高小惠，胡燕琴，王洪靜，李 寧,2*，劉軍鋒*，楊兆祥

1昆藥集團股份有限公司，昆明 650100；2上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所教育部中藥標(biāo)準(zhǔn)化重點實驗室，上海 201203

復(fù)方甘草片是20世紀(jì)50年代我國醫(yī)藥工作者在國外經(jīng)典天然藥物處方的基礎(chǔ)上，自主開發(fā)的鎮(zhèn)咳祛痰藥[1]。其原方出自約翰·布朗醫(yī)師(1735～1788)的布朗合劑。1963年青海制藥廠刪除原方中酒石酸銻鉀并改劑型為片劑，首家注冊復(fù)方甘草片。此后復(fù)方甘草片的組方工藝幾經(jīng)變更[2]。目前處方每片含甘草浸膏粉112.5 mg、阿片粉或罌粟果提取物粉4 mg、樟腦2 mg、八角茴香油2 mg、苯甲酸鈉2 mg[2,3]。復(fù)方甘草片治療感染后咳嗽安全、可靠，總有效率為77.7%～85.4%，有效性及安全性與中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會《咳嗽的診斷與治療指南(2015)》[4]推薦的右美沙芬相當(dāng)[1]，且較右美沙芬更為經(jīng)濟[5]。目前，中國有復(fù)方甘草片生產(chǎn)廠家33家，涉及36個批準(zhǔn)文號，年產(chǎn)復(fù)方甘草片約200億片，市場價值約20億人民幣[2]。

質(zhì)量是藥品療效的根本保證。為提高仿制藥質(zhì)量，國務(wù)院辦公廳2016年3月5日發(fā)布了《國務(wù)院辦公廳關(guān)于開展仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價的意見》(國辦發(fā)[2016]8號)，要求開展仿制藥質(zhì)量和療效的一致性評價。食品藥品監(jiān)管總局2016年5月25日發(fā)布了《2018年底前須完成仿制藥一致性評價品種目錄》，復(fù)方甘草片明確列入該目錄中。2018年1月30日，仿制藥質(zhì)量與療效一致性評價辦公室將復(fù)方甘草片列入《289基藥目錄中國內(nèi)特有品種名單》，鼓勵并要求企業(yè)提出科學(xué)合理的評價方案。

為解決行業(yè)共性問題，進一步完善復(fù)方甘草片的質(zhì)量研究，本研究收集10個廠家共18批次復(fù)方甘草片樣品進行了摸底性調(diào)查研究，建立了HPLC指紋圖譜分析方法，對其中14個共有峰進行了鑒定，并同時對其中嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸7個主要成分的含量進行測定，為尋求符合復(fù)方甘草片特點的一致性評價路徑提供新的技術(shù)手段和基礎(chǔ)性研究資料。

1 材料、儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent1200高效液相色譜儀(包括DAD檢測器、柱溫箱、自動進樣器、在線脫氣機、四元梯度泵)(美國Agilent公司)；XP205、XPE26分析電子天平(Mettler公司)；5510E-DTH超聲提取儀(美國Branson公司)；Milli-Q 超純水機(美國Millipore公司)。

1.2 材料與試劑

18批復(fù)方甘草片(編號見表1)由昆藥集團股份有限公司(以下簡稱昆藥集團或昆藥)提供，包括9批昆藥集團樣品和9批其他廠家(廠家1～9)樣品；嗎啡、磷酸可待因、苯甲酸鈉、甘草苷、甘草酸銨、反式茴香腦對照品購自中國食品藥品檢定研究院；刺甘草查爾酮、甘草查爾酮A、甘草查爾酮B、甘草素、異甘草素、光甘草定、異甘草苷對照品購自成都曼思特生物科技有限公司；芹糖甘草苷對照品購自四川省維克奇生物科技有限公司；乙腈為色譜純(MERCK公司)，甲醇為分析純(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

取本品20片，精密稱取，研細(xì)，精密稱取1片量，置50 mL量瓶中，加50%甲醇適量，超聲提取30 min，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(0.45 μm濾膜)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取各對照品適量，加少量甲醇溶解后，用50%甲醇水溶液稀釋定容，即得各對照品儲備液。根據(jù)實驗需要，分別精密吸取各儲備液適量，用50%甲醇水溶液稀釋定容配成混合對照品溶液。其中含量測定用嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸銨混合對照品溶液，每 1 mL分別約含嗎啡0.008 mg、磷酸可待因0.004 mg、芹糖甘草苷0.036 mg、甘草苷0.016 mg、苯甲酸鈉0.040 mg、異甘草苷0.016 mg、甘草酸銨0.180 mg。

2.3 色譜條件

Welch Ultimate AQ-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；以乙腈為流動相A，以0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀2.72 g，加水至1 000 mL，磷酸調(diào)pH至4.0)為流動相B，進行梯度洗脫(0～10 min，2%→10% A；10～25 min，10%→38% A；25～35 min，38%→55% A；35～40 min，55%→60% A；40～50 min，65% A；50～55 min，65%→2% A；55～65 min，2% A)；流速1.0 mL/min；檢測波長為220和254 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

3 結(jié)果

3.1 指紋圖譜的方法學(xué)考察

3.1.1 精密度試驗

取同一批號昆藥集團樣品，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下的規(guī)定連續(xù)進樣6次，測得各色譜圖的相似度均大于0.99，RSD小于0.5%。以甘草酸色譜峰為參照，主要共有峰相對保留時間RSD小于1%，相對峰面積RSD小于3%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.1.2 重復(fù)性試驗

取同一批號昆藥集團樣品，按“2.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.3”項下的規(guī)定進樣分析，測得各色譜圖的相似度均大于0.99，RSD小于0.5%。以甘草酸色譜峰為參照，主要共有峰相對保留時間RSD小于1%，相對峰面積RSD小于3%。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

3.1.3 穩(wěn)定性試驗

取同一批號昆藥集團樣品，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后的0、2、4、8、12、18、24、48、72、96 h進樣，按“2.3”項下的規(guī)定進樣分析，測得各色譜圖的相似度均大于0.99，RSD小于0.5%。以甘草酸色譜峰為參照，主要共有峰相對保留時間RSD小于1%，相對峰面積RSD小于3%。結(jié)果表明樣品于96 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2 指紋圖譜的建立、相似度分析及共有峰指認(rèn)

取不同批號復(fù)方甘草片共18批，分別按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下的規(guī)定進樣分析，將220 nm波長的色譜圖輸入相似度評價軟件進行相似度比較，剪切10 min之前和50 min之后的色譜峰，采用中位數(shù)法生成參照指紋圖譜。各批次藥品指紋圖譜的疊加圖及共有模式指紋圖譜分別見圖1和圖2。以共有模式為參照，各批次樣品的相似度計算結(jié)果見表1，所有批次樣品的相似度均在0.95 以上。指紋圖譜中可見27個主要共有峰(圖2)，占總峰面積80%以上。與對照品色譜圖對照保留時間，共有峰1、3、8、9、10、14、16、17、19、20、22、24、25、26分別指認(rèn)鑒定為嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草查爾酮B、甘草素、甘草酸、刺甘草查爾酮、異甘草素、甘草查爾酮A、光甘草定、反式茴香腦。

圖1 18批樣品指紋圖譜Fig.1 Fingerprints of 18 batches of samples

圖2 18批樣品指紋圖譜共有模式Fig.2 Fingerprint common patterns of 18 batches of samples

3.3 指紋圖譜的相對保留時間和相對峰面積

以19號峰甘草酸為參照峰計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表2。19號峰結(jié)構(gòu)確切，與相鄰色譜峰分離良好，易于識別，且保留時間及峰面積均較穩(wěn)定，適于作為參照峰。共有峰的相對峰面積分布在一個較寬的范圍內(nèi)，最大RSD(26號峰)達61.66%，客觀反映了化學(xué)成分的批間差異。

表1 18批樣品相似度Table 1 Similarities of 18 batches of samples

表2 18批樣品共有峰相對保留時間及相對峰面積Table 2 The relative retention time and relative peak areas of common peaks of 18 batches of samples

續(xù)表2(Continued Tab.2)

峰號No.相對保留時間RRT相對峰面積Relative peak areaS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15S16S17S18RSD(%)201.0260.4170.2880.3310.3930.3140.3230.2890.2940.3310.2760.3340.2910.2890.2790.2680.2770.2760.27313.51211.0800.4110.0680.2700.3580.1670.4010.1630.1640.4970.2720.4750.2780.2800.2760.2650.2740.2730.27238.49221.1020.1890.0930.2000.1430.1690.3290.1060.1120.3490.1920.3130.1750.1680.2160.0840.2080.1770.16040.66231.1160.2060.0810.1240.1900.1580.1880.1280.1300.2050.1560.1930.1430.1400.1600.1510.1600.1580.15520.11241.3020.1080.1390.1040.0430.0960.1750.0850.0940.1020.0550.0950.1200.1120.0590.0240.0560.0490.04644.28251.3430.3070.3910.2600.4260.3460.3160.2500.2540.2700.2760.3000.2630.2680.2710.2610.2740.2760.25616.83261.3800.1000.9170.4270.5080.1701.6870.6460.6470.5791.2800.5240.3100.3071.3501.4141.3361.3021.50561.66271.4150.4790.7250.2110.4210.5210.4630.4670.4630.4930.2370.4830.4890.5110.2250.2410.2190.2370.23837.73

3.4 含量測定的方法學(xué)考察

本研究建立的指紋圖譜分析方法可同時對復(fù)方甘草片中嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸面積7個主要成分進行含量測定。

3.4.1 專屬性試驗

取昆藥集團樣品及空白輔料，按“2.1”項下方法制備供試品溶液和空白輔料溶液，取對照品，按“2.2”項下方法制備對照品溶液，分別按“2.3”項下的規(guī)定進樣分析。如圖4中可見，空白輔料溶液色譜圖中無干擾峰影響定量，對照品溶液與供試品溶液色譜圖中嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸與相鄰峰分離良好(分離度大于1.5)。結(jié)果表明本方法專屬性良好。

3.4.2 精密度試驗

取同一批號昆藥集團樣品，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下的規(guī)定連續(xù)進樣6次，測得嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸峰面積RSD為0.68%～1.29%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.4.3 重復(fù)性試驗

取同一批號昆藥集團樣品，按“3.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.3”項下的規(guī)定進樣分析，測得嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸峰面積RSD為0.21%～3.90%。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

3.4.4 穩(wěn)定性試驗

取同一批號昆藥集團樣品，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后的0、2、4、8、12、18、24、48、72、96 h進樣，按“2.3”項下的規(guī)定進樣分析，測得嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸的峰面積 RSD為0.98%～4.53%。結(jié)果表明樣品于96 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4.5 線性關(guān)系試驗

精密稱取7個對照品，以50%甲醇水溶液溶解并逐級稀釋成一系列不同濃度的工作液。按“2.3”項下的規(guī)定進樣分析。于220 nm檢測嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉和異甘草苷，254 nm檢測甘草酸。以濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y繪制工作曲線，計算回歸方程。結(jié)果見表3，嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.4.6 定量限

取各成分對照品溶液，逐級稀釋測定，滿足S/N≥10，即為定量限。結(jié)果表明嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸的定量限為2.3、4.5、7.3、3.8、9.5、4.0、4.8 ng。

3.4.7 加樣回收率試驗

分別取已知含量的同一批號昆藥集團樣品9份，每份約0.0685 g置50 mL量瓶中，精密稱取。分為3組，分別加入供試品中待測定成分量為80%、100%、120%的對照品。以上9份按“2.1”項下方法，自“加50%甲醇適量”開始制備加樣回收供試品溶液，按“2.3”項下的規(guī)定進樣分析，計算加樣回收率。嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸的平均加樣回收率分別為104.45%、103.47%、100.07%、100.60%、97.54%、94.73%、102.83%，RSD值分別為0.81%、3.89%、0.68%、0.89%、2.91%、1.52%、1.35%。結(jié)果表明本方法回收率良好。

圖3 空白(a和b)、對照品(c和d)和供試品(e和f)的色譜圖Fig.3 Chromatograms of blank (a,b)，reference (c,d) and sample (e,f)注：1.嗎啡；2.磷酸可待因；3.芹糖甘草苷；4.甘草苷；5.苯甲酸鈉；6.異甘草苷；7.甘草酸。Note:1.Morphine;2.Codeine phosphate;3.Liquiritinapioside;4.Liquiritin;5.Sodium benzoate;6.Isoliquiritin;7.glycyrrhizic acid.

表3 7種指標(biāo)成分的線性關(guān)系Table 3 Linear relationships of 7 constituents

3.5 樣品含量測定

取18批樣品，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，取嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸對照品，按“2.2”項下方法制備對照品溶液，分別按“2.3”項下的規(guī)定進樣分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各批次樣品中7個化合物的含量，結(jié)果見表4。

4 討論

復(fù)方甘草片作為復(fù)方天然藥物，化學(xué)成分復(fù)雜，質(zhì)量受藥材來源及工藝參數(shù)等多種因素的影響，其一致性評價方法與化學(xué)仿制藥有顯著的區(qū)別。中藥、天然藥物的一致性評價是復(fù)雜的系統(tǒng)科學(xué)，是行業(yè)普遍關(guān)注的熱點問題，眾多學(xué)者提出了多種研究模式與思路[2,6-8]。其中，指紋圖譜和多成分含量測定是較為公認(rèn)的技術(shù)手段與評價方法。建立指紋圖譜分析方法，與多成分含量測定相結(jié)合，構(gòu)建中藥整體成分質(zhì)量控制體系，已成為中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展方向[9]。

復(fù)方甘草片的指紋圖譜及含量測定方法已有相關(guān)文獻報道[10-15]。但不同研究者的角度、研究目的及實驗條件不同，報道的分析方法各異，多數(shù)無法在獲得指紋圖譜的同時進行多成分精確含量測定，且測定的指標(biāo)性成分?jǐn)?shù)量較少。本課題組前期采用UHPLC-LTQ-Orbitrap高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)從復(fù)方甘草片中分析鑒定了55個成分[16]。該方法可用于進一步獲取復(fù)方甘草片的化學(xué)輪廓及55個成分的定量與半定量。但方法測試成本較高且需要配備專門的儀器及分析人員。為解決行業(yè)共性問題，本研究基于HPLC及紫外檢測器建立了更為通用的分析方法，更加適于工業(yè)界推廣應(yīng)用。

表4 18批樣品7成分含量測定結(jié)果Table 4 Results of content determination of 7 constituents

本研究的色譜條件參考文獻[13]，并在此基礎(chǔ)上進行了優(yōu)化調(diào)整。首先，采用了耐水的反相色譜柱。為保證嗎啡及相鄰色譜峰的基線分離，本方法以98%水相做為起始流動相，耐水色譜填料的使用可避免高水相引起的色譜柱塌陷，延長色譜柱壽命。其次，選擇220 nm為指紋圖譜的檢測波長。該波長下的色譜圖色譜峰數(shù)量多，峰形及分離度良好，來源于甘草浸膏粉、阿片粉或罌粟果提取物、八角茴香油的色譜峰及苯甲酸鈉均有體現(xiàn)，且各色譜峰峰面積比例適中。雖然254 nm波長的化學(xué)信息也較豐富，但甘草酸色譜峰的峰面積占總峰面積的比例過大，對整體相似度貢獻過大。第三，選擇220 nm做為嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸的定量波長。選擇254 nm做為甘草酸的定量波長。對7個成分進行了完整的含量測定方法學(xué)考察。其中嗎啡、磷酸可待因為阿片粉或罌粟果提取物的活性成分，芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷和甘草酸為甘草浸膏粉的特征性成分，且兼顧了苯甲酸鈉，多指標(biāo)共同定量使分析結(jié)果更具代表性。

本研究首先通過指紋圖譜相似度評價法，通過與對照指紋圖譜計算相似度評價藥品質(zhì)量。18批樣品的相似度均在0.95以上，總體來說，不同廠家、批次復(fù)方甘草片的指紋圖譜具有相對較好的一致性。其次對主要共有峰的相對峰面積范圍進行了比較分析。相對峰面積反映了各色譜峰的比例關(guān)系，進而更加細(xì)致地反映制劑的內(nèi)在質(zhì)量。在本研究中，各批次藥品共有峰的相對峰面積在較寬的范圍內(nèi)波動，客觀反映了不同批次樣品成分比例的差異。本研究進而對7個指標(biāo)性成分進行了含量測定，18批制劑7成分含量總和的平均值超過處方總重量的10%。18批復(fù)方甘草片中，嗎啡、可待因、苯甲酸鈉、甘草酸的含量一致性較好，RSD分別為3.89%、6.20%、6.92%和6.79%。芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷的含量一致性較差，RSD分別為15.86%、18.17%和14.34%。本研究對10個廠家18批次市場流通樣品進行了分析，對復(fù)方甘草片的質(zhì)量進行了初步的摸底性調(diào)查研究。但復(fù)方甘草片生產(chǎn)企業(yè)多，產(chǎn)量大，批次多，未來的工作中，建議利用本研究建立的分析方法，進一步增大樣本數(shù)量，對不同廠家、批次樣品的質(zhì)量情況進行更加深入的調(diào)查研究。

阿片粉或罌粟果提取物粉屬于國家管控的麻醉藥品，由指定的企業(yè)統(tǒng)一供應(yīng)，各復(fù)方甘草片廠家所用的原料來源相對一致，成品中嗎啡和可待因的含量也相對穩(wěn)定。甘草浸膏是甘草經(jīng)加工制成的浸膏[3]，生產(chǎn)廠家較多，來源多樣。甘草為多基源藥材，至少涉及甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.、光果甘草G.glabraL.三種藥用植物[3]，物種本身的化學(xué)成分和活性存在差異[17]，野生及栽培藥材的質(zhì)量參差不齊[9]，不同品種、不同采收期栽培藥材的有效成分含量亦有不同[18]。各廠家浸膏生產(chǎn)工藝的差異進一步造成了甘草浸膏粉的質(zhì)量差異。復(fù)方甘草片現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)[3]對甘草酸含量進行了規(guī)定，因此各廠家采取了技術(shù)手段以保障甘草酸含量的相對穩(wěn)定。但是對于未訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的成分，如芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷等，批間含量波動較大，一致性較差。在未來的研究工作中，應(yīng)加強對藥材源頭的研究和管控，系統(tǒng)研究各成分在藥材、中間體、制劑間的轉(zhuǎn)移傳遞規(guī)律，制訂更為科學(xué)、合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究為進一步研究提供了分析方法和技術(shù)保障。

5 結(jié)論

本研究建立了復(fù)方甘草片的HPLC指紋圖譜及嗎啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸鈉、異甘草苷、甘草酸 7成分測定方法。實驗結(jié)果表明本方法簡便、快速、準(zhǔn)確、可靠，可用于復(fù)方甘草片的質(zhì)量控制，為尋求符合復(fù)方甘草片特點的一致性評價路徑提供了新的技術(shù)手段和基礎(chǔ)性研究資料。