陸嫄，顧沐恩，丁邦友，丁光宏，鄭寒丹，李璟，馬曉芃，吳璐一，李琪，黃艷，劉慧榮，吳煥淦

(1.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海 200030;2.復(fù)旦大學(xué)，上海 200433;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437;4.上海中醫(yī)藥大學(xué)針灸免疫效應(yīng)重點(diǎn)研究室，上海 201203)

結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌(colitis-associated cancer，CAC)是結(jié)直腸癌的一種亞型，與潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn’s disease，CD)等炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)相關(guān)[1]，其中UC發(fā)生癌變的幾率遠(yuǎn)高于其他人群，且隨病程延長發(fā)病率升高，病程 30年以上的UC患者CAC患病率高達(dá)33.2%[2]。

CAC是典型的炎癥介導(dǎo)的癌癥，結(jié)腸慢性炎癥是癌變的催化劑[3]。法國研究者觀察 P2X7R基因敲除對CAC小鼠的影響，研究發(fā)現(xiàn)，P2X7R基因敲除會導(dǎo)致TGFβ1的高表達(dá)、Treg細(xì)胞的募集以及TGFβ1介導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖，表明P2X7R在CAC早期進(jìn)展中發(fā)揮了腫瘤抑制作用[4]。P2X7R還能通過抑制GSK3β進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]。在CAC炎癥介導(dǎo)的癌癥中，Wnt/β-catenin信號通路可誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，與結(jié)腸組織腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，β-catenin是Wnt途徑中最為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)導(dǎo)子，參與結(jié)腸炎相關(guān)癌變[6]。抑制異常激活的Wnt/GSK3β/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，能延緩CAC進(jìn)展[7-9]。

目前 CAC的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，對阻遏結(jié)腸慢性炎癥進(jìn)展為CAC，也尚無明確的治療手段。筆者團(tuán)隊(duì)從事灸法治療IBD 30余年，明確了艾灸能有效減輕IBD結(jié)腸炎癥反應(yīng)，隔藥灸可下調(diào)UC中與癌變密切相關(guān)的p53和C-myc基因表達(dá)[10]。為了進(jìn)一步研究艾灸對CAC的治療作用，本研究從P2X7R和Wnt/β-catenin信號通路的角度，探討隔藥灸和隔姜灸對 CAC大鼠的干預(yù)效應(yīng)及效應(yīng)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)動物為近交系雄性清潔級 SD大鼠，體質(zhì)量(100±20)g，共 26只，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供[動物許可證號SCXK(滬)2012-0002]。將26只大鼠分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周，溫度控制在 18℃～22℃，濕度控制在 50%～70%，同時(shí)保持 12 h晝夜節(jié)律。實(shí)驗(yàn)中所有操作均遵循美國國立衛(wèi)生研究院及上海市實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的規(guī)定。

1.2 試劑與儀器

葡聚糖硫酸(DSS，分子量 36000～50000，MP biomedicals公司，美國);氧化偶氮甲烷(AOM，Sigma公司，美國);戊巴比妥鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國);RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS凝膠配制試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒、一抗二抗稀釋液(上海威奧生物科技有限公司，中國);RNA酶抑制劑、Trizol(Invitrogen公司，美國);兔抗大鼠一抗P2X7R(Sigma公司，美國);GAPDH抗體(CST公司，美國)。

組織脫水機(jī)、組織包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)、展片機(jī)(Leica公司，德國);小型Trans Blot轉(zhuǎn)印槽(Bio-Rad公司，美國);NanoDrop超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific公司，美國);凝膠成像系統(tǒng) GIS-1600(上海天能科技有限公司，中國);ABI ViiA 7 Real Time PCR System(Applied Biosystems公司，美國);光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.3 造模方法

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，將26只SD大鼠隨機(jī)分為正常組6只和造模組20只，參考Greten FR等[11]方法構(gòu)建CAC模型。每只造模大鼠腹腔注射AOM(10 mg/kg)，1周后予以反復(fù)3個(gè)周期的炎癥刺激(3%-2%-2%)。其中第1個(gè)周期，3%DSS自由飲水4 d后改用正常飲水17 d;第2周期，2%DSS自由飲水4 d后改用正常飲水17 d;第3個(gè)周期采用2%DSS自由飲水4 d后改用正常飲水至結(jié)束(見圖1)。每日稱量體質(zhì)量，觀察并記錄大鼠大體情況，造模結(jié)束隨機(jī)抽取2只麻醉后，沿著結(jié)腸系膜剖開肉眼下觀察腫瘤是否生成，以評價(jià)模型建立是否成功。

圖1 結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌大鼠模型構(gòu)建流程圖

1.4 分組方法

為了觀察隔藥灸和隔姜灸對大鼠CAC的干預(yù)作用，將18只CAC大鼠采用分層隨機(jī)法分為CAC組、隔藥灸組和隔姜灸組，每組6只。CAC組和正常組均不進(jìn)行任何干預(yù)，做與隔藥灸組和隔姜灸組相同的固定;隔藥灸組和隔姜灸組于造模結(jié)束后次日開始相應(yīng)干預(yù)，共干預(yù)30 d。

1.5 治療方法

取天樞(雙)、氣海穴，穴位定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12]。于造模結(jié)束當(dāng)日用實(shí)驗(yàn)動物專用除毛器將各治療組大鼠腹部天樞及氣海穴附近鼠毛剃除，第 2天起予以灸法干預(yù)。每日固定時(shí)間操作，室溫控制在(25±1)℃，相對濕度為(55±10)%RH，風(fēng)速≤1 m/s，操作前大鼠適應(yīng)環(huán)境20 min，盡可能避免不必要的干擾。

1.5.1 隔藥灸治療

將附子(四川)、肉桂(廣西)、木香(云南)等藥研末與黃酒調(diào)和，采用特制模具按壓成直徑 0.8 cm、厚0.4 cm的藥餅，在藥餅上放置艾炷(重量約90 mg)對相應(yīng)穴位進(jìn)行隔藥灸治療。每日1次，每次每穴灸2壯，每周6次，共灸30次。

1.5.2 隔姜灸治療

選用新鮮生姜，沿生姜纖維縱向切取直徑0.8 cm、厚0.4 cm的姜片，在姜片上放置艾炷(重量約90 mg)對相應(yīng)穴位進(jìn)行隔姜灸治療。每日1次，每次每穴灸2壯，每周6次，共灸30次。

1.6 動物標(biāo)本取材

2%戊巴比妥鈉(40～50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉成功后，將大鼠固定于解剖板上，自恥骨聯(lián)合處-盲腸取下約5 cm的結(jié)腸，沿腸系膜縱行剖開結(jié)腸，結(jié)腸予生理鹽水沖洗后，觀察結(jié)腸大體情況，肉眼觀察并記錄瘤體數(shù)量，剪下一段長約1 cm含瘤體的結(jié)腸，固定于 4%多聚甲醛中，剩下的結(jié)腸剪碎混合后平均分成 2份，置液氮1 h后，于﹣80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 大鼠一般情況觀察、DAI和成瘤率觀察

每日觀察各組大鼠一般情況，包括體質(zhì)量、毛色、活動度、大便性狀等。比較各組大鼠體質(zhì)量、疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)[13]和結(jié)腸成瘤率。DAI=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)＋糞便性狀分?jǐn)?shù)＋隱血分?jǐn)?shù))/3。

1.7.2 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

將含瘤體的結(jié)腸組織脫水、包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，展片烤片。取瘤體部位切片觀察。采用蘇木精伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色法染色。具體步驟如下，切片脫蠟至水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min，100%、90%、80%、70%梯度乙醇各5 min，雙蒸水漂洗5 min×2次，蘇木精染色液2 min，流水沖洗10 min，1%鹽酸乙醇分化約 5 s，流水沖洗 5 min，伊紅染色液 2 min，70%、80%、90%、100%梯度乙醇脫水各 8 s，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各15 min，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7.3 采用Western Blot法檢測P2X7R蛋白表達(dá)

取大鼠結(jié)腸組織剪碎后研磨，經(jīng)RIPA裂解、離心取上清等流程后，取部分上清蛋白用 BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜后加入5%BSA室溫封閉2 h，并加入封閉液稀釋的兔抗大鼠一抗P2X7R(1:1000)，4℃孵育過夜。TBST洗膜5 min×3次，后加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(1:2000)室溫孵育2 h，暗室中用X膠片感光、顯影、定影。采用P27XR與內(nèi)參GAPDH兩者灰度值的比值作為統(tǒng)計(jì)依據(jù)。

1.7.4 采用RT-qPCR法檢測C-myc、GSK3β、Wnt1和β-catenin的mRNA表達(dá)

大鼠結(jié)腸組織經(jīng)研磨后采用 Trizol裂解方法提取總 RNA，按順序加入試劑與反應(yīng)物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。擴(kuò)增引物序列見表1。反應(yīng)條件為95℃ 2 min，1個(gè)循環(huán);94℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃40 s，40個(gè)循環(huán)。采用2﹣△△Ct法對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到所有基因的Ct值后，根據(jù)公式△Ct值=目的基因Ct值－內(nèi)參基因Ct值，計(jì)算出每一個(gè)基因的△Ct值，然后用各組樣本的△Ct值減去模型組樣本的△Ct值，對所有數(shù)值取相反數(shù)，得到﹣△△Ct值，最后對﹣△△Ct值進(jìn)行2的冪運(yùn)算，即2-△△Ct值。

表1 引物堿基序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，若有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，則進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較;不符合正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)，用非參數(shù)檢驗(yàn)，若有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，則進(jìn)一步采用Dunnett’s T3法進(jìn)行組間兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察

干預(yù)結(jié)束后，正常組大鼠活動正常，反應(yīng)敏捷，皮毛柔順有光澤，大便正常;CAC組大鼠精神萎靡，皮毛蓬亂，松散易脫落，肛門處有鮮血，大便表面覆有鮮血;隔藥灸組、隔姜灸組大鼠皮毛欠光澤，活動略遲緩，便血量較CAC組有所減少，精神狀態(tài)有所改善。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量、DAl、結(jié)腸成瘤率比較

從圖2A、2B可見，與正常組相比，CAC組大鼠體質(zhì)量顯著降低，DAI顯著增高(P＜0.05);與CAC組相比，隔藥灸組和隔姜灸組大鼠體質(zhì)量均顯著增加，DAI顯著降低(P＜0.05)。圖 2C為大鼠結(jié)腸大體形態(tài)顯示，可見CAC組、隔藥灸組和隔姜灸組大鼠結(jié)腸瘤體形成。CAC組大鼠成瘤率83.3%，隔姜灸組為20.0%，隔藥灸組為 33.3%，CAC組大鼠成瘤率與隔姜灸組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示隔藥灸和隔姜灸均能顯著改善CAC大鼠體質(zhì)量降低、便血等一般情況，且隔姜灸對瘤體生長有一定的抑制作用。

2.3 大鼠結(jié)腸瘤體組織形態(tài)學(xué)觀察

由圖3可見，正常組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)清晰，結(jié)腸上皮組織完整，腺體排列整齊，黏膜固有層可見毛細(xì)血管和少量散在的淋巴細(xì)胞，無明顯的炎性細(xì)胞浸潤，未見充血、水腫等;CAC組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞排列較亂、大小不一、形態(tài)多樣、極性消失，細(xì)胞核大而濃染，核質(zhì)比例增大，核分裂增多，可見腺管共壁背靠背和篩樣結(jié)構(gòu)，高級別腺癌形成，腺腔內(nèi)多見脫落壞死的瘤細(xì)胞、浸潤的炎性細(xì)胞及呈團(tuán)狀的嗜酸性物質(zhì)(紅色箭頭標(biāo)示);隔藥灸組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞增生，排列不齊，炎性細(xì)胞浸潤和黏膜充血水腫程度較 CAC組減輕，可見異性增生。隔姜灸組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞增生，核濃染，淋巴細(xì)胞浸潤，固有腺體萎縮，異型增生與CAC組相比程度較低。

圖2 大鼠體質(zhì)量、DAl和結(jié)腸成瘤率比較

圖3 大鼠結(jié)腸組織HE染色(×200)

2.4 大鼠結(jié)腸組織P2X7R蛋白表達(dá)

由圖4可見，與正常組相比，P2X7R在CAC組大鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與CAC組相比，P2X7R在隔藥灸組和隔姜灸組大鼠結(jié)腸中的表達(dá)均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006，P=0.003)，提示隔藥灸和隔姜灸能顯著上調(diào) CAC大鼠結(jié)腸異常表達(dá)的P2X7R蛋白。

2.5 大鼠結(jié)腸組織mRNA表達(dá)

由圖5可見，與正常組相比，C-myc、β-catenin、GSK-3β、Wnt1 mRNA在CAC組大鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與CAC組相比，C-myc mRNA在隔藥灸組和隔姜灸組大鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，β-catenin、GSK-3β、Wnt1 mRNA在隔姜灸組大鼠結(jié)腸組織中表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖4 大鼠結(jié)腸組織P2X7R蛋白表達(dá)

結(jié)果提示隔藥灸和隔姜灸對 CAC大鼠Wnt/β-catenin通路發(fā)揮了負(fù)性調(diào)控作用，隔姜灸對異常高表達(dá)的β-catenin、GSK-3β、Wnt1 mRNA下調(diào)趨勢優(yōu)于隔藥灸。

圖5 大鼠結(jié)腸組織C-myc、β-catenin、GSK-3β、Wnt1 mRNA表達(dá)

3 討論

嘌呤受體P2X7R廣泛參與炎癥反應(yīng)，在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織表達(dá)增加，在結(jié)腸炎相關(guān)癌變的腫瘤中也有表達(dá)[4]。P2X7R是腫瘤傳送ATP信號的中央控制節(jié)點(diǎn)，以其為核心的 P2X7/PIDK/AKT軸和 P2X7/AMPK/PRAS40/mTOR信號軸調(diào)控腫瘤的生長與自噬，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞存活與死亡之間的平衡[14]。研究表明，P2X7R在小鼠CAC進(jìn)展過程中具有一定的抑制作用。使用P2X7R拮抗劑可減緩CAC小鼠的體質(zhì)量增長，促進(jìn)腸道腫瘤的形成，降低小鼠生存率;而P2X7R激動劑則表現(xiàn)出對CAC小鼠腸道腫瘤形成的抑制作用[15]。本研究結(jié)果顯示，P2X7R在CAC組大鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)顯著低于正常組，經(jīng)隔藥灸和隔姜灸干預(yù)后，CAC大鼠結(jié)腸組織中 P2X7R的表達(dá)上調(diào)，提示隔藥灸和隔姜灸可能通過激活CAC大鼠結(jié)腸中P2X7R的表達(dá)，起到抑制結(jié)腸腫瘤生長的作用。

CAC是涉及多基因、多信號通路的復(fù)雜過程。Wnt/β-catenin信號通路在結(jié)腸上皮再生和腫瘤發(fā)展中至關(guān)重要。Wnt通路調(diào)控β-catenin磷酸化、β-catenin核內(nèi)異常轉(zhuǎn)錄介導(dǎo) CAC發(fā)生[6]。有研究表明，P2X7R還能通過抑制 GSK3β進(jìn)而抑制 Wnt/β-catenin通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]。在結(jié)腸炎癥介導(dǎo)的癌癥 CAC中，C-myc、Wnt、β-catenin均屬促癌基因，抑制異常激活的Wnt/GSK3β/β-catenin通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可延緩 CAC腫瘤進(jìn)展[7-9]。生理?xiàng)l件下，β-catenin的活性受到嚴(yán)格的控制，在病理狀態(tài)下可因腫瘤抑制基因APC的滅活導(dǎo)致對β-catenin的控制解除，繼而活化NF-κB信號，對結(jié)直腸癌的形成具有重要作用[16]。本研究結(jié)果表明，隔姜灸在 CAC大鼠的 Wnt/β-catenin通路中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，主要表現(xiàn)在抑制 Wnt家族中Wnt1和β-catenin的異常高表達(dá)，這可能是隔姜灸干預(yù)CAC的效應(yīng)機(jī)制之一。β-catenin的氨基末端含有數(shù)個(gè) GSK-3β磷酸位點(diǎn)，羥基末端有活化相應(yīng)靶基因轉(zhuǎn)錄的功能，中間區(qū)域含有 APC蛋白、T細(xì)胞因子(TCF)結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng) APC-Axin-GSK3β降解復(fù)合體形成受阻，導(dǎo)致β-catenin無法磷酸化使其泛素化降解，在胞漿內(nèi)聚積，并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與 TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，作用于下游C-myc等基因的啟動子上，導(dǎo)致相關(guān)基因的表達(dá)異常，促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生[17]。值得注意的是，GSK-3β是一種功能復(fù)雜的多功能激酶，在腫瘤的進(jìn)程中有雙向調(diào)節(jié)的作用[18]。作為促瘤因子或是抑瘤因子取決于腫瘤的類型、發(fā)展階段、遺傳背景[19]。本研究結(jié)果中，GSK-3β mRNA在CAC組大鼠結(jié)腸組織表達(dá)顯著高于正常組，經(jīng)隔姜灸干預(yù)后表達(dá)顯著降低，提示隔姜灸可能通過抑制GSK-3β的表達(dá)，起到延緩CAC大鼠結(jié)腸腫瘤生長進(jìn)程的作用。

本次研究設(shè)置了兩種干預(yù)方法，即隔藥灸和隔姜灸。兩種灸法均是臨床治療IBD等腸腑病癥的常用灸法[20-22]。本研究結(jié)果顯示，兩種灸法在效應(yīng)和機(jī)制部分均有共通之處，也有所差異。相同點(diǎn)為隔藥灸和隔姜灸對CAC大鼠體質(zhì)量、DAI均有顯著的改善作用，均能上調(diào)CAC大鼠結(jié)腸組織P2X7R蛋白表達(dá)，下調(diào)C-myc mRNA水平;不同點(diǎn)為隔姜灸干預(yù)后大鼠結(jié)腸成瘤率顯著降低，隔姜灸組大鼠結(jié)腸組織β-catenin、GSK-3β、Wnt1 mRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)。提示隔姜灸可能是通過對 CAC大鼠的 P2X7R、Wnt/β catenin通路異常激活進(jìn)行調(diào)節(jié)發(fā)揮作用。隔藥灸和隔姜灸均為艾灸療法，均有溫?zé)嵛锢泶碳ぃ鞓泻蜌夂Ｑň苷{(diào)節(jié)胃腸功能，艾灸天樞和氣?？擅黠@減輕潰瘍性結(jié)腸炎的腸道炎癥反應(yīng)，故在結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌中也選擇了天樞、氣海。所以兩種灸法均可一定程度上抑制腫瘤的生長，均能抑制促癌基因C-myc的表達(dá)，調(diào)節(jié)嘌呤受體P2X7R的表達(dá)。兩種灸法均為隔物灸，所隔物質(zhì)不同，可能導(dǎo)致其作用機(jī)制不盡相同。

綜上所述，隔藥灸、隔姜灸均能顯著改善CAC大鼠一般情況，對炎癥介導(dǎo)的結(jié)腸腫瘤生長具有一定的抑制作用。本研究采用AOM誘導(dǎo)，3%-2%-2% DSS多個(gè)濃度的刺激制備CAC模型，在CAC大鼠結(jié)腸組織中發(fā)現(xiàn)特征性癌變，在隔藥灸和隔姜灸組均見到腫瘤和異型增生等組織形態(tài)學(xué)變化，但未見癌變，說明艾灸療法能不同程度抑制炎癥介導(dǎo)的腫瘤生長。在前期觀察到艾灸能抑制P53和促癌基因C-myc表達(dá)的基礎(chǔ)上，切入炎癥和炎癥相關(guān)性癌變中均有重要生物學(xué)功能的嘌呤受體P2X7R，發(fā)現(xiàn)艾灸能促進(jìn)CAC大鼠結(jié)腸組織P2X7R蛋白表達(dá)以及抑制C-myc的異常表達(dá)。在隔姜灸組，還發(fā)現(xiàn)隔姜灸可能抑制了異常激活的 Wnt/GSKβ-β/catenin信號通路。由于本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳爸粰z測了該通路中4個(gè)關(guān)鍵蛋白的mRNA表達(dá)，后續(xù)研究將進(jìn)一步開展蛋白檢測，擬闡釋艾灸在 CAC大鼠 Wnt/GSKβ-β/catenin信號通路中的作用。本研究僅采用常規(guī)的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和方法研究，尚未從P2X7R深入探討艾灸對CAC大鼠的作用機(jī)制。為了能更明確說明艾灸對炎癥介導(dǎo)腫瘤的作用機(jī)制，今后研究的方向一方面要切入 DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎，明確P2X7R在炎癥中的作用;另一方面，在 AOM-DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎相關(guān)性癌變中，將采用P2X7R的激動劑和抑制劑，結(jié)合P2X7R基因敲除小鼠反向驗(yàn)證，從多個(gè)方面說明艾灸對炎癥和炎癥相關(guān)性腫瘤的效應(yīng)機(jī)制。