陳宏亮 程 倩 孫藝華 王 超 柏 方 張 鵬 張明迪 林 清 吳克瑾△

（1復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院乳腺外科，2病理科 上海 200011；3同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院放療科 上海 200072）

促性腺激素釋放激素受體（gonadotropin releasing hormone receptor，GnRH-R）最初被發(fā)現(xiàn)分布于腺垂體。GnRH 類似物（GnRH analogs，GnRHa）通過(guò)與垂體的GnRH-R 結(jié)合，從而抑制垂體促性腺激素的生成，使得卵巢性腺激素水平處于絕經(jīng)后的狀態(tài)，發(fā)揮藥物去勢(shì)的作用?；谶@一作用機(jī)制，GnRHa已被廣泛應(yīng)用于輔助生育技術(shù)、治療青春性早熟、性激素依賴性疾病，如子宮內(nèi)膜異位癥等。在激雌素受體（estrogen receptor，ER）陽(yáng)性的乳腺癌中，GnRHa 通過(guò)藥物去勢(shì)作用加強(qiáng)了內(nèi)分泌治療。隨著SOFT、TEXT、ASTRA 等大型Ⅲ期隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)結(jié)果的陸續(xù)公布，明確了在口服內(nèi)分泌藥物的基礎(chǔ)上加上GnRHa 卵巢功能抑制（ovarian function suppression，OFS）能夠顯著提高絕經(jīng)前中高危患者的生存率［1-3］。而GnRHa 在激素受體陰性乳腺癌中的應(yīng)用主要是在化療中抑制卵巢功能從而降低化療致卵巢早衰的風(fēng)險(xiǎn)［4］。這兩種應(yīng)用都是基于GnRHa對(duì)于下丘腦-垂體-卵巢性腺軸的抑制作用。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)在腺垂體以外的組織中亦有GnRH-R 的表達(dá)［5］。研究發(fā)現(xiàn)，在許多生殖系統(tǒng)腫瘤中，如子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、前列腺癌等，存在GnRH-R 的充分表達(dá)［6-10］；而在其他一些非生殖系統(tǒng)腫瘤中，如黑色素瘤、胰腺癌、結(jié)腸癌等，也存在GnRH-R 的表達(dá)［11-14］。腫瘤細(xì)胞表達(dá)的 GnRH-R 與分布于垂體的GnRH-R 在構(gòu)象與信號(hào)傳導(dǎo)通路方面都存在著顯著的差異［15-16］。許多腫瘤細(xì)胞株的體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，GnRHa 通過(guò)與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的GnRH-R 相互作用，發(fā)揮著抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、新生血管生成等作用［17-18］。

關(guān)于乳腺癌組織中GnRH-R 的表達(dá)狀況以及臨床意義，目前文獻(xiàn)報(bào)道較少。本文旨在分析乳腺癌GnRH-R 表達(dá)狀況及其與臨床病理因素的相關(guān)性，并進(jìn)一步探討不同亞型乳腺癌中GnRH-R 的表達(dá)與生存預(yù)后的相關(guān)性。

資料和方法

組織標(biāo)本收集2013 年至2018 年在復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院以及同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院行手術(shù)的787 例早期乳腺癌病理組織標(biāo)本，包括656例浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織以及131 例癌旁組織的石蠟組織塊。所有乳腺癌組織對(duì)應(yīng)的病例要求臨床病理資料以及隨訪數(shù)據(jù)完整。所有患者均簽署留取組織標(biāo)本的知情同意書(shū)，術(shù)前均未接受放化療或內(nèi)分泌治療。定義 ER、PR≥10% 陽(yáng)性為 ER、PR 陽(yáng)性表達(dá)。

免疫組化染色及分析所有組織樣本經(jīng)10%甲醛溶液固定、常規(guī)石蠟包埋、4 μm 切片，制成組織芯片。經(jīng)脫蠟，檸檬酸緩沖液（pH 6.0）修復(fù)，3%過(guò)氧化氫甲醇溶液去內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，10%正常兔血清封閉。一抗采用抗GnRH-R 抗體（英國(guó)Abcam公司，ab183079），二抗采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體（武漢塞維爾生物科技有限公司，GB23303）。DAB 顯色液顯色，蘇木精染液復(fù)染細(xì)胞核。蘇木精染細(xì)胞核為藍(lán)色，DAB 顯出的陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色。GnRH-R 表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。掃描組織芯片，圖片掃描完成后使用Quant center 分析軟件自動(dòng)識(shí)別計(jì)算組織切片上所有點(diǎn)的H-score評(píng)分（陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量及其染色強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的數(shù)值）。所有點(diǎn)的免疫組化H-score 評(píng)分由低至高排序，前50%的定義為GnRH-R 低表達(dá)，后50%的定義為高表達(dá)。

隨訪采用門診就診或電話隨訪。隨訪時(shí)間為手術(shù)診斷乳腺癌之日起至末次隨訪時(shí)間或腫瘤復(fù)發(fā)或死亡。隨訪截止日期為2018 年12 月31 日。無(wú)病生存期（disease free survival，DFS）指從手術(shù)診斷乳腺癌之日起至第一次發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或任何原因的死亡。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗(yàn)，通過(guò)單因素分析篩選出GnRH-R 高表達(dá)的相關(guān)因素。采用Logistic 回歸多因素分析篩選GnRH-R 高表達(dá)的獨(dú)立相關(guān)因子。生存分析采用Kaplan-Meier 法，采用Log-Rank 檢驗(yàn)比較兩組間無(wú)病生存率。采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

臨床病理資料與GnRH-R 的表達(dá)狀況本項(xiàng)研究共納入2013 年至2018 年間診斷的乳腺癌病理組織樣本656 例以及癌旁組織131 例。所有病例診斷時(shí)均無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，接受全乳切除術(shù)或保乳手術(shù)，平均年齡57 歲（23～89 歲）。52.3%的病例腫塊最大徑≤2 cm，53.4%的病例腋窩淋巴結(jié)陰性，50.3%的病例組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)，17.5%的病例伴脈管淋巴管侵犯（lymphovascular invasion，LVI）陽(yáng)性，3.2%為多灶性病灶。65.5%的病例ER 陽(yáng)性，49.7%的病例 PR陽(yáng)性 ，23.3%的病例HER2過(guò)表達(dá) 、5 6.7%HER2 陰性，另20.0%的病例HER2 狀態(tài)不明。免疫組化檢測(cè)表明，癌組織中GnRH-R 的高表達(dá)率顯著高于癌旁組織（54.0%vs.28.2%，P＜0.001）；而在ER 陰性的病例中，GnRH-R 高表達(dá)率顯著高于ER陽(yáng)性的病例（65.3%vs.48.0%，P＜0.001）（圖1）。

圖1 GnRH-R 在乳腺癌及癌旁組織中的表達(dá)（×40）Fig 1 The expression of GnRH-R in breast cancer and paracancerous tissue（×40）

GnRH-R 表達(dá)率的相關(guān)因素分析根據(jù)單因素χ2檢驗(yàn)，GnRH-R 高表達(dá)的患者中，N0 期的比例較高，ER、PR、LVI 陰性的比例較高、Ki-67 高表達(dá)的比例亦較高。此外，多灶性病變的比例呈相對(duì)較低的趨勢(shì)。將單因素分析中P＜0.2 的因子納入多因素Logistic 回歸分析中，可以得出，較低的N 分期、LVI 陰性以及高Ki-67 是GnRH-R 高表達(dá)的獨(dú)立相關(guān)因素（表1，Hosmer-LemeshowP=0.024）。

GnRH-R 與乳腺癌生存預(yù)后分析為了確保足夠的隨訪時(shí)間，我們將2018 年前診斷的537 例乳腺癌樣本納入生存分析。中位隨訪時(shí)間為32 個(gè)月（1～70 個(gè)月）。其中，63 例患者發(fā)生疾病的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。在整體樣本中，GnRH-R 高表達(dá)與低表達(dá)患者的DFS 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log RankP=0.132）（圖2）。但是在ER 陰性的患者，GnRH-R 高表達(dá)的患者較低表達(dá)的患者DFS 顯著改善（Log RankP=0.023），而在 ER 陽(yáng)性的患者中，兩者的 DFS 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log RankP=0.676，圖3）。

圖2 GnRH-R 高表達(dá)與低表達(dá)乳腺癌患者的無(wú)病生存曲線Fig 2 Kaplan-Meier curves of DFS between breast cancer patients with GnRH-R high expression and low expression

表1 乳腺癌患者GnRH-R 表達(dá)相關(guān)的臨床病理特征以及多因素Logistic 相關(guān)性分析Tab 1 Clinical-pathological characteristics related with expression of GnRH-R in patients with breast cancer and multiple Logistic analysis［n（%）］

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織表達(dá)GnRH-R 顯著高于癌旁組織，且GnRH-R 在激素受體陰性乳腺中的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于激素受體陽(yáng)性的腫瘤。ER 陰性乳腺癌中，GnRH-R 高表達(dá)的腫瘤生存率顯著高于GnRH-R 低表達(dá)腫瘤，提示在ER 陰性乳腺癌中，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的GnRH-R 可能成為潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。

目前已知GnRH-R 在許多生殖系統(tǒng)腫瘤中充分表達(dá)，如卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等。腫瘤細(xì)胞表達(dá)的GnRH-R 與垂體系統(tǒng)GnRH-R 的作用機(jī)制有所不同［15，19］。腫瘤細(xì)胞表達(dá)的 GnRH-R 同樣為 7 次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，但是α亞基為αi亞基［16］。GnRH-R 激活后可增強(qiáng)胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸酶的活性，抑制下游一系列生長(zhǎng)因子樣受體如EGFR、IGFR 等的磷酸化過(guò)程，從而阻斷下游促腫瘤進(jìn)展的信號(hào)通路［16］；亦或通過(guò)激活下游 p38、JNK 等信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［20］。因此，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的GnRH-R 與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成等生物學(xué)行為密切相關(guān)，是潛在的治療靶點(diǎn)［17-18］。

圖3 GnRH-R 高表達(dá)與低表達(dá)乳腺癌患者的亞組無(wú)病生存曲線Fig 3 Subgroups Kaplan-Meier curves of DFS between breast cancer patients with GnRH-R high expression and low expression

GnRH-R 在乳腺癌基礎(chǔ)研究方面的報(bào)道比較有限，主要集中在三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）。Buchholz 等［21］通過(guò)臨床組織樣本分析，報(bào)道約74% TNBC 表達(dá)GnRH-R，從而提示GnRH-R 可能是TNBC 極具潛力的治療靶點(diǎn)。本文通過(guò)大樣本研究發(fā)現(xiàn)半數(shù)以上的乳腺癌組織高表達(dá)GnRH-R，顯著高于癌旁組織，而且在激素受體陰性的腫瘤中GnRH-R 的表達(dá)率更高，這與文獻(xiàn)的報(bào)道基本一致。Buchholz 等［21］同時(shí)通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)GnRHa 可顯著抑制表達(dá)GnRH-R 的TNBC 細(xì)胞增殖，并促使處于細(xì)胞周期S 期的腫瘤細(xì)胞比例顯著下降。Schubert 等［22］在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)GnRHa可顯著抑制裸鼠TNBC 移植瘤的生長(zhǎng)，這種抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性效應(yīng)；而且GnRHa 通過(guò)作用于GnRH-R 能夠顯著抑制動(dòng)物體內(nèi)肺和骨轉(zhuǎn)移灶的形成，但對(duì)于其中可能的機(jī)制未做深入探討 。 Gründker 等［23］的研究進(jìn)一步表明GnRHa可顯著抑制wnt 通路中的生物標(biāo)志物如S100A4 及 CYR61 的表達(dá)，從而抑制 TNBC 細(xì)胞的侵襲性及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究觀察到GnRH-R高表達(dá)的腫瘤中，腋窩淋巴結(jié)腫瘤負(fù)荷相對(duì)較低、LVI 陽(yáng)性比例亦較低，提示乳腺癌GnRH-R 高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞侵襲、遷徙能力可能受到抑制，值得進(jìn)一步開(kāi)展干預(yù)性實(shí)驗(yàn)及機(jī)制研究。

本文同時(shí)觀察到，GnRH-R 高表達(dá)患者中Ki-67指數(shù)相對(duì)較高，這一點(diǎn)似乎與上述發(fā)現(xiàn)不符。Ki-67反映腫瘤的增殖活性，通常認(rèn)為，Ki-67 高的腫瘤增殖較快，對(duì)于化療也相對(duì)敏感。但是，Ki-67 的判讀具有一定的主觀性，也缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。在最新的AJCC 乳腺癌分期中，預(yù)后分期納入了一些生物學(xué)指標(biāo)，如ER、PR、HER2、組織學(xué)分級(jí)，但沒(méi)有納入Ki-67，可能與Ki-67 判定標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一以至于預(yù)后意義不確切有關(guān)。此外，Ki-67 與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并無(wú)明確相關(guān)性。Thangarajah 等［24］指出，術(shù)前 Ki-67指數(shù)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移沒(méi)有顯著相關(guān)性（P=0.403）。至于GnRH-R 與Ki-67 的相關(guān)性，一方面需要進(jìn)一步積累病例擴(kuò)大樣本量并采用更為客觀的判讀標(biāo)準(zhǔn)（如人工智能讀取方法）加以分類，另一方面，有必要開(kāi)展相關(guān)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)以明確兩者之間相關(guān)性的機(jī)制。

在乳腺癌的臨床研究方面，尚缺乏對(duì)于腫瘤組織GnRH-R 檢測(cè)的研究，而且也沒(méi)有研究探討GnRHa 的應(yīng)用與腫瘤組織GnRH-R 表達(dá)的相關(guān)性。本文中，腫瘤組織GnRH-R 的表達(dá)狀況對(duì)總體人群的預(yù)后沒(méi)有顯著影響，尤其是激素受體陽(yáng)性的病例。這可能是由于激素受體陽(yáng)性的腫瘤預(yù)后相對(duì)較好，復(fù)發(fā)時(shí)間通常較晚，而本文的隨訪時(shí)間相對(duì)較短，故難以觀察到生存期的顯著差異。另一方面，對(duì)于激素受體陽(yáng)性的腫瘤，GnRHa 主要是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合腺垂體GnRH-R 發(fā)揮藥物去勢(shì)的作用，以加強(qiáng)絕經(jīng)前中高?；颊叩膬?nèi)分泌治療，從而提高生存率。因此，對(duì)于這部分腫瘤很難在脫離內(nèi)分泌治療的基礎(chǔ)上來(lái)研究GnRHa 作用于腫瘤細(xì)胞GnRH-R 的效應(yīng)。

對(duì)于激素受體陰性的乳腺癌，GnRHa 主要應(yīng)用于化療期間卵巢功能保護(hù)。在POEMS 臨床試驗(yàn)中，應(yīng)用 GnRHa 的患者 DFS 和 OS 有所改善［4］。韓國(guó)的一項(xiàng)回顧性研究也提示新輔助化療聯(lián)合GnRHa 較單用新輔助化療顯著提高激素受體陰性乳腺癌的 pCR 率［25］。結(jié)合 GnRH-R 在激素受體陰性腫瘤中有著較高的表達(dá)率，提示上述研究中體現(xiàn)的GnRHa 抗腫瘤效應(yīng)可能與腫瘤細(xì)胞GnRH-R 的表達(dá)有關(guān)。本文ER 陰性乳腺癌亞組中，觀察到GnRH-R 高表達(dá)的患者預(yù)后顯著改善。盡管這可能與GnRH-R 高表達(dá)患者的腋窩淋巴結(jié)腫瘤負(fù)荷較低有關(guān)，但至少提示值得在激素受體陰性乳腺癌中探究GnRH-R 表達(dá)的意義以及潛在的抗腫瘤機(jī)制。

本文通過(guò)大樣本的觀察性研究，發(fā)現(xiàn)激素受體陰性乳腺癌中GnRH-R 高表達(dá)的比例較高，而且GnRH-R 高表達(dá)的患者預(yù)后較好。此外，GnRH-R高表達(dá)與患者腋窩淋巴結(jié)低腫瘤負(fù)荷以及LVI 陰性存在相關(guān)性。關(guān)于GnRH-R 的上游調(diào)控機(jī)制、GnRH-R 表達(dá)與腫瘤侵襲遷徙性抑制的內(nèi)在機(jī)制、GnRHa 作用與腫瘤細(xì)胞GnRH-R 后產(chǎn)生的腫瘤表型改變以及可能涉及的信號(hào)通路等，都值得進(jìn)一步開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究。