徐子涵，商瑋，趙智明，沈俊逸，劉春麗，蔡輝

作者單位：東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，江蘇 南京210002

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（類風(fēng)關(guān)）是一種慢性炎癥性自身免疫疾病，以小關(guān)節(jié)滑膜異常增殖、血管翳形成與骨侵蝕為其主要病理特點(diǎn)［1］。類風(fēng)關(guān)常見關(guān)節(jié)屈伸不利、紅腫焮熱，肌肉酸楚疼痛、麻木不仁，屬中醫(yī)“痹癥”范疇［2］。五痹湯是中醫(yī)治療痹癥的名方，出自于《太平惠民和劑局方》，書中記載：“五痹湯，治風(fēng)寒濕邪，客留肌體，手足緩弱，麻痹不仁；或氣血失順，痹滯不仁，并皆治之?！保?］本方以筋骨酸痛，更以上肢肩臂為甚、舉動(dòng)不便為辨證要點(diǎn)。佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型是研究類風(fēng)關(guān)的主要?jiǎng)游锬Ｐ椭唬?］。本研究于2017年3—5月通過觀察五痹湯對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足爪腫脹度、關(guān)節(jié)炎癥、踝關(guān)節(jié)病理及關(guān)節(jié)滑液腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）水平的影響，探討五痹湯對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療效果及潛在機(jī)制，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面為五痹湯治療類風(fēng)關(guān)提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD大鼠40只，周齡范圍為8～10周，體質(zhì)量范圍為160～180 g，由東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2017-0003，本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.2藥品與試劑五痹湯濃縮液：由姜黃15 g、羌活15 g、白術(shù)15 g、防己15 g，炙甘草6 g組成，東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院制劑科配制成濃縮液，每克含生藥量1.32 g。甲氨蝶呤混懸液：甲氨蝶呤片（上海信誼藥廠有限公司，生產(chǎn)批號(hào)170113）研呈細(xì)末，與0.9%氯化鈉溶液配制成甲氨蝶呤混懸液，濃度為0.1 mg/mL。TNF-α試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)公司，生產(chǎn)批號(hào)BA1205），IL-1β試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)公司，生產(chǎn)批號(hào)BA1122），弗氏完全佐劑（美國(guó)Sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)160811）。

1.3佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的制備將大鼠固定后剔除尾根部毛發(fā)，75%乙醇消毒，于尾根部皮下注射0.1 mL弗氏完全佐劑，建成佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型［5］。

1.4分組與干預(yù)按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為四組（每組各10只）：健康組、模型組、五痹湯組和甲氨蝶呤組。健康組大鼠于尾根部皮下注射0.1 mL 0.9%氯化鈉溶液，其余三組均制備佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型。造模9 d后，健康組和模型組以0.9%氯化鈉溶液2毫升/只灌胃。參照“人與動(dòng)物體表面積計(jì)算法”制定給藥劑量，五痹湯組以五痹湯濃縮液6 g·kg-1·d-1灌胃，甲氨蝶呤組每周予以甲氨蝶呤混懸液1 mg/kg灌胃，未用藥的實(shí)驗(yàn)日給予0.9%氯化鈉溶液2毫升/只灌胃，各組均連續(xù)灌胃14 d。

1.5測(cè)定足爪腫脹度致炎前用足容積測(cè)量?jī)x測(cè)量每只大鼠右后足容積，從炎癥出現(xiàn)后，每隔3天（d9、d12、d15、d18、d21、d23）測(cè)量右后足容積，足爪腫脹度結(jié)果用△mL＝|注射后的足爪容積-注射前的足爪容積|［6］。

1.6關(guān)節(jié)炎癥程度的評(píng)估從炎癥出現(xiàn)后，分別于d9、d12、d15、d18、d21、d23進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）評(píng)分，評(píng)定關(guān)節(jié)炎程度（0～4分）。0分：無關(guān)節(jié)炎；1分：關(guān)節(jié)有紅色斑點(diǎn)或輕度腫脹；2分：關(guān)節(jié)中度紅腫；3分：關(guān)節(jié)重度紅腫；4分：關(guān)節(jié)嚴(yán)重紅腫且不能負(fù)重［7］。

1.7病理學(xué)觀察于最后一次灌胃后1 h處死大鼠，切取右側(cè)踝關(guān)節(jié)，4%多聚甲醛固定后，10%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣，不同濃度梯度乙醇逐級(jí)脫水，浸蠟、包埋、切片，隨后進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。光學(xué)顯微鏡觀察組織病理變化，并進(jìn)行病理評(píng)分（包括滑膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵蝕、血管翳形成、炎癥和骨質(zhì)侵蝕）［6］，病理評(píng)分越高表明關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)的破壞越嚴(yán)重。

1.8血清和關(guān)節(jié)滑液TNF-α、IL-1β的測(cè)定縱行切開大鼠左側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)皮膚，暴露膝關(guān)節(jié)，打開膝關(guān)節(jié)腔，用0.9%氯化鈉溶液1 mL沖洗關(guān)節(jié)腔，收集關(guān)節(jié)滑液［8］。大鼠血清和關(guān)節(jié)滑液TNF-α、IL-1β水平的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（ELISA）法。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。觀測(cè)資料主要是計(jì)量資料，以x±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-wayANOVA），兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1對(duì)足爪腫脹度的影響結(jié)果見表1。造模后d9，模型組、五痹湯組和甲氨蝶呤組雙側(cè)足爪出現(xiàn)明顯的腫脹，d18達(dá)到峰值，之后各組大鼠足爪腫脹度逐漸降低。建立模型后，甲氨蝶呤組大鼠的足腫脹與模型組相比在d18后有所減輕（P＜0.05）。與模型組相比，五痹湯組大鼠d21開始足腫脹緩解（P＜0.05），與甲氨蝶呤組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足爪腫脹度/（mL，±s）

表1佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足爪腫脹度/（mL，±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05

組別模型組五痹湯組甲氨蝶呤組F值P值d23 0.67±0.30 0.41±0.29a 0.36±0.17a 4.094 0.028鼠數(shù)10 10 10 d9 0.41±0.26 0.50±0.34 0.45±0.33 0.209 0.813 d12 0.56±0.33 0.58±0.47 0.53±0.29 0.046 0.956 d15 0.62±0.49 0.60±0.32 0.58±0.33 0.027 0.974 d18 0.89±0.38 0.64±0.12 0.50±0.45a 3.241 0.055 d21 0.75±0.20 0.54±0.11a 0.49±0.19a 6.474 0.005

2.2對(duì)AI評(píng)分的影響造模后d9模型組有不同程度的關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，隨著病程的延長(zhǎng)，AI指數(shù)逐漸升高，d18達(dá)到峰值，隨后逐漸降低。與模型組相比，五痹湯組與甲氨蝶呤組大鼠AI評(píng)分明顯降低，從d18起差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。五痹湯組與甲氨蝶呤組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但從均值分析來看，甲氨蝶呤組AI評(píng)分更低，表明五痹湯和甲氨蝶呤均有緩解關(guān)節(jié)炎癥的作用，而后期甲氨蝶呤的治療效果更佳（表2）。

2.3對(duì)踝關(guān)節(jié)病理評(píng)分的影響踝關(guān)節(jié)切片HE染色結(jié)果顯示，健康組大鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整，滑膜組織無充血與水腫，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑。模型組大鼠可見滑膜組織水腫，并可見小血管形成，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜細(xì)胞增生，血管翳形成，局部滑膜組織造成軟骨損傷和骨侵蝕。模型組大鼠踝關(guān)節(jié)切片病理評(píng)分明顯增高，與健康組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。五痹湯組與甲氨蝶呤組大鼠踝關(guān)節(jié)病理評(píng)分均低于模型組（P＜0.05）。見表3。

2.4對(duì)血清和關(guān)節(jié)滑液TNF-α、IL-1β水平的影響與健康組相比，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β的水平均升高（P＜0.05）；給藥14 d后，五痹湯組和甲氨蝶呤組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯降低，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，甲氨蝶呤組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平下降更為明顯。

與健康組相比，模型組、五痹湯組大鼠關(guān)節(jié)滑液TNF-α、IL-1β的水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，五痹湯組和甲氨蝶呤組大鼠關(guān)節(jié)滑液TNF-α、IL-1β水平明顯降低（P＜0.05）。見表4。

表2佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評(píng)分/（分，±s）

表2佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評(píng)分/（分，±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05

組別模型組五痹湯組甲氨蝶呤組F值P值d23 8.87±4.02 5.05±2.09a 3.89±1.71a 8.685 0.001鼠數(shù)10 10 10 d9 2.70±1.31 2.50±0.99 3.55±1.67 1.700 0.202 d12 7.43±3.50 5.88±3.24 6.70±2.48 0.624 0.543 d15 9.25±2.78 7.80±1.01 7.72±3.07 1.224 0.310 d18 11.12±2.43 8.14±1.38a 6.21±2.90a 11.318 0.000 d21 10.44±3.01 6.56±3.12a 4.11±2.33a 12.617 0.000

表3各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理評(píng)分比較/（分，±s）

表3各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理評(píng)分比較/（分，±s）

注：與健康組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別健康組模型組五痹湯組甲氨蝶呤組F值P值骨質(zhì)侵蝕0.40±0.52 1.60±0.97a 0.70±0.67b 0.50±0.71b 5.544 0.003鼠數(shù)10 10 10 10滑膜細(xì)胞增殖0.10±0.32 2.10±0.88a 1.20±0.92ab 0.50±0.71b 13.813 0.000細(xì)胞侵蝕0.20±0.42 1.40±0.84a 0.50±0.71b 0.50±0.71b 3.545 0.024血管翳形成0.40±0.52 2.10±0.74a 1.00±0.82b 0.70±0.82b 10.17 0.000炎癥0.70±0.67 2.10±0.74a 1.10±0.88b 1.00±0.82b 6.043 0.002

3 討論

類風(fēng)關(guān)是一種不斷發(fā)展的與免疫失調(diào)相關(guān)的系統(tǒng)性疾病，在病人中不同程度影響關(guān)節(jié)，隨之而來的是許多并發(fā)癥。流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，在中低收入國(guó)家男性類風(fēng)關(guān)的患病率為0.16%（95%CI：0.11%～0.20%），女性達(dá)到 0.75%（95%CI：0.60%～0.90%）［9］。類風(fēng)關(guān)發(fā)作之前的細(xì)胞因子存在明顯的波動(dòng)，其中一些細(xì)胞因子已與關(guān)節(jié)炎形成過程中的自身抗體激活以及相關(guān)關(guān)節(jié)的疼痛和骨骼破壞有關(guān)，細(xì)胞因子可能觸發(fā)了從全身免疫到關(guān)節(jié)炎的轉(zhuǎn)變。細(xì)胞因子的暴露還可以進(jìn)一步觸發(fā)滑膜基質(zhì)細(xì)胞，以維持促炎環(huán)境。在某些情況下，細(xì)胞因子之間所產(chǎn)生的相互作用可促進(jìn)浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞之間的串?dāng)_，甚至維持異位淋巴結(jié)構(gòu)的發(fā)育，這些最終成為關(guān)節(jié)炎難以解決的源頭。目前，由于尚不清楚其確切的發(fā)病機(jī)理，在治療方法以消炎止痛及延緩進(jìn)展的對(duì)癥治療為主，臨床上，類風(fēng)關(guān)病情通常難以控制而時(shí)常復(fù)發(fā)［10］。中醫(yī)治療類風(fēng)關(guān)源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，近年來，一些報(bào)道顯示中西醫(yī)結(jié)合療法更能使病人受益，聯(lián)合西藥增效的同時(shí)亦可減低西藥治療所引起的毒副作用［11-12］。

表4 各組大鼠血清和關(guān)節(jié)滑液腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）水平比較/（pg/mL，±s）

表4 各組大鼠血清和關(guān)節(jié)滑液腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）水平比較/（pg/mL，±s）

注：與健康組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別TNF-αIL-1β健康組模型組五痹湯組甲氨蝶呤組F值P值關(guān)節(jié)滑液25.12±3.57 43.90±3.21a 32.11±1.82ab 28.03±4.94b 53.680 0.000鼠數(shù) 1 0 10 10 10血清40.70±3.33 165.54±21.81a 105.62±7.01ab 78.20±5.67ab 194.679 0.000關(guān)節(jié)滑液19.63±4.28 38.33±8.67a 22.04±5.30b 17.13±3.43b 27.515 0.000血清9.88±0.62 33.67±4.51a 19.10±3.85ab 15.02±2.56ab 82.996 0.000

五痹湯主治風(fēng)寒濕痹，經(jīng)絡(luò)不利，肢節(jié)疼痛，麻痹不仁。方中以姜黃為君，姜黃散風(fēng)寒，行氣血，通經(jīng)止痛，入血分能活血行瘀，入氣分能行散滯氣，具有氣血兼理之功效［3］；羌活祛風(fēng)除濕；防己祛風(fēng)濕止痛；生姜辛散寒濕；白術(shù)健脾除濕，甘草調(diào)和諸藥。全方配伍，共達(dá)散風(fēng)除濕，通絡(luò)止痛之效。臨證之時(shí)，如見腰骶痛，加桑寄生、杜仲；肩背痛，加防風(fēng)、桑枝；腰腿痛，加續(xù)斷、牛膝、威靈仙等。

大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型是類風(fēng)關(guān)動(dòng)物模型的雛形，制備方法簡(jiǎn)單易行，其病理學(xué)改變表現(xiàn)與人類類風(fēng)關(guān)相似，因此被廣泛應(yīng)用于研究類風(fēng)關(guān)發(fā)病和尋找新的治療方法［13-14］。在本實(shí)驗(yàn)中，造模后d9大鼠開始出現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)紅腫，以踝關(guān)節(jié)為重，并逐漸加重，可侵及足墊甚至全足，觀察至d18，AI評(píng)分達(dá)到最高。本實(shí)驗(yàn)中所制備的佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型特征與李培培等［6］的研究中所描述的相符合，模型建立成功。

為進(jìn)一步探討五痹湯對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用，于造模后出現(xiàn)炎癥反應(yīng)后即給予藥物干預(yù)治療，甲氨蝶呤為陽(yáng)性對(duì)照藥。甲氨蝶呤是治療類風(fēng)關(guān)的主要藥物，但是，在腎功能不全或癡呆的情況下，甲氨蝶呤則無法使用，此時(shí)生物制劑單一療法可能是一種治療選擇，而糖皮質(zhì)激素應(yīng)盡可能減少，因?yàn)樗歉腥镜奈ｋU(xiǎn)因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，在足爪腫脹度、炎癥程度及病理變化上五痹湯組和甲氨蝶呤組均有所改善，提示五痹湯和甲氨蝶呤對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎起到一定的治療效果，并且五痹湯對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的療效與甲氨蝶呤相當(dāng)。

類風(fēng)關(guān)病人血清中TNF-α、IL-1β、白細(xì)胞介素6（IL-6）等細(xì)胞因子與其疾病活動(dòng)度密切相關(guān)，這些細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)在類風(fēng)關(guān)的病理過程中發(fā)揮重要作用［15］。這些炎癥細(xì)胞因子中TNF-α、IL-1β發(fā)揮的作用尤為重要［16］。TNF-α可誘導(dǎo)血管細(xì)胞黏附因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和組織因子等的表達(dá)，這些分子作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)滑膜血管翳的生成。IL-1β與TNF-α兩者間還可發(fā)揮協(xié)同作用，同時(shí)刺激軟骨細(xì)胞以及成纖維樣滑膜細(xì)胞，產(chǎn)生炎性介質(zhì)，促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨的破壞［17-18］。在過去的20年中，有效的生物制劑和小分子激酶抑制劑的開發(fā)大大提高了臨床療效?？筎NF藥物是首個(gè)用于治療類風(fēng)關(guān)的分子靶向藥物。但是，抗TNF藥物的使用存在許多未解決的問題，包括感染的風(fēng)險(xiǎn)，原發(fā)性無反應(yīng)者，繼發(fā)性療效下降和藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)問題。因此有必要尋找有效而又安全的新藥物［19］。本研究結(jié)果顯示五痹湯能有效降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清和關(guān)節(jié)滑液TNF-α、IL-1β水平，提示五痹湯具有緩解模型大鼠全身和關(guān)節(jié)局部炎癥細(xì)胞因子浸潤(rùn)，從而起到改善關(guān)節(jié)炎癥的作用。

本研究顯示，五痹湯可減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足爪腫脹，緩解關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，改善踝關(guān)節(jié)病理評(píng)分，降低血清和關(guān)節(jié)滑液TNF-α、IL-1β水平，對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎具有治療作用。