曹宜青 沈小雁 曹 涵 康宏艷 樂云辰 梁 棟 郁韻秋△

（1復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室 上海 201203；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院瑞金醫(yī)院皮膚科 上海 200025；3無錫生物制劑（上海）有限公司 上海 201203）

皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤（cutaneous T-cell lymphoma，CTCL）是一種由T 淋巴細(xì)胞克隆浸潤引起，以皮膚病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的非霍奇金淋巴瘤。臨床上CTCL常見的亞型有蕈樣肉芽腫、Sezdry 綜合征和原發(fā)性皮膚外周 T 細(xì)胞淋巴瘤［1］。CTCL 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，其臨床表型與炎癥性皮膚病相似，早期診斷困難［2］。目前CTCL 的主要診斷方式是組織病理學(xué)活檢、分子分析和外周血染色體檢查，缺少非侵入性檢查手段［3］。

代謝組學(xué)是“組學(xué)領(lǐng)域”的重要組成部分，通過對(duì)生物體內(nèi)代謝物的定性和定量分析來尋找代謝物與生理病理變化的相關(guān)關(guān)系［4］。近年來，多組學(xué)技術(shù)已被用于CTCL 的診斷，比如利用基因組學(xué)分析 診 斷 CTCL［5-6］。 LC/MS 和 GC/MS 是代 謝 組 學(xué)分析中應(yīng)用最廣泛的兩種分析方法，兩者識(shí)別出的差異代謝物既有區(qū)別又有聯(lián)系。我們基于GC/MS和LC/MS 對(duì)CTCL 人血樣進(jìn)行研究，結(jié)果顯示CTCL 的發(fā)病機(jī)制與磷脂異常有關(guān)［7］，進(jìn)一步考慮進(jìn)行皮膚組織樣本的分析，但由于人病變組織不易獲得，因此本研究采用CTCL 荷瘤鼠的血漿和腫瘤組織分別進(jìn)行GC/MS 的代謝組學(xué)分析，并對(duì)LC/MS［8］和 GC/MS 找出的差異代謝物進(jìn)行對(duì)比、分析和關(guān)聯(lián)，從而為進(jìn)一步研究CTCL 提供依據(jù)。

材料和方法

試劑和細(xì)胞甲醇、乙腈（HPLC 級(jí)）、肝素鈉購自上海國藥控股化學(xué)試劑有限公司；正庚烷購自阿拉丁生化科技有限公司（上海）；十三酸、吡啶（HPLC 級(jí)）、甲氧基胺鹽酸鹽、N-甲基-N-（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（MSTFA）、三甲基氯硅烷（TMCS）、RPMI 1640 培養(yǎng)基（ATCC 302001）、HH細(xì)胞（T cell Lymphoma ATCC CRL-2105）、青霉素-鏈霉素溶液（SV30010，10 000 U/mL 青霉素：10 000 U/mL鏈霉素）、胎牛血清（F2442-500 mL）和二甲亞砜（色譜純）購自美國SigmaAldrich 公司。

CTCL 異種移植小鼠HH 細(xì)胞培養(yǎng)和CTCL異種移植小鼠模型與本課題組前期研究［8］相同。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理標(biāo)準(zhǔn)要求。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：倫藥批第（2018-12-YF-YYQ-01）號(hào)。對(duì)照組：健康小鼠（n=5）；實(shí)驗(yàn)組：CTCL 荷瘤鼠（n=16）。取小鼠眼眶血，加肝素鈉抗凝，1 600×g離心10 min，留取血漿。

HH 細(xì)胞皮下注射于雌性裸鼠的右側(cè)腋下，小鼠皮膚組織分別取自對(duì)照組小鼠的右腋下皮膚，實(shí)驗(yàn)組小鼠皮膚腫瘤組織近端（荷瘤鼠右腋下）、腫瘤組織遠(yuǎn)端（荷瘤鼠左腋下）和腫瘤組織。

血漿處理取血漿50 μL 至離心管，室溫下解凍 15 min，加 200 μL 的-20 ℃ 甲醇（含 40 μg/mL 十三烷酸），渦旋 5 min，靜置 10 min，12 000×g下離心15 min，取上清液40 ℃下氮?dú)獯蹈桑瑲堄辔镅苌?2 000 ×g下離心 5 min，上清液轉(zhuǎn)至 GC/MS 進(jìn)行分析。

組織處理向EP 管加入-20 ℃甲醇和小鼠組織（1 mg∶50 μL），渦旋5 min，超聲10 min，電子組織勻漿器（60 Hz，300 s）中勻漿，12 000×g下離心15 min，取 600 μL 上清，加入 400 μL 甲醇（40 μg/mL十三烷酸），渦旋5 min，靜置10 min，12 000×g下離心 15 min，取 900 μL 上清液 40 ℃下氮?dú)獯蹈?，衍生? h，12 000×g下離心 5 min，上清液轉(zhuǎn)至 GC/MS進(jìn)行分析。

GC/MS 分析Agilent 7890B 氣相色譜儀（含7693 自動(dòng)進(jìn)樣器）和5977A 四極質(zhì)量分析儀。色譜柱：DB-5 MS 熔融石英毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25 μm，美國 Agilent 公司）。程序升溫：初始 70 ℃保持 3 min，之后 5 ℃/min 升至 300 ℃保持 5 min。氦氣載氣流量：1.2 mL/min；進(jìn)樣體積：1 μL；分流比：2∶1；入口溫度：300 ℃；界面溫度：280 ℃；離子源溫度：230 ℃。

數(shù)據(jù)采集及處理通過MassHunter定性分析軟件（B.06.00）將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為mzData 格式，轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)上傳到XCMS-Online（https：//xcmsonline.scripps.edu）進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，峰對(duì)齊和保留時(shí)間校正。峰強(qiáng)度校正后，使用“80%規(guī)則”篩選數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)預(yù)處理 后 用 SIMCA 13（Umetrics，Sweden）進(jìn) 行 統(tǒng) 計(jì)分析。

將篩選出的代謝物上傳至NIST 數(shù)據(jù)庫和人類代謝組數(shù)據(jù)庫（HMDB，http：//www.hmdb.ca）進(jìn)行比對(duì)，部分采用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行結(jié)構(gòu)驗(yàn)證。使用熱圖（GraphPad）分析以觀察不同組之間差異代謝物的變化。通過Medcalc 軟件構(gòu)建接受者操作特征曲線（ROC）以評(píng)估差異代謝物的靈敏度和特異性。采用 MetaboAnalyst 3.0（http：//www.metaboanalyst.ca/）進(jìn)行差異代謝物的代謝通路分析。

結(jié) 果

原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制和TIC 圖所有血漿樣品和組織樣品的保留時(shí)間偏差分別為4 s 和1.2 s，說明所采用的分析方法（包括色譜條件）具有良好的重現(xiàn)性（圖1、2）。原始數(shù)據(jù)包括含有1 704 個(gè)特征離子的21 個(gè)血漿樣本，含有1 016 個(gè)特征離子的50 個(gè)組織樣本，數(shù)據(jù)過濾后，得到1 047 個(gè)和653 個(gè)特征離子。

圖1 對(duì)照組與CTCL 組小鼠血漿樣品和組織樣品的保留時(shí)間偏差Fig 1 Retention time deviation plots of plasma and tissue samples of mice in control group and CTCL group

圖2 CTCL 組小鼠血漿和組織樣品的重疊TICFig 2 The overlapping TICs of plasma and tissue samples in mice of CTCL group

數(shù)據(jù)的多變量統(tǒng)計(jì)分析在血漿樣品的CTCL組和對(duì)照組間，PCA 分離不明顯，其R2X=0.474，Q2=0.204（圖 3A）；PLS-DA 分離明顯，其 R2X=0.314，R2Y=0.944，Q2=0.576（圖 3B）；OPLS-DA 分離 明顯，其 R2X=0.630，R2Y=1.000，Q2=0.672（圖 3C）。200 次交叉排列驗(yàn)證結(jié)果表明，PLS-DA 分析模型具有可靠的預(yù)測能力（R2：0，0.809；Q2：0，-0.003 73）（圖3D）。

圖3 對(duì)照組與CTCL 組小鼠血漿PCA、PLS-DA 及OPLS-DA 分析Fig 3 PCA，PLS-DA and OPLS-DA analysis of plasma of mice in control group and CTCL group

在組織樣品中，PCA 顯示腫瘤組和其他3 組間有顯著差異（R2X=0.868，Q2=0.721），但是對(duì)照組與腫瘤組織遠(yuǎn)端（荷瘤鼠左腋下）間差異不大。為消除小鼠的個(gè)體差異，進(jìn)一步觀察CTCL 小鼠自身的腫瘤組織和腫瘤組織遠(yuǎn)端（荷瘤鼠左腋下）。PCA（R2X=0.748，Q2=0.618）、PLS-DA（R2X=0.531，R2Y=0.955，Q2=0.916）和 OPLS-DA（R2X=0.613，R2Y=0.977，Q2=0.939）的得分圖和擬合參數(shù)均顯示出腫瘤組織遠(yuǎn)端組和腫瘤組有明顯分離（圖4）。對(duì) PLS-DA 進(jìn)行 200 次交叉檢驗(yàn)驗(yàn)證，R2（0，0.350）和Q2（0，-0.304）表明該模型無過度擬合（圖4）。

血漿和組織樣品中差異代謝物的篩選與結(jié)構(gòu)驗(yàn)證根據(jù)OPLS-DA 模型中的VIP值，t檢驗(yàn)的P值和FC值（VIP≥1，P≤0.05 和FC≥1.5）選擇差異代謝物（表1、2）。在血漿樣品中共有29 種差異代謝物（其中兩種在HMDB 中不存在），21 種經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品得以驗(yàn)證，在組織樣品中共有33 種差異代謝物（其中一種在HMDB 中不存在），25 種經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品得以驗(yàn)證。其中13 種差異代謝物（L-纈氨酸，L-絲氨酸，L-亮氨酸，甘油，L-異亮氨酸，L-苯丙氨酸，3-磷酸甘油，D-葡萄糖，阿拉伯糖，肌醇，亞油酸，硬脂酸，膽固醇）同時(shí)存在于血漿和組織樣品中（圖5）。

在血漿樣品中CTCL 組的乳酸和大部分氨基酸增加；油酸、硬脂酸、1-十六烷酸酯甘油和膽固醇明顯減少（圖6）。在組織樣品中腫瘤組的3-磷酸甘油，鄰磷酸乙醇胺和L-天冬氨酸顯著增加；大部分氨基酸含量減少（圖7）。

血漿和組織樣品中差異代謝物的ROC 分析對(duì) 62 種差異代謝物作 ROC 分析（表3、4）：在血漿樣品中，肉豆蔻酸的AUC 值為1，表明肉豆蔻酸具有最高的特異性和靈敏度（圖8）；在組織樣品中，多種差異代謝物的AUC 值為1（圖9）。

圖4 CTCL 小鼠自身的腫瘤組織和腫瘤組織遠(yuǎn)端的PCA、PLS-DA 及OPLS-DA 分析Fig 4 PCA，PLS-DA and OPLS-DA analysis of tumor tissue and tumor tissue distal end in CTCL mice

圖5 CTCL 小鼠血漿樣品和腫瘤組織樣品中檢測到的差異代謝物數(shù)據(jù)的Venn 圖Fig 5 Venn diagrams presenting data for differential metabolites detected in plasma samples and tumor tissue samples of CTCL mice detected by GC/MS and LC/MS respectively

血漿和組織樣品中差異代謝物的Pathway 分析支鏈氨基酸（BCAA）和甘油磷脂代謝被認(rèn)為是血漿和組織樣品中最相關(guān)的代謝途徑（圖10）。

討 論

多平臺(tái)多樣本數(shù)據(jù)相互補(bǔ)充和印證GC/MS和LC/MS 是目前代謝組學(xué)分析的主流技術(shù)平臺(tái)。本研究采用GC/MS 分析平臺(tái)，對(duì)CTCL 荷瘤鼠的血漿和腫瘤組織樣品進(jìn)行代謝組學(xué)分析，并將研究結(jié)果和課題組之前的研究結(jié)果［8］進(jìn)行比較（圖5），結(jié)果表明：血漿中的膽固醇同時(shí)在LC/MS 和GC/MS中出現(xiàn)，腫瘤組織中黃嘌呤和7 種氨基酸（L-天冬酰胺、L-賴氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酸）同時(shí)在 LC/MS 和 GC/MS 分析平臺(tái)中出現(xiàn)。LC/MS 和GC/MS 兩種分析平臺(tái)對(duì)該類差異代謝物的分析均能達(dá)到較高的靈敏度，表明這兩種分析方法不僅可以互補(bǔ)，還可以進(jìn)行有效的相互驗(yàn)證。此外，由于代謝組學(xué)涉及的化合物性質(zhì)差異較大，不同的分析平臺(tái)檢出的種類不同，如GC/MS 可檢出乳酸和葡萄糖，LC/MS 可檢出PC類和MG 類，采用多平臺(tái)技術(shù)可以增加差異代謝物的覆蓋面，因此在以后的研究中可以考慮將兩種分析方法結(jié)合以獲得更多的信息。

表1 通過GC/MS 篩選出對(duì)照組與CTCL 組小鼠血漿樣品中的差異代謝物Tab 1 Identification of differential metabolites among the plasma samples of mice in control group and CTCL group by GC/MS

由于代謝途徑不同，在血漿和腫瘤組織中會(huì)出現(xiàn)不同的差異代謝物，我們又將血漿和腫瘤組織樣品的分析結(jié)果進(jìn)行了比較，共同差異代謝物有13種，分別占血漿差異代謝物和腫瘤組織差異代謝物的48.3% 和42.3%；涉及的共同通路有BCAA 代謝、半乳糖代謝、亞油酸通路和甘油磷脂代謝。說明血漿和腫瘤組織樣品不僅可以單獨(dú)反映CTCL的局部代謝，兩種樣品之間的差異代謝物還較為相關(guān)。不同樣本得到的差異代謝物在種類和數(shù)量上不完全相同，如在GC/MS 平臺(tái)中單甘脂和棕櫚酸等15 種差異代謝物只在血漿樣本中出現(xiàn)，尿酸和磷酸乙醇胺等19 種差異代謝物只在腫瘤組織樣本中出現(xiàn)。

表2 通過GC/MS 篩選出CTCL 小鼠自身的腫瘤組織和腫瘤組織遠(yuǎn)端樣品中的差異代謝物Tab 2 Identification of differential metabolites among tumor tissue samples and tumor tissue distal end samples in CTCL mice by GC/MS

CTCL 小鼠血漿和腫瘤組織中BCAA 異常BCAA（包括纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸）在血漿中上調(diào)并在腫瘤組織中下調(diào)，這表明BCAA 在CTCL的惡性T 細(xì)胞增殖過程中被轉(zhuǎn)運(yùn)和消耗，以適應(yīng)更高的蛋白質(zhì)合成速率。異常BCAA 是CTCL 小鼠血漿和腫瘤組織最重要的代謝特征。

圖6 對(duì)照組與CTCL 組小鼠血漿樣品中代謝物的熱圖分析Fig 6 Heatmap of metabolites in plasma samples of mice in control group and CTCL group

圖7 CTCL 小鼠自身的腫瘤組織和腫瘤組織遠(yuǎn)端組中代謝物的熱圖Fig 7 Heatmap of metabolites in tumor tissue group and tumor tissue distal end group in CTCL mice

表3 對(duì)照組和CTCL 組小鼠血漿樣品中差異代謝物的ROC 數(shù)據(jù)Tab 3 ROC results for differential metabolites in plasma samples of mice in control group and CTCL group

圖8 對(duì)照組與CTCL 組小鼠血漿樣品中部分AUC ＞0.9 的差異代謝物的ROCFig 8 The ROC of differential metabolites with AUC ＞0.9 in plasma samples of mice in control group and CTCL group

圖9 CTCL 小鼠自身的腫瘤組織和腫瘤組織遠(yuǎn)端組樣品中部分AUC＞0.9 的差異代謝物的ROCFig 9 The ROC of differential metabolites with AUC ＞0.9 in CTCL mice of tumor tissue and tumor tissue distal end

BCAA（尤其是亮氨酸）可通過激活 mTORC1［9］刺激骨骼肌蛋白形成。同時(shí)亮氨酸會(huì)降低AMP 激酶（AMPK）活性，從而引發(fā)胰島素抵抗和癌癥［10］。在本研究中，亮氨酸在血漿中明顯升高，在組織中明顯減少，表明BCAA 可能激活mTORC1 并引發(fā)CTCL（圖11）。

CTCL 小鼠血漿和腫瘤組織中3-磷酸甘油上調(diào)血漿和腫瘤組織中增加的3-磷酸甘油可能導(dǎo)致細(xì)胞膜降解或惡性T 細(xì)胞形態(tài)變化。小鼠血漿中3-磷酸甘油的升高與課題組之前的研究結(jié)果［8］相一致。

CTCL 小鼠血漿中葡萄糖上調(diào)體內(nèi)葡萄糖含量也會(huì)影響mTORC1［10］的活性。血漿中葡萄糖的升高會(huì)抑制AMPK 通路，從而減輕TCS1/TSC2 復(fù)合物的抑制功能并激活mTORC1［11］。同樣，葡萄糖也可以通過降低亮氨酸等AMPK 激酶的活性來激活mTORC1［12］。在本研究中，血漿中葡萄糖含量增加，意味著葡萄糖激活mTORC1，同時(shí)參與癌細(xì)胞的Warburg 效應(yīng)，而血漿中乳酸含量增加也驗(yàn)證了這一點(diǎn)［13］；腫瘤組織中葡萄糖含量降低，可認(rèn)為葡萄糖通過糖酵解被消耗并轉(zhuǎn)化為乳酸（圖11）。

圖11 基于CTCL 小鼠血漿和腫瘤組織中BCAA 異常假設(shè)的CTCL 小鼠代謝通路Fig 11 Hypothetical metabolic pathways based on BCAA abnormalities in plasma and tumor tissues of CTCL mice

CTCL 小鼠血漿o-磷酸乙醇胺被降解我們之前的研究已顯示：組織中鞘氨醇-1-磷酸酯（S1P）增加會(huì)促使磷酸戊糖途徑與核苷酸代謝相互作用，且與CTCL 腫瘤組織大小顯著相關(guān)（Pearson 相關(guān)系數(shù)ρ=0.64）［8］。本研究顯示，血漿中 S1P 降解的 o-磷酸乙醇胺含量也增加，不同樣本（血漿和皮膚）的研究結(jié)果表明S1P 和o-磷酸乙醇胺的異?？赡芘cCTCL關(guān)系密切。