顧沐恩，趙繼夢，吳煥淦，鄭寒丹，劉雅楠，程玲，馬喆，吳璐一，李璟，黃艷，楊玲

(1.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海 200030;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437;3.上海市東方醫(yī)院，上海 200120;4.上海中醫(yī)藥大學(xué)針灸免疫效應(yīng)重點(diǎn)研究室，上海 200030)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性炎癥性腸病，近年來研究認(rèn)為，遺傳、免疫、環(huán)境、腸道菌群等是其重要的發(fā)病機(jī)制[1-4]。隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，UC在中國的發(fā)病率有逐年升高的趨勢[5-6]，而UC患者因長期而廣泛的結(jié)腸潰瘍、炎癥引起的結(jié)腸癌變率達(dá)3.7%～5.7%[7]，尤其是8年以上的全結(jié)腸炎，結(jié)腸癌變風(fēng)險(xiǎn)開始逐漸增加[8]。因此，深入研究UC的發(fā)病機(jī)制，盡早干預(yù)UC，預(yù)防癌變的發(fā)生對臨床上UC的診斷和治療均有重要意義。

近10年來，微小RNA(microRNA，miRNA)在各種疾病中的作用被廣泛關(guān)注。大量的研究證實(shí)了miRNA的功能和潛在價(jià)值[9]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可調(diào)節(jié)人類10%～30%的基因表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、新陳代謝和腫瘤中發(fā)揮重要的作用[10]。miRNA為基本的炎癥型信號通路的調(diào)節(jié)方式，可導(dǎo)致不同的炎癥性疾病[11]，包括炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，UC疾病中的一些在外周血與結(jié)腸組織中功能失調(diào)的miRNAs，能通過調(diào)節(jié)mRNA的表達(dá)水平抑制結(jié)腸的炎癥反應(yīng)[12]，從而有潛力治療UC并預(yù)防癌前病變[14]。

本研究團(tuán)隊(duì)多年研究發(fā)現(xiàn)，艾灸可有效改善UC患者的生活質(zhì)量，減輕腸道炎癥反應(yīng)[15-17]。隔姜灸作為艾灸的1種，因其操作簡便、效果顯著，亦被廣大患者所接受。但隔姜灸對UC的效應(yīng)機(jī)制尚不完全明確，是否可以通過改變UC結(jié)腸miRNAs的表達(dá)，發(fā)揮抑制炎癥的作用?因此，本研究采用4% DSS誘導(dǎo)UC大鼠模型，隔姜灸 UC大鼠雙側(cè)天樞穴，應(yīng)用高通量測序的方法，從miRNA的角度研究隔姜灸對UC大鼠結(jié)腸miRNA表達(dá)譜的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

30只健康成年Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，體質(zhì)量(180±20)g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號SCXK(京)2012-0001]。飼養(yǎng)條件為清潔級，12 h晝夜節(jié)律交替(7—19點(diǎn)照明)，室內(nèi)溫度(20±2)℃，室內(nèi)濕度50%～70%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始正式實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照美國國立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用指南執(zhí)行，實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置遵循科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》規(guī)定。將30只大鼠隨機(jī)分為正常組(NC組)、模型組(UC組)和隔姜灸組(GM組)，每組10只。

1.2 主要設(shè)備和試劑

NanoDrop-2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，美國);TapeStation 2200(Agilent Technologies Inc，美國);Illumina HiSeq 2000 測序儀(Illumina，美國);BioRad CFX96TM實(shí)時(shí) PCR系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories，CA，USA);葡聚糖硫酸鈉(36-50 kDa，#160110，MP Biomedicals，美國);TRIzol Reagent(Thermo Fisher Scientific，美國);Illumina TruSeq小 RNA樣品預(yù)處理試劑盒(Illumina，美國);Qubit 2.0 Fluorometer using the dsDNA HS and/or BR assay kit(Life Technologies，美國);TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumina，CA，USA);RNase 抑制劑(ThermoFisher Scientific，USA)。

1.3 UC模型建立[18]

UC組和GM組大鼠予以4% DSS自由飲水7 d制備UC大鼠模型。造模后，每組取 2只采用蘇木素-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色觀察造模是否成功。造模成功后，UC組和GM組大鼠繼續(xù)予1% DSS自由飲水7 d以維持腸道炎癥。

1.4 艾灸干預(yù)

造模成功后，GM組大鼠同時(shí)予以隔姜灸干預(yù)。取雙側(cè)天樞穴。生姜沿纖維縱向切取，切剪成厚0.3 cm、直徑1 cm大小的姜片。將艾絨用模具制成直徑和高度均為0.6 cm、重約90 mg的艾炷。采用固定器固定大鼠后，暴露雙側(cè)天樞穴，提前1 d將天樞穴局部鼠毛剔除，將制成的艾炷放在姜片上，然后將姜片放置于穴位上，點(diǎn)燃艾絨，每次每穴灸2壯。每日1次，共干預(yù)7 d。此外，采用與GM組相同的方法對NC組和UC組大鼠進(jìn)行固定。

1.5 樣本采集

隔姜灸干預(yù) 7 d后，用 2%戊巴比妥鈉(30～40 mg/kg)對各組大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，在距離肛門1 cm處采集長6～8 cm的遠(yuǎn)端結(jié)腸。每個(gè)結(jié)腸分成兩部分，一部分用4%多聚甲醛固定用于HE染色;另一部分剪碎后置于凍存管中，用液氮凍存 1 h后保存在-80℃冰箱用于miRNA檢測。

1.6 HE染色

每組5只大鼠4%多聚甲醛固定的結(jié)腸組織脫水修片后，沿著結(jié)腸的腸系膜將結(jié)腸垂直石蠟包埋固定，將組織切成 4 μm厚，經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化，HE染色后脫水、透明、封片，玻片晾干后在低倍鏡和高倍鏡下觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.7 miRNA的cDNA文庫構(gòu)建、RNA-seq高通量測序和數(shù)據(jù)分析

每組取 3只超低溫凍存的結(jié)腸組織采用 Trizol的方法提取總RNA，采用Nanodrop2000檢測其純度和濃度，采用安捷倫 2200檢測總 RNA的完整性，將 RIN值大于 8的總 RNA用于文庫構(gòu)建。每個(gè)樣本取 3 μg總RNA建立miRNA文庫，根據(jù)Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kits (Illumina，San Diego，CA)操作說明分別選取不同的index標(biāo)簽建庫。建庫完成后，利用安捷倫 2200檢測文庫的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)采用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumina)試劑在cBot上生成簇，接著在Hiseq2000測序平臺上運(yùn)行單端測序程序。測序過程由 Illumian提供的 Data collectionsoftware進(jìn)行控制，實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)分析。與參考序列比對，采用 DESeq進(jìn)行分析，計(jì)算變化倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)和P值，設(shè)定 FC≥1.5為上調(diào)，F(xiàn)C≤0.5為下調(diào)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.8 miRNA靶基因預(yù)測及其Pathway通路分析和GO分析

對miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，使用MIRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)，miRDB(http://mirdb.org/miRDB/)與TargetScan6.2(http://www.targetscan.org/vert_60/)進(jìn)行聯(lián)合分析。最后對3個(gè)軟件的預(yù)測結(jié)果取其交集。分析靶基因顯著富集的 Pathway信號通路，同時(shí)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)富集分析，P＜0.05 為顯著富集。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，對數(shù)據(jù)資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，若服從正態(tài)分布且方差齊時(shí)組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著差法(least significant difference，LSD)進(jìn)行檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用Dunnett’s T3法;若資料不服從正態(tài)分布，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Nemenyi法進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隔姜灸改善UC大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)損傷

NC組大鼠結(jié)腸組織黏膜上皮完整，表面無潰瘍，各層組織結(jié)構(gòu)清晰，腺體排列整齊，黏膜、黏膜下層未見充血水腫，無炎性細(xì)胞浸潤;UC組的大鼠結(jié)腸組織黏膜上皮缺失，有較大潰瘍面，黏膜層腺體減少，部分腺體形態(tài)異常，排列不整齊，有大量的淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，充血、水腫明顯;與UC組比較，GM組黏膜上皮較完整，少量腺體形態(tài)異常，排列欠整齊，黏膜下層可見少量的炎性細(xì)胞，未見明顯的充血、水腫。詳見圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察(HE染色，×200)

2.2 DSS誘導(dǎo)的UC結(jié)腸組織的差異表達(dá)miRNAs

通過測序分析，設(shè)定各組間 FC≥1.5為上調(diào)miRNAs，F(xiàn)C≤0.5為下調(diào) miRNAs，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。差異表達(dá)miRNAs的熱圖分析可直觀地觀察每個(gè)樣本之間的均一性和每組之間的表達(dá)差異，熱圖中可見各組兩個(gè)樣本的表達(dá)較為一致，兩組之間有明顯的差異。與NC組比較，UC組大鼠結(jié)腸組織差異表達(dá)miRNAs有45個(gè)，其中上調(diào)的有42個(gè)，下調(diào)的有3個(gè)，其中miRNA表達(dá)變化的差異倍數(shù)＞3的有4個(gè)，即miR-490-5p (FC=3.09)、miR-204-3p(FC=3.04)、miR-3585-3p(FC=14.72)、miR-378b(FC=5.88)。其中miR-3585-3p上調(diào)了14.72倍，是上調(diào)最大的miRNA。詳見圖2。

2.3 隔姜灸天樞穴改變UC大鼠的結(jié)腸組織中部分差異表達(dá)的miRNAs

熱圖中可見各組 3個(gè)樣本的表達(dá)較為一致，兩組之間有明顯的差異。與UC組比較，GM組的結(jié)腸組織差異表達(dá)miRNAs有8個(gè)，其中上調(diào)3個(gè)，下調(diào)5個(gè)。隔姜灸改變了UC大鼠結(jié)腸組織部分miRNAs的異常表達(dá)，其中下調(diào)的 miRNAs有 3個(gè)，即 miR-128-3p、miR-139-5p、miR-204-3p;上調(diào)的有5個(gè)，即miR-324-5p、miR-20a-5p、miR-17-5p、miR-18a-5p、miR-184。詳見圖3。

圖2 NC組與UC組結(jié)腸組織miRNA表達(dá)的熱圖

圖3 GM組與NC組結(jié)腸組織miRNA表達(dá)的熱圖

圖2和圖3中有3個(gè)共同差異表達(dá)的miRNAs，即miR-184、miR-139-5p和 miR-204-3p。其中miR-184在UC模型中下調(diào)，隔姜灸干預(yù)后上調(diào);miR-139-5p和miR-204-3p在UC模型中上調(diào)，隔姜灸干預(yù)后下調(diào)。詳見表1、表2。

表1 UC組與NC組結(jié)腸組織miRNA表達(dá)

表2 GM組與UC組結(jié)腸組織miRNA表達(dá)

2.4 隔姜灸逆轉(zhuǎn)UC結(jié)腸組織miRNAs靶基因的GO分析

對miR-184、miR-139-5p和miR-204-3p的預(yù)測靶基因進(jìn)行 GO分析的結(jié)果顯示，參與分子功能(molecular function)的基因有115個(gè)，主要涉及蛋白域的特異結(jié)合(protein domain specific binding)、磷酸酯水解酶活性(phosphoric ester hydrolase activity)和磷酸酶活性(phosphatase activity)等;參與細(xì)胞組成(Cellular Component)的基因有234個(gè)，主要涉及細(xì)胞骨架部分(cytoskeletal part)，細(xì)胞投射部分(cell projection part)，樹突(dendrite)等;參與生物過程(Biological Process)的基因有453個(gè)，主要涉及有機(jī)物質(zhì)運(yùn)輸(organic substance transport)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育(nervous system development)、神經(jīng)元分化(neuron differentiation)和細(xì)胞投射組織(cell projection organization)等。詳見圖4。

2.5 隔姜灸逆轉(zhuǎn) UC結(jié)腸組織 miRNAs相關(guān)靶基因Pathway分析

對miR-184、miR-139-5p和 miR-204-3p的預(yù)測靶基因進(jìn)行KEGG顯著富集通路分析的結(jié)果顯示，主要涉及的通路有25個(gè)，主要分為4大類，分別為細(xì)胞過程(cellular processes)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、人類疾病(human diseases)和有機(jī)體系統(tǒng)(organismal systems)。涉及的主要通路有cAMP信號通路、癌癥中的蛋白聚糖、癌癥中的microRNA、cGMP-PKG信號通路、AMPK信號通路、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。詳見圖5。

圖4 miRNAs相關(guān)靶基因的GO分析

圖5 miRNAs相關(guān)靶基因的Pathway分析

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種病因尚不十分明確、以結(jié)直腸黏膜連續(xù)性、彌漫性炎癥改變?yōu)樘攸c(diǎn)的慢性非特異性腸道炎癥性疾病[19]。臨床以持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的腹瀉、黏液膿血便伴腹痛、里急后重為主要表現(xiàn)[20]。UC可發(fā)生于任何年齡，青壯年期多見[21]，給患者帶來了巨大的精神壓力和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。艾灸作為中醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)療法，已被越來越多的患者接受和認(rèn)可。本課題組多年來研究灸法(溫和灸、隔藥餅灸和隔姜灸)對炎癥性腸病的作用，發(fā)現(xiàn)隔藥餅灸能改善UC患者腹痛、腹瀉及便血的癥狀，對UC患者療效確切[15-16，22]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，隔藥餅灸天樞穴能調(diào)節(jié)UC大鼠炎癥細(xì)胞因子、腸道菌群和腸黏膜免疫，抑制腸上皮細(xì)胞凋亡，達(dá)到修復(fù)UC結(jié)腸黏膜損傷和減輕炎癥反應(yīng)的作用[23-25]。本課題組也對隔藥餅灸和隔姜灸的療效進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)隔藥餅灸和隔姜灸天樞穴均是治療慢性UC的有效方法，兩者總體療效相當(dāng)[22]，這兩種灸法都可以通過調(diào)節(jié)黏蛋白的表達(dá)，起到修復(fù)UC大鼠結(jié)腸損傷的作用[26]。本研究也發(fā)現(xiàn)隔姜灸可以減輕UC大鼠的結(jié)腸炎癥。但是，目前隔姜灸治療UC的作用機(jī)制研究仍相對較少。

隨著基因芯片和高通量測序的發(fā)展，miRNA在 UC發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸被揭示，UC疾病相關(guān)的miRNAs可調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的趨化、轉(zhuǎn)錄因子的活性、腸上皮屏障功能和細(xì)胞自噬的活性[27-29]。因此，本課題組從miRNA的角度觀察DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸組織miRNA表達(dá)譜的變化及隔姜灸的調(diào)節(jié)作用，探討隔姜灸治療UC的作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸組織中表達(dá)改變的miRNAs有45個(gè)，其中上調(diào)42個(gè)，下調(diào) 3個(gè)。其中的 miR-126、miR-140、miR-214、miR-340、miR-532被早期研究發(fā)現(xiàn)在UC及其相關(guān)性癌變中有改變，2008年Wu F等[12]首次發(fā)現(xiàn)miR-126在活動(dòng)期 UC結(jié)腸組織中表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-126可以通過下調(diào)NF-κB信號通路的重要抑制因子IκB的表達(dá)促進(jìn)UC的炎癥反應(yīng)[30];miR-140能作用于其靶基因 HDAC4而克服抗結(jié)腸癌藥物的耐藥性[31]，其在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，并能通過靶向抑制TRAF6的表達(dá)減少LPS介導(dǎo)的人結(jié)直腸癌細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、COX-2的表達(dá)[32];miR-214被發(fā)現(xiàn)在 UC和結(jié)腸炎相關(guān)性癌變的結(jié)腸組織中表達(dá)均明顯上調(diào)，可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、STAT3的表達(dá)促進(jìn) IL-6的分泌，激活炎癥反應(yīng)[33];miR-340則在 UC患者外周血血清中表達(dá)升高[34];miR-532也與UC免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)，在活動(dòng)性和非活動(dòng)性的UC患者的外周血中表達(dá)均上調(diào)[35]。因此，上述5個(gè)miRNAs可能通過其特定的靶基因，影響炎癥因子的表達(dá)，從而參與了UC的病理過程，但具體的作用機(jī)制以及其余差異表達(dá)的miRNAs是否在UC中發(fā)揮作用還需進(jìn)一步的研究。

艾灸可以抑制 UC結(jié)腸炎癥，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用[36-37]。本課題組前期研究了隔藥灸天樞穴對UC大鼠結(jié)腸組織miRNA表達(dá)譜的影響，發(fā)現(xiàn)隔藥灸能上調(diào)UC中異常表達(dá)的miR-184，下調(diào)異常表達(dá)的miR-490-5p[18]。而在本研究中，隔姜灸能上調(diào)UC大鼠結(jié)腸中異常表達(dá)的 miR-184，下調(diào)異常表達(dá)的miR-139-5p和miR-204-3p，可見隔藥灸和隔姜灸對UC大鼠結(jié)腸miRNAs的調(diào)控具有共性和特性，這可能與隔物灸所用的間隔物不同有關(guān)。課題組重點(diǎn)關(guān)注了隔姜灸可調(diào)控的3個(gè) miRNAs。已有研究發(fā)現(xiàn) miR-139-5p的缺失可以使小鼠對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎具有更高的敏感性，并增強(qiáng)腸道腫瘤的形成[38]，miR-139-5p還可以通過抑制NF-κB的活性，調(diào)節(jié)慢性炎癥，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和入侵[39]。miR-204-3p在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)減少，它可以通過靶向 HMGA2抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲[40]。以上說明miR-139-5p和miR-204-3p具有抑制結(jié)腸炎相關(guān)性癌的作用，但它們在UC中的作用尚未見有報(bào)道。結(jié)合本研究的結(jié)果，課題組猜測miR-139-5p和miR-204-3p在結(jié)腸炎和結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌中的表達(dá)和作用可能是不同的。由于UC具有較高的發(fā)展為結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)[41]，慢性炎癥在向腫瘤的發(fā)展過程中涉及的機(jī)制十分復(fù)雜，可能會(huì)導(dǎo)致相關(guān)分子和物質(zhì)表達(dá)的改變。在炎癥過程中，LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中 miR-184的表達(dá)也降低[42]，這與本研究中UC炎癥條件下miR-184的表達(dá)降低是一致的。因此miR-139-5p、miR-204-3p和miR-184可能與UC的發(fā)展及艾灸的治療作用密切相關(guān)，但這幾個(gè)miRNAs在UC中的表達(dá)情況以及是如何發(fā)揮作用的還有待深入研究。

此外，通過對miR-184、miR-139-5p和miR-204-3p的預(yù)測靶基因的GO分析和KEGG富集通路分析，發(fā)現(xiàn)涉及的主要通路有cAMP信號通路、癌癥中的蛋白聚糖、癌癥中的microRNA、Cgmp-PKG信號通路、AMPK信號通路、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。綜上所述，隔姜灸可能通過調(diào)節(jié) UC結(jié)腸組織中 miR-139-5p、miR-204-3p和miR-184的異常表達(dá)，影響其靶基因的轉(zhuǎn)錄，繼而調(diào)控下游的相關(guān)炎癥信號通路，減少免疫炎癥因子的分泌和釋放，起到減輕DSS誘導(dǎo)的UC大鼠腸道炎癥的作用。后續(xù)將從表觀遺傳修飾—非編碼 RNA介導(dǎo)的基因沉默的角度，結(jié)合臨床研究、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證差異表達(dá)的 miRNAs，找出其直接調(diào)控的靶基因，并明確這些靶基因的功能和作用，這將有助于深入探討隔姜灸對UC的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。