朱文文， 趙 娜， 劉北星

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室,遼寧 沈陽(yáng) 110122)

乳腺癌是全世界婦女中最常見的癌癥類型，相關(guān)研究報(bào)告顯示，我國(guó)乳腺癌發(fā)病率及死亡率逐年上升，對(duì)女性生命健康造成嚴(yán)重威脅[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的最主要原因，而轉(zhuǎn)移通常發(fā)生在淋巴結(jié)、肺、肝臟等組織[2]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中，細(xì)胞因子發(fā)揮重要作用。細(xì)胞因子除能調(diào)控固有應(yīng)答和適應(yīng)性應(yīng)答外，也可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及影響損傷組織修復(fù)。例如，一些細(xì)胞因子能通過自分泌或者旁分泌的形式直接干預(yù)腫瘤細(xì)胞的行為從而影響腫瘤進(jìn)展[3-4]；另一方面，細(xì)胞因子還能通過影響其他類型的細(xì)胞，例如癌旁的上皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞以及免疫細(xì)胞，影響癌細(xì)胞與宿主之間的關(guān)系，重塑腫瘤微環(huán)境，發(fā)揮促癌或者抑癌的作用[5-8]。近年來，Th1和Th2型細(xì)胞因子與腫瘤免疫的關(guān)系越來越受到人們的重視。研究發(fā)現(xiàn)，Th1型細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，是機(jī)體抗腫瘤免疫的主要方式，所產(chǎn)生的Th1型細(xì)胞因子IFN-γ具有較強(qiáng)的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，而Th2型細(xì)胞主要介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，所分泌的細(xì)胞因子如IL-4、IL-5、IL-10、IL-13可削弱機(jī)體對(duì)腫瘤所產(chǎn)生的免疫清除等作用，腫瘤患者體內(nèi)呈現(xiàn)的Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答是腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸的機(jī)制之一[9-10]。正常情況下，Th1和Th2處于相對(duì)平衡的狀態(tài)，這對(duì)于維持機(jī)體的免疫功能十分重要，體內(nèi)Th1和Th2型細(xì)胞因子的失衡會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂，進(jìn)而發(fā)生疾病，如癌癥、艾滋病以及自身免疫性疾病[11-14]。因此，在乳腺癌肺轉(zhuǎn)移過程中，勢(shì)必會(huì)造成Th1和Th2型細(xì)胞因子變化趨勢(shì)不同。在研究過程中，動(dòng)物模型是乳腺癌研究的基礎(chǔ)。目前，移植瘤乳腺癌模型、乳腺癌細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因工程小鼠常用于乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型, 而尾靜脈、皮下和乳墊原位是移植瘤乳腺癌模型常用的接種部位[15]。在以往的文獻(xiàn)中，對(duì)于乳腺癌的基礎(chǔ)研究，其移植瘤乳腺癌模型的建立一般都使用單一的接種部位，目前還未見文獻(xiàn)報(bào)道在兩種不同的建模途徑下，乳腺癌肺轉(zhuǎn)移過程中體內(nèi)Th1/Th2型細(xì)胞因子的變化是否不同。為明確乳腺癌肺轉(zhuǎn)移過程中Th1/Th2型細(xì)胞因子的變化趨勢(shì)，本研究利用兩種不同的轉(zhuǎn)移模型，通過HE染色、墨汁染色、Real-time RT-PCR等技術(shù)，探討在由皮下接種腫瘤細(xì)胞與尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致的乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的情況下，不同時(shí)間點(diǎn)小鼠體內(nèi)IFN-γ、IL-13、IL-5、IL-4等細(xì)胞因子表達(dá)量的變化趨勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 6～8周齡雌性BALB/c鼠，購(gòu)自遼寧本溪長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)2周后用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.1.2 細(xì)胞株 小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞株，用含10%FBS及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.1.3 試劑 RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa生物工程有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備 CO2恒溫培養(yǎng)箱(HERAcell 150i，美國(guó)Thermo公司)；超高速制冷離心機(jī)(MULTIFUGE X3R，美國(guó)Thermo公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems ABI 7500,美國(guó)ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建 收集4T1細(xì)胞，PBS清洗1次，PBS稀釋至1×107細(xì)胞/mL，取100 μL細(xì)胞懸液通過尾靜脈和皮下分別接種于BABL/c小鼠，每只小鼠接種1×106個(gè)4T1細(xì)胞，制作小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型。尾靜脈和皮下分別接種9只，另設(shè)置2只空白對(duì)照。接種后每天給小鼠稱重觀察。

1.2.2 確立模型建立成功 分別在接種后第0、7、14、21天取出小鼠的肺組織后做HE染色和墨汁染色，確定腫瘤轉(zhuǎn)移灶。

1.2.3 Real-time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子 用RNAisoplus試劑盒提取肺組織總RNA，PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒說明，采用Real-time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)接種第7、14、21天肺組織局部Th1/Th2型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)：IL-4-F：5′-TGTACCAGGAGCCATATCCA-3′,IL-4-R：5′-TTCTTCGTTGCTGTGAGGAC-3′;IL-5-F：5′-GGCTTCCTGTCCCTACTCAT-3′,IL-5-R：5′-TCCTCGCCACACTTCTCTTT-3′;IL-13-F：5′-AGCATGGTATGGAGTGTGGA-3′,IL-13-R：5′-TTGCAATTGGAGATGTTGGT-3′;IFN-γ-F：5′-TATCTGGAGGAACTGGCAAA-3′,IFN-γ-R：5′-GGTGTGATTCAATGACGCTT-3′;β-actin-F：5′-GGTCATCACTATTGGCAACG-3′,β-actin-R：5′-TCCATACCCAAGAAGGAAGG-3′。在ABI 7500系統(tǒng)下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果表示為2-ΔΔCT(fold change，即實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù))，ΔΔCT=實(shí)驗(yàn)組(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)-對(duì)照組(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型的建立

小鼠尾靜脈注射4T1細(xì)胞后第7天取肺組織，HE染色發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)灶(圖1A)，提示尾靜脈接種4T1細(xì)胞的乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型成功建立。

圖1 荷瘤鼠肺轉(zhuǎn)移Fig.1 Lung metastasis of tumor-bearing miceA:尾靜脈注射第7天肺組織及皮下荷瘤第7天腫瘤組織；B: 肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)及數(shù)量；ND:未發(fā)現(xiàn)A: Lung tissues on day 7 after tail vein injection and tumor tissues on day 7 after subcutaneous inoculation；B: Lung metastasis nodules and nodules number；ND：not found

皮下原位注射4T1細(xì)胞后第7天，注射局部發(fā)現(xiàn)明顯腫瘤塊。分離腫瘤組織后做HE切片染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)灶(圖1A)。然而皮下接種4T1細(xì)胞的模型鼠，在接種后第7天及第14天，肺組織內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤浸潤(rùn)灶及肺結(jié)節(jié)(圖1B)。但皮下接種后第21天，模型鼠肺組織表面看到大量結(jié)節(jié)(圖1B)，證實(shí)皮下注射4T1細(xì)胞也能發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。

2.2 不同途徑接種4T1細(xì)胞后小鼠體重及生存率的變化

接種4T1細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)稱量小鼠體重，發(fā)現(xiàn)皮下接種組的小鼠在21 d內(nèi)體重變化與正常小鼠并無太大區(qū)別，相反，尾靜脈注射組的小鼠從第13天開始體重出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)(圖2A)，同時(shí)開始出現(xiàn)死亡。在尾靜脈接種后21 d內(nèi)，所有接種鼠全部死亡(圖2B)。在此期間，皮下接種鼠無一例死亡，提示接種途徑不同，對(duì)BALB/c鼠生存期限和預(yù)后有明顯影響。

圖2 荷瘤鼠體重(A)及生存率(B)的變化 Fig.2 Body weight (A) and survival (B) of tumor-bearing mice.

2.3 乳腺癌模型鼠肺組織內(nèi)Th1/Th2型細(xì)胞因子表達(dá)水平

機(jī)體Th1/Th2應(yīng)答在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用,Th1/Th2型細(xì)胞因子的變化趨勢(shì)一定程度上反映了機(jī)體的免疫應(yīng)答類型。本研究提取了模型鼠肺組織總RNA，Real-time RT-PCR結(jié)果顯示，尾靜脈注射4T1的小鼠，其肺組織內(nèi)Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-13表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯遞增趨勢(shì)(圖3 A、B)。與Th2型細(xì)胞因子變化趨勢(shì)不同，Th1型細(xì)胞因子IFN-γ雖在接種后第7天表達(dá)量有所升高，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖3D)，提示隨著腫瘤的發(fā)展，機(jī)體出現(xiàn)Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答。而優(yōu)勢(shì)的Th2型應(yīng)答可能與模型鼠體重下降，進(jìn)而發(fā)生死亡密切相關(guān)(尾靜脈注射4T1細(xì)胞的BALB/c鼠21 d內(nèi)全部死亡)。

提取皮下接種4T1細(xì)胞的小鼠肺組織總RNA，Real-time RT-PCR結(jié)果顯示，其IL-5、IL-4、IL-13等細(xì)胞因子的表達(dá)趨勢(shì)與尾靜脈組趨勢(shì)基本一致，但表達(dá)水平均較尾靜脈組低。與尾靜脈組不同的是IFN-γ在第7天表達(dá)量并未升高，此后也一直保持在低水平，但總體趨勢(shì)均在下降。

對(duì)比兩種途徑在第7天細(xì)胞因子表達(dá)水平，結(jié)果顯示尾靜脈組IL-13、IL-4、IFN-γ表達(dá)水平明顯高于皮下接種組，提示尾靜脈注射組轉(zhuǎn)移速度快，腫瘤在第7天便轉(zhuǎn)移到肺，引起肺部強(qiáng)烈免疫應(yīng)答，此時(shí)皮下荷瘤鼠肺組織內(nèi)免疫應(yīng)答尚不強(qiáng)烈。但在第14天，兩種接種方式的模型鼠肺組織內(nèi)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平已無明顯差異。

圖3 荷瘤鼠肺組織內(nèi)Th1/Th2型細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化Fig.3 The relative expression of mRNAs for IL-13 (A), IL-4 (B), IL-5 (C), and IFN-γ(D) in the lungs of tumor-bearing mice與正常對(duì)照組相比,* P<0.05, ** P<0.01；與皮下接種組相比，# P<0.05, ## P<0.01；ND:未檢測(cè) * Significant difference (P<0.05), ** significant difference (P<0.01), compared with the normal control group;# Significant difference (P<0.05), ## significant difference (P<0.01), compared with the subcutaneous inoculation group;ND:not measured

3 討 論

免疫應(yīng)答在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[16]。腫瘤微環(huán)境中存在各種類型的免疫細(xì)胞如CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK等，這些免疫細(xì)胞可通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子，影響腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移及血管新生[17]。

包括IL-5、IL-13、IL-4在內(nèi)的多種Th2型細(xì)胞因子參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過程，文獻(xiàn)報(bào)道，在乳腺癌組織內(nèi)，IL-13的表達(dá)較癌周組織明顯升高[18]，另外，其高親和力受體IL-13Rα2，作為誘導(dǎo)受體在乳腺癌中高表達(dá)，IL-13Rα2的耗竭可適度延緩原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)，還可顯著抑制體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移[19]。本研究觀察到IL-13在肺組織內(nèi)表達(dá)水平隨著接種時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，提示IL-13可能參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移。而IL-13作為Th2型免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞因子，其升高一定程度上意味著肺組織內(nèi)Th2應(yīng)答增加。并且，與皮下接種組相比，尾靜脈注射組在第7天時(shí)IL-13表達(dá)水平明顯升高，此后一直處于高水平，最后尾靜脈組小鼠出現(xiàn)死亡，而皮下接種組并未出現(xiàn)死亡小鼠，提示小鼠死亡也許與Th2高應(yīng)答有關(guān)。

IL-5在癌癥中的具體作用還不明了，研究表明，與ER+乳腺癌相比，ER-乳腺癌患者血液中IL-5水平明顯增高[20]，腫瘤間質(zhì)IL-5的高水平分泌與乳腺癌患者的預(yù)后不良有關(guān)[21]，但其在乳腺癌中的具體作用機(jī)制尚不明確。有文獻(xiàn)報(bào)道，在膀胱癌患者腫瘤組織內(nèi)IL-5水平明顯升高，升高的IL-5主要是通過ERK1/2介導(dǎo)的MMP-9/NF-κB/AP-1途徑作用于膀胱癌細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲[22]。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)IL-5信號(hào)的缺失以及中和IL-5會(huì)促進(jìn)黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移，究其原因可能與IL-5缺失導(dǎo)致嗜酸細(xì)胞肺浸潤(rùn)減少，進(jìn)而削弱了機(jī)體抗腫瘤免疫有關(guān)[23]。本研究建立的乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型中，無論是皮下接種還是尾靜脈注射，IL-5在肺組織內(nèi)表達(dá)水平一直沒有明顯改變，那么IL-5在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中是否發(fā)揮作用，是抑瘤還是促瘤作用，尚需進(jìn)一步研究。

IL-4在乳腺癌尤其是惡性乳腺癌中的表達(dá)明顯升高，Rohani等[24]認(rèn)為IL-4能加速乳腺癌的進(jìn)展，并且與乳腺癌的死亡率有關(guān)，本研究的確觀察到在乳腺癌發(fā)展過程中，IL-4水平逐漸升高，并且在體重開始明顯下降的時(shí)間點(diǎn)其水平升高的更明顯，之后很快便出現(xiàn)了小鼠的死亡，據(jù)Venmar等[25]報(bào)道，其機(jī)制也許是因?yàn)槿橄侔┘?xì)胞表面表達(dá)高水平的IL-4R,而IL-4可以結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的IL-4R,從而激活JAK/STAT6信號(hào)通路。Zhang等研究顯示，STAT6高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞相比STAT6缺失型其凋亡率下降, 且STAT6過表達(dá)細(xì)胞系中表達(dá)更多的抗凋亡蛋白, 說明STAT6的活化抑制凋亡[26]，提示IL-4通過JAK/STAT6信號(hào)通路對(duì)腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移起促進(jìn)作用。本研究中IL-4表達(dá)水平的升高，推測(cè)也有可能是通過這條信號(hào)通路發(fā)揮作用，但還不清楚，需要進(jìn)一步探討。

IFN-γ作為Th1型細(xì)胞因子，具有抗炎的作用[11]，本研究在接種開始，尾靜脈注射組的BALB/c鼠IFN-γ水平呈現(xiàn)上升狀態(tài)，隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠體內(nèi)乳腺癌的進(jìn)展，IFN-γ水平逐漸下降，但在皮下接種組，其水平一直處于明顯的低水平狀態(tài)，推測(cè)也許是因?yàn)槠は陆臃N的4T1細(xì)胞進(jìn)入機(jī)體后，在皮下局部逐漸浸潤(rùn)發(fā)展，進(jìn)展較慢，還不足以引發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，而在乳腺癌發(fā)展過程中，Th1應(yīng)答是逐漸朝著低水平發(fā)展的，所以在皮下注射組的BALB/c鼠中IFN-γ一直處于低水平。

在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中，Th1型細(xì)胞因子在一開始升高，發(fā)揮著抗炎的作用，但隨著時(shí)間的推移，Th2型應(yīng)答逐漸占優(yōu)勢(shì)，形成了促進(jìn)腫瘤發(fā)展的免疫微環(huán)境，Th2型細(xì)胞因子也都逐漸升高，在兩種模型中并無明顯差別。本研究利用BALB/c鼠，通過兩種不同的模型，證實(shí)了乳腺癌肺轉(zhuǎn)移過程中小鼠體內(nèi)Th1/Th2型細(xì)胞因子是朝著相反的趨勢(shì)改變，并且最后以Th2型應(yīng)答占優(yōu)勢(shì)。