劉琳

作者單位：青海省心腦血管病專科醫(yī)院冠心病科，青海 西寧810000

缺血性心臟病是由冠狀動(dòng)脈循環(huán)功能或者器質(zhì)性的改變所導(dǎo)致的冠狀動(dòng)脈血流和心肌細(xì)胞需氧量之間失調(diào)而引起的心肌損傷［1］，其中冠狀動(dòng)脈粥樣硬化引起的冠狀動(dòng)脈狹窄和閉塞是最常見的因素［2］。因此，緩解心肌缺血是目前臨床上最為有效的治療手段，但是會(huì)出現(xiàn)缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷［3］。I/R損傷涉及鈣超載、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等多種機(jī)制［4］，其中占主要作用的是氧化應(yīng)激損傷。因此，研究者們?cè)谂R床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中針對(duì)I/R損傷的氧化應(yīng)激機(jī)制，做了大量研究，發(fā)現(xiàn)可通過使用具有抗氧化功效的藥物可以降低I/R損傷的發(fā)生概率，這些藥物包括白藜蘆醇、茶多酚、人參皂苷、東莨菪堿和維生素C、輔酶Q等［5］。木犀草素作為黃酮類化合物，具有多酚結(jié)構(gòu)，存在于多種植物中，研究發(fā)現(xiàn)具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗炎等作用。已有研究發(fā)現(xiàn)木犀草素對(duì)糖尿病小鼠心肌損傷［6］、高糖誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷［7］、腦缺血再灌注損傷［8］等均具有明顯的改善效果，而木犀草素對(duì)心肌缺血再灌注損傷的研究相對(duì)較少，其中姚紅等人研究發(fā)現(xiàn)木犀草素對(duì)心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用［9］，但未從缺血再灌注和氧化應(yīng)激層面去闡釋保護(hù)機(jī)制。因此，本研究于2017年1月至2018年6月通過體外構(gòu)建H9c2心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的模型，探討木犀草素對(duì)構(gòu)建的模型細(xì)胞株氧化應(yīng)激的影響及其作用機(jī)制，為木犀草素在臨床上應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1材料木犀草素（72511）購于美國Sigma公司。H9c2心肌細(xì)胞（大鼠胚胎）購于中科院上海細(xì)胞庫。H-DMEM培養(yǎng)基購買于美國Gibco公司，胎牛血清（FBS）購于四季青公司，總谷胱甘肽（GSH）檢測(cè)試劑盒（A061-1）購于南京建成生物工程研究所，丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（S0131）、RIPA 裂解液（P0013C）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠二抗（A0216）及HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（A0208）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（RR820A）、Trizol試劑（9109）、反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒（RR047A）購于寶生物工程（大連）有限公司，鼠抗Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1（Keap1）單克隆抗體（ab150654）、兔抗核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）單克隆抗體（ab62352，Abcam）購買自Abcam公司，8-羥基脫氧尿苷（8-OHdG）酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（ELISA）檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml002198）。

1.2方法

1.2.1H9c2心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷造模的構(gòu)建及分組 模型的制備參照文獻(xiàn)［10］的方法操作：對(duì)照組細(xì)胞的培養(yǎng)條件是培養(yǎng)箱中二氧化碳的含量為5%，溫度為37℃；模型組細(xì)胞則先用含2-脫氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose）10，4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）5，氯化鉀（KCl）12，氯化鎂（MgCl2）0.5，氯化鈉（NaCl）139，氯化鈣（CaCl2）1.3，乳酸20，且PH值為6.2的培養(yǎng)液（mmol/L）進(jìn)行培養(yǎng)，溫度控制在37℃，且培養(yǎng)箱中通入100%氮?dú)猓ㄑ鯕猓?%），培養(yǎng)持續(xù)8 h后，更換為DMEM培養(yǎng)基（10%FBS），恢復(fù)正常的氧氣濃度，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；木犀草素處理組的細(xì)胞分別用5 μM、10 μM、20 μM的木犀草素［母液溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，DMSO終濃度為0.5%］預(yù)處理24 h，隨后進(jìn)行上述缺氧-復(fù)氧實(shí)驗(yàn)；對(duì)照組和缺氧-復(fù)氧組均加入終濃度為0.5%的DMSO。

1.2.2MTT檢測(cè)木犀草素對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷的H9c2的影響 利用胰酶消化處在對(duì)數(shù)生長期H9c2心肌細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，按照每孔4×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中和每孔1.5×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，貼壁后，參考1.2.1項(xiàng)，利用木犀草素進(jìn)行處理及缺氧-復(fù)氧損傷，處理結(jié)束，用倒置顯微鏡觀察6孔板中細(xì)胞形態(tài)的改變；加5 mg/mL的3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）20 μL到96孔板的細(xì)胞中，正常環(huán)境培養(yǎng)4 h，棄去上清，加入150 μL DMSO室溫溶解MTT，于490 nm處在酶標(biāo)儀上測(cè)量光密度（OD）值，并計(jì)算各組細(xì)胞的增殖率。計(jì)算公式為：增殖率（%）＝（OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組）×100%。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)木犀草素對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響 按照1.2.1項(xiàng)的操作對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行處理，處理結(jié)束后，分別收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液（PBS）進(jìn)行洗滌，按照1×106/mL的細(xì)胞密度用1×結(jié)合緩沖液（Binding Buffer）重懸細(xì)胞，在離心管中加入100 μL的重懸細(xì)胞，然后分別加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（AnnexinⅤ-FITC）及5 μL碘化丙啶（PI），混勻后，置于25℃避光的條件下孵育15 min，再加入400 μL的1×Binding Buffer，混勻后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)（此步驟需在1 h內(nèi)進(jìn)行）。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測(cè)木犀草素對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷的H9c2細(xì)胞中B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、Keap1、Nrf2蛋白含量的影響 按照1.2.1項(xiàng)下處理各組細(xì)胞后，利用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）定量后，加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min，-20℃保存。進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），具體流程為蛋白上樣電泳、條帶轉(zhuǎn)膜、封閉背景、加入一抗進(jìn)行孵育、加入二抗孵育、利用ECL發(fā)光液顯色、然后自動(dòng)曝光儀曝光，最后對(duì)條帶進(jìn)行拍照分析。

1.2.5qPCR檢測(cè)木犀草素對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷的H9c2細(xì)胞中MDA、8-OHdG、GSH含量的影響 按照1.2.1項(xiàng)的步驟對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行處理后，在PBS緩沖液中研碎細(xì)胞，然后離心取上清棄雜質(zhì)，按照試劑盒說明書中的檢測(cè)步驟對(duì)上清中MDA、8-OHdG、GSH含量進(jìn)行檢測(cè)，其中TBA法檢測(cè)MDA、ELISA檢測(cè)8-OHdG，微量酶標(biāo)法檢測(cè)GSH。

1.2.6木犀草素對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷的H9c2細(xì)胞中γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（γ-GCS）、血紅素加氧酶（HO-1）、NAD（P）H醌氧化還原酶（NQO1）mRNA表達(dá)影響按照1.2.1項(xiàng)的步驟處理各組細(xì)胞后，利用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，并用用RNase-free水溶解，按照反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說明書合成cDNA，再按照qPCR試劑盒的步驟進(jìn)行qPCR，熒光定量反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性：95℃、10 min、1循環(huán)數(shù)；擴(kuò)增：95℃、15 s，60℃、15 s，72 ℃、30 s、40循環(huán)數(shù)。用2-△△Ct表示基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列如表1所示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以±s表示計(jì)量資料，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行多組間的兩兩比較，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1木犀草素對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷H9c2細(xì)胞的影響如圖1所示，兩組細(xì)胞的形態(tài)變化：對(duì)照組的細(xì)胞生長狀態(tài)良好，大部分呈梭形；而缺氧-復(fù)氧損傷的細(xì)胞大部分呈現(xiàn)不規(guī)則多角形，且懸浮、裂解、細(xì)胞碎片明顯增多，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)細(xì)微顆粒物，表面粗糙，增殖率顯著下降［對(duì)照組：（100±0）%比缺氧-復(fù)氧組：（19.73±3.56）%，t＝39.054，P＝0.000］；經(jīng)木犀草素處理后，再進(jìn)行缺氧-復(fù)氧損傷，發(fā)現(xiàn)隨著增加木犀草素的濃度，不規(guī)則細(xì)胞的數(shù)量，細(xì)胞中懸浮、裂解、細(xì)胞碎片均逐漸下降，增殖率逐漸增加，與缺氧-復(fù)氧損傷組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［缺氧-復(fù)氧組：（19.73±3.56）%比5 μM木犀草素組：（39.45±4.38）%、10 μM木犀草素組：（66.11±5.69）%、20 μM木犀草素組：（94.38±10.18）%，t1＝3.304，P＝0.027；t2＝6.831，P＝0.002；t3＝11.989，P＝0.000］（F＝12.486，P＝0.000）。

2.2木犀草素對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響如圖2所示，相比對(duì)照組細(xì)胞凋亡率（8.14±1.13）%，缺氧-復(fù)氧組細(xì)胞中早晚期凋亡細(xì)胞的比例明顯上升（72.37±6.98）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝15.733，P＝0.000）；經(jīng)木犀草素處理后，再進(jìn)行缺氧-復(fù)氧損傷，發(fā)現(xiàn)與缺氧-復(fù)氧組細(xì)胞凋亡相比，隨木犀草素濃度的增加，實(shí)驗(yàn)組早晚期細(xì)胞凋亡比例逐漸減少［（65.45±5.14）%、（41.38±4.32）%、（29.67±5.67）%］，其中10 μM和20 μM木犀草素組細(xì)胞凋亡顯著減少（t1＝6.539，P＝0.003；t2＝8.224，P＝0.001）（F＝8.863，P＝0.000）。

2.3木犀草素對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷的H9c2細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白含量的影響如圖3所示，相比對(duì)照組，缺氧-復(fù)氧組細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)量增加顯著（t＝11.079，P＝0.000），Bcl-2蛋白含量顯著減少（t＝9.608，P＝0.001）；經(jīng)木犀草素處理后，再進(jìn)行缺氧-復(fù)氧損傷，發(fā)現(xiàn)與缺氧-復(fù)氧組細(xì)胞相比，隨木犀草素濃度的增加，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Bax蛋白含量逐漸下降，而Bcl-2蛋白含量則逐漸上升，其中10 μM和20μM木犀草素處理組中的細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白變化均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Bax：t1＝4.979，P＝0.008；t2＝10.224，P＝0.001；Bcl-2：t1＝6.124，P＝0.004；t2＝8.386，P＝0.001）。見表2。

表2 木犀草素對(duì)H9c2細(xì)胞中B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）蛋白含量的半定量統(tǒng)計(jì)/±s

表2 木犀草素對(duì)H9c2細(xì)胞中B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）蛋白含量的半定量統(tǒng)計(jì)/±s

注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與缺氧-復(fù)氧組相比，bP＜0.05

組別對(duì)照組缺氧-復(fù)氧組5 μM木犀草素組10 μM木犀草素組20 μM木犀草素組F值P值Bax相對(duì)表達(dá)量0.38±0.04 1.01±0.09a 0.83±0.05 0.71±0.06b 0.45±0.03b 11.346 0.000重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 3 Bcl-2相對(duì)表達(dá)量0.83±0.06 0.43±0.04a 0.47±0.05 0.63±0.04b 0.74±0.05b 8.674 0.000

2.4木犀草素對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷的H9c2細(xì)胞中MDA、8-OHdG、GSH含量的影響如表3所示，相比對(duì)照組，MDA、8-OHdG含量在缺氧-復(fù)氧組細(xì)胞中顯著增加（MDA：t＝17.054，P＝0.000；8-OHdG：t＝7.691，P＝0.002），GSH含量顯著減少（t＝12.389，P＝0.000）；經(jīng)木犀草素處理后，再進(jìn)行缺氧-復(fù)氧損傷，發(fā)現(xiàn)與缺氧-復(fù)氧組細(xì)胞相比，隨木犀草素濃度的增加，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中MDA、8-OHdG含量逐漸減少，GSH含量逐漸增加，其中5 μM、10 μM和20 μM木犀草素組細(xì)胞中MDA、8-OHdG和10 μM和20 μM木犀草素組細(xì)胞中GSH含量變化均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（MDA：t1＝5.879，P＝0.004；t2＝11.748，P＝0.000；t3＝15.062，P＝0.000；8-OHdG：t1＝3.778，P＝0.019；t2＝6.054，P＝0.004；t3＝7.850，P＝0.001；GSH：t1＝6.326，P＝0.003；t2＝8.395，P＝0.001）。

表3 木犀草素對(duì)H9c2細(xì)胞中丙二醛（MDA）、8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）、谷胱甘肽（GSH）含量的影響/±s

表3 木犀草素對(duì)H9c2細(xì)胞中丙二醛（MDA）、8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）、谷胱甘肽（GSH）含量的影響/±s

注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與缺氧-復(fù)氧組相比，bP＜0.05

重復(fù)次數(shù)33333組別對(duì)照組缺氧-復(fù)氧組5 μM木犀草素組10 μM木犀草素組20 μM木犀草素組F值P值MDA/（nmol/mg）0.45±0.05 1.73±0.12a 1.12±0.11b 0.82±0.06b 0.63±0.04b 6.789 0.001 8-OHdG/（ng/L）183.81±20.68 316.37±21.53a 253.26±19.33b 211.45±20.98b 189.15±18.01b 14.342 0.000 GSH/（nmol/mg）193.98±12.38 88.59±7.99a 107.96±15.66 142.19±12.31b 178.67±16.78b 7.658 0.001

2.5木犀草素對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷的H9c2細(xì)胞中γ-GCS、HO-1、NQO1 mRNA表達(dá)的影響如圖4所示，相比對(duì)照組，γ-GCS、HO-1、NQO1 mRNA在缺氧-復(fù)氧組細(xì)胞中表達(dá)量均顯著下降（γ-GCS：t＝8.165，P＝0.001；HO-1：t＝40.836，P＝0.000；NQO1：t＝21.218，P＝0.000）；經(jīng)木犀草素處理后，再進(jìn)行缺氧-復(fù)氧損傷，發(fā)現(xiàn)與缺氧-復(fù)氧組細(xì)胞相比，隨木犀草素濃度的增加，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中γ-GCS、HO-1、NQO1 mRNA表達(dá)逐漸增加，其中10 μM和20 μM木犀草素組細(xì)胞中γ-GCS以及5 μM、10 μM和20 μM木犀草素組細(xì)胞中HO-1、NQO1 mRNA變化均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（γ-GCS：t1＝3.149，P＝0.035；t2＝4.649，P＝0.010；HO-1：t1＝5.945，P＝0.004；t2＝9.624，P＝0.001；t3＝9.126，P＝0.001；NQO1：t1＝5.284，P＝0.006；t2＝6.003，P＝0.004；t3＝8.764，P＝0.001）。見表4。

表4 木犀草素對(duì)H9c2細(xì)胞中γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（γ-GCS）、血紅素加氧酶（HO-1）、NAD（P）H醌氧化還原酶（NQO1）mRNA表達(dá)影響/±s

表4 木犀草素對(duì)H9c2細(xì)胞中γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（γ-GCS）、血紅素加氧酶（HO-1）、NAD（P）H醌氧化還原酶（NQO1）mRNA表達(dá)影響/±s

注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與缺氧-復(fù)氧組相比，bP＜0.05

組別對(duì)照組缺氧-復(fù)氧組5 μM木犀草素組10 μM木犀草素組20 μM木犀草素組F值P值NQO1 mRNA 1.00±0.00 0.51±0.04a 0.73±0.06b 0.82±0.08b 1.15±0.12b 7.322 0.000重復(fù)次數(shù)33333 γ-GCS mRNA 1.00±0.00 0.67±0.07a 0.73±0.08b 0.85±0.07b 1.02±0.11b 3.243 0.003 HO-1 mRNA 1.00±0.00 0.41±0.03a 0.63±0.06b 0.82±0.07b 0.95±0.10b 5.786 0.002

2.6木犀草素對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷的H9c2細(xì)胞中Keap1、Nrf2蛋白含量的影響如圖5所示，與對(duì)照組相比，缺氧-復(fù)氧組細(xì)胞中Keap1蛋白含量有所減少（t＝2.976，P＝0.04），Nrf2蛋白含量有所升高（t＝5.644，P＝0.005）；經(jīng)木犀草素處理后，再進(jìn)行缺氧-復(fù)氧損傷，發(fā)現(xiàn)與缺氧-復(fù)氧組細(xì)胞相比，隨木犀草素濃度的增加，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Keap1蛋白含量逐漸更加減少，Nrf2蛋白含量逐漸更加升高，其中10μM和20μM木犀草素組細(xì)胞中Keap1和Nrf2蛋白變化均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Keap1：t1＝17.041，P＝0.000；t2＝23.945，P＝0.000；Nrf2：t1＝4.631，P＝0.010；t2＝6.426，P＝0.003）。見表5。

圖5 木犀草素對(duì)H9c2細(xì)胞中核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）、Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1（Keap1）蛋白含量的影響（蛋白質(zhì)印跡法條帶）

表5 木犀草素對(duì)H9c2細(xì)胞中核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）、Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1（Keap1）蛋白含量的半定量統(tǒng)計(jì)/± s

表5 木犀草素對(duì)H9c2細(xì)胞中核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）、Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1（Keap1）蛋白含量的半定量統(tǒng)計(jì)/± s

注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與缺氧-復(fù)氧組相比，bP＜0.05

組別對(duì)照組缺氧-復(fù)氧組5 μM木犀草素組10 μM木犀草素組20 μM木犀草素組F值P值Keap1相對(duì)表達(dá)量0.83±0.045 0.72±0.04a 0.61±0.05 0.28±0.02b 0.15±0.01b 5.634 0.003重復(fù)次數(shù)33333 Nrf2相對(duì)表達(dá)量0.43±0.031 0.62±0.05a 0.73±0.045 0.85±0.07b 0.97±0.08b 4.333 0.002

3 討論

缺血再灌注可引起心肌損傷，主要原因在于缺氧-復(fù)氧引起的氧化應(yīng)激與線粒體代謝障礙之間的協(xié)同作用導(dǎo)致心肌發(fā)生炎癥、心肌細(xì)胞凋亡［11-12］。目前抗氧化藥物的應(yīng)用在基礎(chǔ)和臨床研究中表現(xiàn)出對(duì)缺血再灌注心肌損傷良好的保護(hù)效果。木犀草素是天然的抗氧化劑，可利用這一特點(diǎn)對(duì)多種疾病的預(yù)防及發(fā)生發(fā)展起到保護(hù)作用［13-16］。因此，本研究在體外缺氧-復(fù)氧培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞模擬缺血再灌注，通過檢測(cè)直接缺氧-復(fù)氧培養(yǎng)和先木犀草素再缺氧-復(fù)氧培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞的損傷凋亡情況及其氧化應(yīng)激水平的變化，進(jìn)一步在氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞的層面探索了木犀草素對(duì)缺血再灌注損害的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

心肌細(xì)胞凋亡是缺血再灌注對(duì)心肌細(xì)胞最直觀和最終的損傷。缺血再灌注引起的種種代謝變化最后都會(huì)引起心肌細(xì)胞的凋亡進(jìn)而導(dǎo)致心肌損傷。細(xì)胞核內(nèi)的凋亡基因Bcl-2/Bax、Bcl-xL、Fas/Fas-L等在缺血缺氧的刺激下進(jìn)行高表達(dá)，迅速啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，加重細(xì)胞的凋亡［17-18］。有研究顯示，細(xì)胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生過程中會(huì)損傷心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能損害，因此可用于部分藥物干預(yù)治療心肌缺血再灌注損傷的靶點(diǎn)［19-20］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)量的降低和Bcl-2蛋的白表達(dá)量的增加對(duì)木犀草素具有濃度依賴性，因此木犀草素可抑制缺氧-復(fù)氧造成的心肌細(xì)胞凋亡，而在心肌細(xì)胞形態(tài)觀察和流式檢測(cè)的結(jié)果中均直觀證實(shí)這一抑制凋亡的作用。研究表明，缺血期間心肌細(xì)胞內(nèi)氧自由基大量增加和鈣離子超載是缺血的心肌再灌注后啟動(dòng)凋亡程序的原因［21-22］，首先細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸被大量增加的氧自由基攻擊，引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化及膜脂質(zhì)微環(huán)境的改變，因此引發(fā)細(xì)胞膜功能和結(jié)構(gòu)的障礙，細(xì)胞膜通透性增加，流動(dòng)性降低，進(jìn)而損傷整個(gè)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡；其次細(xì)胞內(nèi)的核糖核酸也會(huì)被氧自由基氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。在實(shí)驗(yàn)中MDA和8-OHdG分別作為脂質(zhì)過氧化和DNA過氧化的標(biāo)志物，在本研究中顯示木犀草素可以抑制因缺氧-復(fù)氧引起胞中MDA和8-OHdG濃度，這一抑制作用具有濃度依賴性，提示木犀草素可保護(hù)缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞中脂質(zhì)和DNA免受過氧化損傷。

在正常心肌細(xì)胞內(nèi)存在整套抗氧自由基酶系統(tǒng)和天然抗氧化劑，可使體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基被不斷消除，并維持在低水平狀態(tài)，使心肌細(xì)胞免受損害。過氧化氫酶（CAT）、血紅素氧合酶1（HO-1）、超氧化物歧化酶（SOD）、人醌氧化還原酶1（NQO-1）谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）、等都屬于抗氧自由基酶，輔酶Q10、VitC、VitE、VitA、谷胱甘肽（GSH）等屬于天然抗氧化劑。在發(fā)生急性心肌缺血時(shí)，體內(nèi)常規(guī)消除氧自由基的酶活性受到了抑制，在進(jìn)行再灌注時(shí)，有大量酶被帶走，因此不能正常發(fā)揮清除作用，導(dǎo)致氧自由基含量增加。本研究結(jié)果顯示，在由缺氧-復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞中，木犀草素可濃度依賴的提高胞中降低的GSH含量以及增加γ-GCS、HO-1、NQO1 mRNA的表達(dá)量，說明木犀草素可有效地改善心肌細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧-復(fù)氧造成的過氧化損傷。

近年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激發(fā)揮關(guān)鍵作用的通路是Nrf2-抗氧化響應(yīng)元件（ARE）信號(hào)通路，其可以通過調(diào)控細(xì)胞抗氧化酶系和Ⅱ相解毒酶清除氧自由基等有害物質(zhì)，發(fā)揮中和解讀的作用［23］。在激活Nrf2-ARE信號(hào)通路后，可誘導(dǎo)大量保護(hù)性基因NQO1、HO-1、γ-GCS等進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，抵御外界刺激對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷［24］。在正常狀況下，Keap1與Nrf2相結(jié)合，促進(jìn)Nrf2泛素化降解，抑制Nrf2進(jìn)核。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下Keap1與Nrf2解離，Nrf2激活進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)下游Ⅱ相解毒酶等一系列保護(hù)性基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力［25］。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧-復(fù)氧可是減少心肌細(xì)胞內(nèi)Keap1蛋白含量，增加Nrf2蛋白的含量，說明Nrf2-ARE信號(hào)通路被氧化應(yīng)激激活，同時(shí)木犀草素可濃度依賴的降低心肌細(xì)胞內(nèi)Keap1蛋白的含量，增加Nrf2蛋白的含量，這說明在缺氧-復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞中，木犀草素可激活Nrf2-ARE信號(hào)通路來保護(hù)心肌細(xì)胞。

綜上所述，木犀草素可抑制由缺氧-復(fù)氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧-復(fù)氧損傷。一方面木犀草素通過激活細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵信號(hào)通過Nrf2-ARE通路，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)抗氧自由基酶的表達(dá)，降低損傷細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，保護(hù)缺氧-復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞。但是本研究僅局限于木犀草素的抗氧化性，探索其在氧化應(yīng)激水平的分子機(jī)制，而木犀草素的其他藥理特性是否參與保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧-復(fù)氧損傷還未可知，需后續(xù)進(jìn)行研究。

（本文圖1～4見插圖6-2）

圖1 木犀草素對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷的H9c2的影響（×100）:A為對(duì)照組；B為缺氧-復(fù)氧組；C為5 μM木犀草素組；D為10 μM木犀草素組；E為20 μM木犀草素組

圖2 木犀草素對(duì)H9c2細(xì)胞凋亡的影響：A為對(duì)照組；B為缺氧-復(fù)氧組；C為5 μM木犀草素組；D為10 μM木犀草素組；E為20 μM木犀草素組

圖3 木犀草素對(duì)H9c2細(xì)胞中B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）蛋白含量的影響（蛋白質(zhì)印跡法條帶）

圖4 木犀草素對(duì)H9c2細(xì)胞中γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（圖4A）、血紅素加氧酶（圖4B）、NAD（P）H醌氧化還原酶（圖4C）mRNA表達(dá)影響（溶解曲線圖）