(shù)酮2.5～80 μM對(duì)BV2細(xì)胞生長狀態(tài)無顯著影響。結(jié)果見圖1。

圖1 蒼術(shù)酮對(duì)BV2細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of AT on cell viability注：蒼術(shù)酮給藥組與正常對(duì)照組比較，***P<0.001。Note:AT group vs control group,***P<0.001.

2.3 蒼術(shù)酮對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞NO水平及iNOS蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組相比，LPS模型組細(xì)胞上清液中的NO含量顯著增加(P<0.001)；與模型組比較，蒼術(shù)酮預(yù)處理后顯著降低細(xì)胞上清液中NO水平(P<0.01，P<0.001)。表明蒼術(shù)酮可有效抑制炎癥因子NO的釋放。同時(shí)，與正常對(duì)照組比較，LPS組iNOS蛋白表達(dá)明顯增高，蒼術(shù)酮預(yù)處理后明顯降低。結(jié)果見圖2和3。

圖2 蒼術(shù)酮對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞NO含量的影響Fig.2 Effect of AT on Nitrite level of LPS-induced注：LPS模型組與正常對(duì)照組比較，#P<0.001；給藥組與模型組比較，**P<0.01，***P<0.001。Note:LPS group vs control group,#P<0.001;AT group vs LPS model group,**P<0.01,***P<0.001.

圖3 蒼術(shù)酮對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of AT on iNOS expression of LPS-induced BV2 cells

2.4 蒼術(shù)酮對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞上清液PGE2水平及COX-2蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，LPS模型組細(xì)胞上清PGE2含量顯著增高(P<0.001)；與LPS模型組比較，蒼術(shù)酮預(yù)處理后均顯著降低細(xì)胞上清中PGE2水平(P<0.001)。同時(shí)，與正常對(duì)照組比較，LPS組COX-2蛋白表達(dá)明顯增高，蒼術(shù)酮預(yù)處理后明顯降低。結(jié)果見圖4和5。

圖4 蒼術(shù)酮對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞PGE2水平的影響Fig.4 Effect of AT on PGE2 level of注：LPS模型組與正常對(duì)照組比較，#P<0.001；給藥組與模型組比較，***P<0.001。Note:LPS group vs control group,#P<0.001;AT group vs LPS model group, ***P<0.001.

圖5 蒼術(shù)酮對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of AT on COX-2 expression of LPS-induced BV2 cells

2.5 蒼術(shù)酮對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞上清液IL-6水平的影響

與正常對(duì)照組比較，LPS模型組細(xì)胞上清液IL-6水平顯著增高(P<0.001)；與LPS模型組比較，蒼術(shù)酮預(yù)處理后顯著降低細(xì)胞上清液中IL-6水平(P<0.05，P<0.001)，表明蒼術(shù)酮可有效抑制LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞IL-6釋放。結(jié)果見圖6。

圖6 蒼術(shù)酮對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞IL-6水平的影響Fig.6 Effect of AT on IL-6 level of LPS-induced注：LPS模型組與正常對(duì)照組比較，#P<0.001；給藥組與模型組比較，*P<0.05，***P<0.001。Note:LPS group vs control group,#P<0.001;AT group vs LPS model group,*P<0.05, ***P<0.001.

2.6 蒼術(shù)酮對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞上清液TNF-α水平的影響

與正常對(duì)照組比較，LPS模型組細(xì)胞上清液TNF-α水平顯著增高(P<0.001)。與LPS模型組比較，蒼術(shù)酮預(yù)處理后均顯著降低細(xì)胞上清液中TNF-α水平(P<0.001)，表明蒼術(shù)酮可有效抑制LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞TNF-α釋放。結(jié)果見圖7。

圖7 蒼術(shù)酮對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞TNF-α水平的影響Fig.7 Effect of AT on TNF-α level of LPS-induced注：LPS模型組與正常對(duì)照組比較，#P<0.001；給藥組與模型組比較，***P<0.001。Note:LPS group vs control group,#P<0.001;AT group vs LPS model group,***P<0.001.

2.7 蒼術(shù)酮對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞蛋白MAPK表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，LPS組ERK、JNK、p38磷酸化蛋白表達(dá)均明顯增高，蒼術(shù)酮預(yù)處理后，可明顯降低JNK磷酸化蛋白表達(dá)，可明顯降低ERK磷酸化蛋白表達(dá)。然而對(duì)p38磷酸化蛋白表達(dá)無明顯影響。結(jié)果見圖8。

圖8 蒼術(shù)酮對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞MAPK蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effect of AT on MAPK expression in LPS-induced BV2 cells

2.8 蒼術(shù)酮對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞蛋白NF-κB蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核總p65磷酸化蛋白，IκB-α磷酸化蛋白表達(dá)均明顯增高，IκB-α蛋白表達(dá)明顯降低。蒼術(shù)酮預(yù)處理后可明顯降低總p65，IκB-α磷酸化蛋白表達(dá)，同時(shí)增加IκB-α總蛋白表達(dá)。結(jié)果見圖9和10。

圖9 蒼術(shù)酮對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)的影響Fig.9 Effect of AT on NF-κB expression in LPS-induced BV2 cells

圖10 蒼術(shù)酮對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)的影響Fig.10 Effect of AT on NF-κB expression in LPS-induced BV2 cells

3 結(jié)論

來研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)及其提取物有明顯的抗炎作用。一些研究表明白術(shù)提取物白術(shù)內(nèi)酯具有抗阿爾默茨海默癥、帕金森病以及神經(jīng)保護(hù)作用[9,10]。蒼術(shù)酮作為白術(shù)揮發(fā)油中主要物質(zhì)之一，最早和白術(shù)內(nèi)酯一起被發(fā)現(xiàn)有抗炎作用[11]。多個(gè)研究報(bào)道中，蒼術(shù)酮對(duì)于LPS誘導(dǎo)的RAW264.7有顯著抗炎作用[6-8]。但是蒼術(shù)酮對(duì)于神經(jīng)炎性反應(yīng)影響及其機(jī)制尚無研究報(bào)道。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要免疫細(xì)胞，受到異常如LPS等刺激后會(huì)產(chǎn)生一系列致炎因子，進(jìn)而發(fā)展為神經(jīng)炎性及神經(jīng)退化性疾病。炎癥因子是炎癥反應(yīng)中重要的細(xì)胞活性因子，它們對(duì)細(xì)胞炎癥都有直接或間接的作用，彼此之間也產(chǎn)生影響[12]。在神經(jīng)炎性反應(yīng)中，產(chǎn)生的致炎因子包括一氧化氮(NO)，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)，環(huán)氧合酶-2(COX-2)，前列腺素E2(PGE2)，白介素類(ILs，如IL-6)，腫瘤壞死因子(TNF-α)等。iNOS是NO合成酶，它的表達(dá)直接決定NO分泌量，是炎癥反應(yīng)檢測(cè)的一個(gè)重要指標(biāo)[13]。COX可以催化花生四烯酸生成前列腺素H2(PGH2)，而PGH2是前列腺素的前體。COX有三種類型的同工酶，其中COX-2與炎癥的關(guān)系最為密切[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞上清液中NO、PGE2、IL-6和TNF-α炎癥因子表達(dá)和細(xì)胞中iNOS、COX-2蛋白表達(dá)顯著增加。而蒼術(shù)酮預(yù)處理能夠劑量依賴性分別減少NO、PGE2的生成及減少iNOS、COX-2蛋白表達(dá)，以及抑制炎癥因子IL-6和TNF-α的釋放，此結(jié)果表明蒼術(shù)酮對(duì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有顯著抑制作用。

LPS觸發(fā)NF-κB和MAPK通路。NF-κB是一種控制DNA轉(zhuǎn)錄的蛋白復(fù)合體，在炎癥及免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，包括調(diào)控致炎因子iNOS和COX-2基因的表達(dá)[15]。正常條件下NF-κB復(fù)合體位于細(xì)胞質(zhì)中，由kB-α(IkB-α)和p50/p65組成，被激活后IkBa磷酸化并降解，于是NF-kB從細(xì)胞質(zhì)NF-kB/IkBa復(fù)合物中釋放出來，NF-kB p65亞單位上的S536發(fā)生磷酸化的反應(yīng)，從而使游離狀態(tài)的NF-kB進(jìn)入細(xì)胞核中，與靶向的DNA進(jìn)行結(jié)合，促進(jìn)炎癥因子IL-6、TNF-α等的大量表達(dá)[16]。該實(shí)驗(yàn)LPS刺激后BV2細(xì)胞包括細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中總p65磷酸化蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞質(zhì)中IkB-α磷酸化蛋白表達(dá)增加同時(shí)IkB-α降解增加，而蒼術(shù)酮可抑制此兩者磷酸化表達(dá)同時(shí)減少IkB-α降解。結(jié)果表明蒼術(shù)酮可通過NF-κB通路抑制炎癥的發(fā)生。

MAPK通路是從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者，是細(xì)胞增殖、應(yīng)激、炎癥、凋亡等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的共同交匯通路之一，主要亞族包括ERK、p38和JNK[17]。在刺激條件下MAPK通路蛋白磷酸化，并激活NF-kB通路，另外MAPK通路也可通過調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子如CREB、AP-1、Elk-1等發(fā)生炎癥反應(yīng)[18]。本實(shí)驗(yàn)中LPS組ERK、JNK和p38磷酸化蛋白表達(dá)均明顯增高，蒼術(shù)酮可明顯降低JNK和ERK磷酸化蛋白表達(dá)，然而對(duì)p38磷酸化蛋白表達(dá)無明顯影響。表明蒼術(shù)酮可通過ERK、JNK通路抑制炎癥的發(fā)生。

蒼術(shù)酮可顯著預(yù)防及抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)，其機(jī)制與炎癥通路ERK、JNK和NF-κB有關(guān)。未來將基于TLR4/MyD88 /Nf-κB炎癥通路進(jìn)行深入研究。