張方，周云，吳煥淦，翁志軍，張智英，趙敏，許瓊，劉慧榮，周次利

(1.上海市針灸經絡研究所，上海 200030;2.上海中醫(yī)藥大學，上海 201203)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種較為常見的慢性功能性腸道疾病，以持續(xù)存在或間歇發(fā)作的腹痛或腹部不適，伴排便習慣、大便性狀改變和排便后癥狀改善為主要臨床表現，缺乏形態(tài)學及生物化學異常改變[1-2]。IBS作為一種消化系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，其腹痛、排便習慣改變等臨床特點給患者的工作和生活造成很大困擾。然而IBS的病因病機尚未研究清楚，目前認為主要與內臟高敏感、胃腸動力學異常、腸道感染、精神心理、基因遺傳、腦-腸軸失調等有關[3-4]，其中內臟高敏感被認為是 IBS的主要生理病理機制之一。

P2X受體屬于配體門控性非選擇性陽離子通道受體，可表達于與傷害性信息傳遞有關的初級傳入神經元的胞體、中樞端和外周端。研究表明P2X受體在疼痛的傳遞和慢性疼痛的調節(jié)中發(fā)揮了重要作用，其中主要是 P2X3及其異聚體 P2X2/3、P2X4和 P2X7受體亞型[5]。P2X3受體被 ATP激活后，在內臟痛覺信號轉導中起到重要調節(jié)作用[6-7]，并且參與腸道運動、胃腸分泌等功能的調節(jié)。Burnstock G等[8-9]研究發(fā)現 P2X3、P2X2/3等受體能引起傷害性信息向痛覺中樞傳遞，且在諸多疾病中得到證實，如腸易激綜合征、間質性膀胱炎等[10]。本課題組前期的臨床和基礎研究也證實針灸治療 IBS的有效性[11-15]，且篩選出P2X受體中參與IBS內臟痛的主要受體亞型是 P2X2、P2X3、P2X4受體[16-18]，并初步闡釋了針灸治療IBS內臟痛的部分神經生物學機制[19]。但缺乏P2X受體參與艾灸治療IBS的效應與作用機制的研究報道，本研究主要觀察艾灸對 IBS大鼠結腸相關背根神經節(jié)(dorsal root ganglia，DRG)中 P2X3受體的調節(jié)作用，研究艾灸調節(jié)內臟痛的外周敏化機制，以期為艾灸緩解內臟痛效應機制的闡釋提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD新生大鼠(乳鼠，出生5 d)，由上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供[動物許可證號為SCXK(滬)2013-0016]，每10只新生大鼠與1只哺乳大鼠共同飼養(yǎng)，哺乳大鼠自由飲食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境為12 h晝夜節(jié)律交替，室溫(20±2)℃，室內濕度 50%～70%適應性飼養(yǎng)。3 d后新生大鼠用于實驗，實驗過程中對實驗動物的操作和處理均符合動物福利的基本原則。

1.2 主要試劑和儀器

戊巴比妥鈉(Merck，德國);P2X3受體拮抗劑(M2979，Sigma，美國);生理鹽水、液體石蠟、無水乙醇、多聚甲醛、二甲苯、中性樹膠粘合劑、十二水合磷酸氫二鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀(國藥集團化學試劑有限公司，中國);蘇木素、伊紅(南京建成生物有限公司，中 國 );Anti-P2X3(ab10269，abcam，英 國 );GAPDH(2118S，CST，美國);羊抗兔 IgG(BA1003，博士德，美國);辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG(H+L)(A0208，碧云天，中國);SYBRGreen PCR試劑盒(208052，QIAGEN，德國);cDNA synthesis 試劑盒(K1622，Invitrogen，美國);艾條(直徑0.3 cm，長10 cm)(河南南陽漢醫(yī)艾絨制品廠，中國);光學顯微鏡及分析軟件(OLYMPUS公司，日本);電泳儀、轉印儀(Bio-RAD，美國);ABI ViiA 7 Real Time PCR System(Applied Biosystems，美國)。

1.3 模型制備

按照完全隨機設計原則，將所有出生8 d的新生大鼠隨機分為正常組8只與造模組32只。正常組新生大鼠不做任何處理，造模組新生大鼠在清醒狀態(tài)下給予直結腸球囊擴張(colorectal dilatation，CRD)刺激，操作過程參考Al-Chaer ED等[20]慢性內臟高敏感大鼠模型制備過程。操作時先用適量液體石蠟將自制球囊表面潤滑，然后順新生大鼠直結腸生理曲度緩緩從肛門插入，深度約2 cm，到達新生大鼠降結腸位置。用注射器給氣囊充氣0.2 mL，持續(xù)1 min后撤氣并將氣囊取出，1 h后重復1次同樣的刺激。每天刺激1次，連續(xù)14 d。刺激結束后大鼠正常飼養(yǎng)，于第36天對大鼠進行AWR評分模型鑒定。

1.4 分組與處理

正常組(NG)無異常，造模組在造模過程中死亡 5只。將剩余27只大鼠隨機分為模型組(MG，n=7)、艾灸組(MOX，n=7)、P2X3受體拮抗劑組(A-317491，n=7)、生理鹽水組(NS，n=6)。所有大鼠于第37天開始干預。正常組給予與艾灸組相同的固定;模型組給予與艾灸組相同的固定;艾灸組先進行大鼠雙側足三里穴位處剃毛備皮，然后固定好大鼠，采用特制艾條點燃后溫和灸大鼠雙側足三里穴[21]，距離皮膚 2～3 cm，以大鼠耐受為度，每日1次，每次15 min，連續(xù)干預7 d;P2X3受體拮抗劑組在大鼠髓鞘內注射A-317491(10μL，1μmoL/μL)[22]，每日1次，連續(xù)干預7 d;生理鹽水組在大鼠髓鞘內注射生理鹽水(10μL)，每日1次，連續(xù)干預7 d。

1.5 樣本采集

標本采集前禁食12 h，以2%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠。每只大鼠取結腸標本1份，4%多聚甲醛固定 24 h后脫水包埋切片;取 T13-L2、L6-S2節(jié)段背根神經節(jié)[23-25]標本分3份，1份置于4%多聚甲醛溶液內固定24 h后脫水包埋切片，另2份分別放入凍存管中置于﹣80℃冰箱保存，用于Western blot、RT-qPCR指標檢測。

1.6 觀察指標

1.6.1 腹部撤回反射(AWR)評分

于第36天(干預前)和第43天(干預結束后)對大鼠進行AWR評分，評分標準參照Al-Chaer ED等[20]的實驗操作。評分實驗前禁食不禁水8～12 h，以減少糞便形成。CRD刺激方法:利用三通閥將自制球囊刺激儀和醫(yī)用血壓計及注射器連成一體，在大鼠清醒狀態(tài)下將球囊從肛門順直結腸生理曲度插入降結腸部位，分別進行20、40、60、80 mmHg 4個不同壓力強度的結腸恒壓擴張刺激。每只大鼠每個強度壓力測量3次AWR評分，每次持續(xù)約20 s，同一強度壓力之間間隔1 min，不同強度壓力之間間隔4 min，取均值作為最后評分值，評分示意圖[26]和表如圖1、表1所示。

圖1 腹壁撤回反射(AWR)評分示意圖

表1 腹壁撤回反射(AWR)評分表

1.6.2 組織病理學觀察

結腸組織切片常規(guī)脫蠟至水;蘇木素染色90 s;流水沖10 min;鹽酸乙醇分化2 s;流水沖洗5 min;伊紅染色 5 min;梯度乙醇脫水;二甲苯透明;中性樹膠封片;Olympus-BX53顯微鏡下觀察，采集圖片。

1.6.3 免疫組化檢測

DRG組織切片常規(guī)脫蠟至水;檸檬酸鹽緩沖液抗原修復;PBS緩沖液沖洗5 min×3次;0.3%H2O2抑制內源性過氧化物酶20 min(避光);雙蒸水沖洗5 min×2次;正常羊血清室溫封閉20 min;滴加Anti-P2X3一抗(1:200)4℃過夜孵育;37℃復溫45 min;PBS緩沖液沖洗5 min×3次;滴加羊抗兔IgG二抗(1:100)室溫孵育30 min;DAB顯色1～2 min;雙蒸水終止顯色;蘇木素復染2 min;流水沖10 min;鹽酸乙醇分化5 s;流水沖洗5 min;梯度乙醇脫水;二甲苯透明;中性樹膠封片;Olympus-BX53顯微鏡采集圖像，Image-Pro PLUS軟件采集數據。

1.6.4 Western blot檢測

提取DRG組織總蛋白，按0.1 g組織加入1000 μL RIPA裂解液和 10 μL PMSF蛋白酶抑制劑裂解組織，用組織勻漿機勻漿，冰浴30 min以析出蛋白，然后4℃離心，12000 rpm，5 min; BCA法測定蛋白濃度;制備上樣品取30 μg蛋白，按上樣蛋白體積與5×上樣緩沖液4:1的比例混合，99℃水浴加熱5 min，以充分變性蛋白，然后 4℃離心，12000 rpm，5 min;12%聚丙烯酰胺凝膠80 V恒壓電泳至分離膠底部;電泳結束后，將PVDF膜及凝膠固定于轉印夾中，125 V轉膜60 min;轉膜結束后，剪取 PVDF膜上的目的條帶，用 5%BSA室溫封閉45 min;將 PVDF膜浸泡于 Anti-P2X3(1:1000)、GAPDH(1:1000)抗體中4℃搖床孵育過夜;PBST洗膜4次，每次10 min;將PVDF膜浸泡于辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG(H+L)(1:1000)抗體中室溫搖床孵育1 h;采用凝膠成像系統(tǒng)進行圖像采集，ImageJ軟件進行數據采集。

1.6.5 Rt-qPCR檢測

DRG組織總RNA抽提，組織勻漿，采用Trizol法提取總RNA，檢測濃度、純度、完整性，取相等量的總RNA，采用SYBRGreen PCR試劑盒、cDNA synthesis試劑盒逆轉錄 cDNA，所用引物序列由 ABI公司的 Primer Express Software v2.0設計，由華大基因公司合成。P2X3-F，ACCCCACCCCAGAATGAAGA;P2X3-R，AGCTGTAGTTC ACGCAGCGG;GAPDH-F，GGCAAGTTCAACGGCACAGT;rGAPDHR，ATGACATACTCAGCACCGGC。數據采用儀器自帶軟件ABI Prism 7500 SDS Software分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 21.0對數據進行統(tǒng)計分析。若數據符合正態(tài)分布，用均數±標準差表示，若不符合正態(tài)分布，用中位數(四分位數間距)表示。若數據服從正態(tài)分布且方差齊時，采用One-way ANOVA分析，進一步采用最小顯著差法LSD進行兩兩比較;若數據服從正態(tài)分布但方差不齊時，采用One-way ANOVA分析，則進一步采用Games-Howell法進行兩兩比較;若數據既不服從正態(tài)分布，方差也不齊，則采用Kruskal-Wallis H檢驗分析，進一步采用Nemenyi法進行兩兩比較。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 行為學觀察

第36天(干預前)進行20、40、60、80 mmHg不同壓力強度CRD刺激下的AWR評分，與正常組大鼠比較，造模組大鼠結腸敏感性增高(P＜0.05)，從行為學的角度提示IBS內臟痛大鼠模型制作成功。然后將納入實驗的內臟痛大鼠隨機分為模型組、艾灸組、P2X3受體拮抗劑組、生理鹽水組。第43天(干預結束后)的AWR評分可見，與正常組比較，模型組大鼠在各個強度壓力下的AWR評分均顯著增加(P＜0.01)，從行為學角度說明新生大鼠直結腸 CRD刺激后慢性內臟痛敏形成;與模型組比較，艾灸組、P2X3受體拮抗劑組大鼠在各個強度壓力下的AWR評分均顯著下降(P＜0.01)，生理鹽水組大鼠在各個強度壓力下的 AWR評分均無明顯變化，說明艾灸能降低 IBS大鼠的內臟高敏感性，髓鞘內注射 A-317491通過阻斷外周 P2X3受體的途徑降低了內臟痛敏，而髓鞘內注射生理鹽水并未改變模型大鼠的內臟痛敏。詳見圖2。

圖2 干預前后大鼠行為學變化

2.2 結腸組織病理學觀察

新生大鼠直結腸CRD刺激誘導的IBS慢性內臟痛動物模型不以局部炎性為結腸病理表現，主要體現在行為學方面，結腸病理染色可見，各組大鼠結腸黏膜完整，腺體排列整齊，固有層內有少量嗜酸性粒細胞浸潤，間質有輕微水腫，各組間無明顯差異。詳見圖3。

圖3 結腸組織HE染色

2.3 結腸相關DRG中P2X3受體表達

背根神經節(jié)內 P2X3受體主要表達于神經元中[27]。采用免疫組化法觀察 P2X3受體陽性分布情況，發(fā)現P2X3受體在中、小直徑DRG神經元中分布廣泛，染色較淡。通過半定量分析結果顯示，與正常組比較，新生大鼠直結腸 CRD刺激能夠上調 P2X3受體蛋白表達，染色較深，呈陽性或者強陽性反應(P＜0.01);與模型組比較，艾灸和髓鞘內注射A-317491能夠下調新生大鼠直結腸CRD刺激誘發(fā)的P2X3受體陽性表達，染色較淡，呈陽性或者弱陽性反應(P＜0.01);髓鞘內注射生理鹽水沒有明顯改變新生大鼠直結腸CRD刺激誘發(fā)的P2X3受體陽性表達，染色較深，呈陽性或者強陽性反應。詳見圖4A-B。

與正常組比較，新生大鼠直結腸 CRD刺激能夠上調正常大鼠結腸相關DRG中P2X3受體蛋白和mRNA表達(P＜0.01);與模型組比較，艾灸組能夠下調內臟痛大鼠結腸相關DRG中P2X3受體蛋白和mRNA表達(P＜0.01)，髓鞘內注射 P2X3受體拮抗劑 A-317491也能下調內臟痛大鼠結腸相關 DRG中 P2X3受體蛋白和 mRNA表達(P＜0.01)，而髓鞘內注射生理鹽水對內臟痛大鼠結腸相關DRG中P2X3受體蛋白和mRNA表達沒有明顯影響，與干預后AWR評分檢測結果一致。詳見圖4C-E。

3 討論

中醫(yī)學中沒有腸易激綜合征這一病名，但從腹痛、腹瀉或便秘等臨床癥狀來看，歸屬于“痛泄”“泄瀉”“便秘”等病證范疇。本病病因多為外感時邪、飲食失宜、情志失調、臟腑虛弱、稟賦不足、久病體虛等，病位在腸，主病臟腑為脾胃，與肝相關，病久累及心、腎。中醫(yī)治療本病具有一定優(yōu)勢，方法眾多，療效較好，且安全性高[28-29]。艾灸是一種具有中醫(yī)臨床特色的診療手段，有溫經散寒、行氣通絡、升陽舉陷等功效，方法簡便易行、經濟實用，無毒性和副作用[30]。足三里穴為足陽明胃經合穴，胃之下合穴，艾灸足三里在治療消化系統(tǒng)疾病方面有著良好療效，可通過調節(jié)神經-內分泌系統(tǒng)來改善胃腸道功能，通過降低內臟敏感性，提高患者的痛閾而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[31]。

感覺神經節(jié)是痛覺通路的第一站，DRG是感覺神經節(jié)中的主要類型，支配機體包括內臟的大部分部位。感覺神經節(jié)中神經元致敏是慢性疼痛外周敏化的一個重要促成因素[32]。P2X3受體高度選擇性地表達于外周初級感覺傳入神經的中、小直徑DRG神經元中，外周端與軀體和內臟直結腸神經纖維末梢相連，中樞端與傷害性信息有關的脊髓背角相連，在疼痛信號的傳導及其痛覺敏化的發(fā)生、發(fā)展和維持中起著重要作用[33-34]。結腸相關DRG神經元中P2X3受體過表達是IBS內臟痛大鼠外周敏化的重要因素[35]。課題組以往研究發(fā)現P2X2、P2X3、P2X4受體介導 IBS慢性內臟痛，其中P2X3受體在內臟痛的外周敏化中具有重要作用，并發(fā)現針刺緩解內臟痛有P2X3、P2X4等亞型的參與[16-18]。

圖4 結腸相關DRG中P2X3蛋白和mRNA表達

本實驗研究發(fā)現艾灸能夠調節(jié)IBS內臟痛大鼠結腸相關DRG中異常增高的P2X3受體蛋白及mRNA表達，可能是艾灸緩解IBS大鼠內臟痛外周敏化的作用機制。以機械性CRD刺激新生大鼠模擬的腸易激綜合征內臟高敏感，在大鼠成年后內臟高敏感性仍然存在。本實驗新生大鼠直結腸CRD刺激誘導的IBS慢性內臟痛動物模型不以結腸炎性為病理表現，主要體現在行為學方面，與以往研究報道一致[20]。本實驗中結腸組織病理染色顯示各組大鼠結腸黏膜完整，腺體排列整齊，符合臨床IBS無形態(tài)學改變的結腸病理表現。鞘內注射P2X3選擇性拮抗劑A-317491抑制外周P2X3活性，能夠明顯降低IBS大鼠AWR評分，從行為學角度證明了P2X3在IBS內臟痛中發(fā)揮重要作用，而艾灸足三里穴也能夠緩解 IBS內臟高敏感狀態(tài)，提示 P2X3受體可能參與艾灸緩解IBS內臟痛外周敏化的調節(jié)機制。本研究對結腸相關DRG神經元胞體中P2X3受體蛋白和mRNA進行檢測，發(fā)現IBS大鼠結腸相關DRG中P2X3受體蛋白和mRNA表達均上調，艾灸干預能夠下調結腸相關DRG中P2X3受體蛋白與mRNA的表達，而A-317491同樣抑制了結腸相關DRG中P2X3受體蛋白和mRNA的表達，可見艾灸對P2X3受體蛋白及其mRNA的下調作用與A-317491抑制作用類似，說明艾灸能夠調節(jié)內臟痛效應器官腸感覺神經外周端 P2X3受體的表達，與本課題組以往研究發(fā)現P2X3受體參與電針緩解IBS內臟高敏感的外周神經生物學機制的結果相似[18]。以上實驗為結腸相關DRG感覺神經元中P2X3受體參與艾灸緩解IBS大鼠內臟痛的作用機制提供了分子生物學實驗證據，但仍存在一些未能解決的問題需要進一步研究，比如外周和中樞其他部位的P2X3受體是否參與艾灸緩解IBS大鼠內臟痛的作用機制，以及 P2X3受體通過什么途徑參與艾灸緩解 IBS內臟痛的分子機制仍不明確，還有待于在今后的實驗中進一步探索。