曹君，伍靖，鄭亞琪，趙滿，謝爾婷

(深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院口腔科，廣東 深圳)

0 引言

小分子干擾RNA(Smallinterfering RNA，siRNA)正成為基因治療的利器[1]。研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白激酶2 相互作用蛋白1(Casein kinase 2 interacting protein 1，CKIP-1)具有負向調(diào)控成骨分化的作用[2]。本研究擬精確設計作用于CKIP-1 mRNA 的siRNA，轉(zhuǎn)染細胞，根據(jù)RNAi 技術(shù)使其在一段時間內(nèi)能有效解除CKIP-1基因?qū)巧傻囊种谱饔?，實現(xiàn)對骨形成細胞成骨功能的正向調(diào)控，促進新骨形成。羥基磷灰石納米顆粒(Hydroxyapatite nanoparticles，HAnps)已被證明是基因轉(zhuǎn)染的有效的非病毒載體[3-7]，具有良好的生物相容性和特有的生物功能。HAnps 摻雜Mg2+后其表面可帶正電荷，可與DNA/RNA 結(jié)構(gòu)上的磷酸基團發(fā)生靜電效應，以利于其與基因結(jié)合[8]。黏附肽(Arginine-Glycine-Aspatic acid，RGD)為短肽序列，是細胞膜上多種整合素受體的特異性配體，能高效的促進眾多類型的細胞對生物材料的粘附[9]。本研究以Mg-HAnps 為載體，用接枝和靜電吸附的方法構(gòu)建膜靶向性的帶電HAnps 基因載體系統(tǒng)(Mg-HAnps-RGDCKIP-1 siRNA)，評價該基因載體系統(tǒng)對MG63 細胞增殖和分化功能的影響，為構(gòu)建具有膜靶向性和高轉(zhuǎn)染效率的HAnps 基因載體系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 Mg-HAnps 的制備

水熱合成法：按(Ca+Mg)/P 的摩爾比為1.67，以Mg/(Ca+Mg)摩 爾 比7%，稱 取 適 量 的Ca(NO3)2·4H2O、Mg(NO3)2·6H2O和(NH4)2HPO4。將適量的2wt%的表面活性劑PEG2000 加入Ca(NO3)2·4H2O 和Mg(NO3)2·6H2O 中，用雙蒸水配成溶液。將(NH4)2HPO4 滴入上述溶液中，充分攪拌。用濃氨水將溶液pH值調(diào)至10，使用超聲波納米材料粉碎機間斷超聲混懸液10min。將混懸液轉(zhuǎn)移至水熱合成反應釜中后，于電熱鼓風干燥箱中170℃水熱合成3h 后取出，自然冷卻至室溫。用無水乙醇和雙蒸水交替離心洗滌3 次，1000rpm，每次5min，去除上清液，保存于無水乙醇中。

1.2 Mg-HAnps 接枝RGD 及檢測

硅烷化聯(lián)合碳二亞胺法：配置EDC-MES 和RGD-PBS 緩沖溶液，并以體積比1：20 配置APTES 的無水乙醇溶液，將形貌和分散性較佳的Mg-HAnps 試樣置于的APTES 無水乙醇溶液中，超聲4h 后取出冷卻至室溫。用雙蒸水、無水乙醇交替離心洗滌3～4 次，棄上清，浸入EDC-MES 緩沖液中超聲6h，再用雙蒸水和MES 緩沖液交替離心洗滌3～4 次后，浸入RGD-PBS 緩沖溶液中反應4h 后取出。用雙蒸水超聲清洗2 遍后將樣品置于真空冷凍干燥箱中冷凍干燥24h，得到表面接枝RGD 的Mg-HAnps 粉末。由于Mg-HAnps 不含有N 元素，接枝RGD 后，可引入N 元素。使用X 射線光電子能譜儀檢測Mg-HAnps 的RGD 接枝狀況。

1.3 CKIP-1 siRNA 的合成及溶解

由上海吉瑪公司負責合成作用于CKIP-1 mRNA 的siRNA，合成的CKIP-1 的siRNA 的序列如下：

Sense：5-GGACUUGGUAGCAAGGAAATT-3；

Antisense：5-UUUCCUUGCUACCAAGUCCTT-3；

打開siRNA 離心管之前以速度12000rpm 離心2min，再慢慢打開管蓋，加33μl DEPC 水后蓋上管蓋，振蕩溶解，siRNA 的濃度為0.5μg/μl。

1.4 Mg-HAnps 對siRNA 吸附實驗

將Mg 量為7%的Mg-HAnps 混懸液用0.22μm 的無菌過濾器除菌，用雙蒸水稀釋至濃度為1μg/μl，取混懸液20μl 于EP 管中，均加入20μl 5μg/μl 的Ca(NO3)2溶液修飾，每管分別加1μg siRNA，置于搖床上充分混合均勻5min，室溫靜置20min。

1.5 MG63 細胞的培養(yǎng)

人成骨肉瘤MG63 細胞復蘇后置于37 ℃、5%CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第二天換液，以后每兩天更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)液由胎牛血清和gibco RPMI1640 按1：9 的比例配置而成。于倒置顯微鏡下觀察，當培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞密度達到80%即可按1：2 傳代。

1.6 Mg-HAnps-RGD-siRNA 對MG63 細胞增殖的影響

當培養(yǎng)瓶中MG63 細胞密度達到80%時，加入胰酶消化，再加入培養(yǎng)液吹勻細胞，配置成5×104 個/mL 的細胞懸液，按每孔0.5mL 將其接種到24 孔板中，放入到培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h待 完 全 貼 壁。分 別 用100μl 濃 度 為500μg/mL 的Mg-HAnps-RGD-siRNA、Mg-HAnps-siRNA、HAnps-RGD-siRNA、HAnpssiRNA 替換原培養(yǎng)液，設4 個復孔，對照組換為培養(yǎng)液，共五組，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)1，3，5，7d 后，每孔加入50μl SunBio Am-Blue細胞增殖試劑，繼續(xù)孵育4 小時，培養(yǎng)基的顏色由靛青藍開始變成粉紅色取出，于全自動酶標儀在波長570nm 檢測每孔的吸光度(Optical Density，OD)值。并計算各組OD 的平均值，分析數(shù)據(jù)。

表1 SunBio Am-Blue 細胞增殖試劑測定1，3，5，7 天的OD 值 n=4)

表1 SunBio Am-Blue 細胞增殖試劑測定1，3，5，7 天的OD 值 n=4)

注：5 組細胞同一時間點的OD 值在統(tǒng)計學上均沒有顯著差異(P＞0.05)。

分組 1 天 3 天 5 天 7 天Mg-HAnps-RGD-siRNA 組 0.5280±0.0084 0.6510±0.0062 0.8440±0.0074 1.0338±0.0245 HAnps-RGD-siRNA 組 0.5113±0.0109 0.6235±0.0087 0.8195±0.0101 0.9718±0.0406 Mg-HAnps-siRNA 組 0.5218±0.0073 0.6313±0.0071 0.8403±0.0038 0.9943±0.0240 HAnps-siRNA 組 0.5130±0.0132 0.6405±0.0058 0.8340±0.0094 0.9415±0.0271對照組 0.5335±0.0061 0.6615±0.0054 0.8580±0.0061 1.0945±0.0570

表2 細胞上清液第1，3，5，7 天ALP 濃度的OD 值, n=4)

表2 細胞上清液第1，3，5，7 天ALP 濃度的OD 值, n=4)

分組 1 天 3 天 5 天 7 天Mg-HAnps-RGD-siRNA 組 0.0588±0.0017 0.1320±0.0050 0.2048±0.0067 0.2400±0.0067 HAnps-RGD-siRNA 組 0.0563±0.0022 0.1185±0.0083 0.1795±0.0034 0.2130±0.0062 Mg-HAnps-siRNA 組 0.0575±0.0053 0.0968±0.0061 0.1565±0.0061 0.1793±0.0073 HAnps-siRNA 組 0.0590±0.0029 0.0833±0.0048 0.1385±0.0048 0.1635±0.0039對照組 0.0568±0.0017 0.0608±0.0030 0.0670±0.0037 0.0695±0.0031

1.7 Mg-HAnps-RGD-siRNA 對MG63 細胞分化的影響

MG63 細胞培養(yǎng)后待完全貼壁，分別用100μl 濃度為500μg/mL 的Mg-HAnps-RGD-siRNA、Mg-HAnps-siRNA、HAnps-RGDsiRNA、Mg-HAnps-siRNA 替換原培養(yǎng)液，設4 個復孔，對照組換為培養(yǎng)液，共五組，繼續(xù)培養(yǎng)。各孔分別在第1，3，5，7d 取細胞上清并換液，用堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)、骨鈣素(Osteocalcin，OC)的ELISA 酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒在全自動酶標儀450nm 波長測量各孔的吸光度(OD)值。

1.8 統(tǒng)計學分析

應用統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0 對所有實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，以均數(shù)±標準差表示，組與組之間數(shù)據(jù)比較采用t 檢驗，若P＜0.05，則認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 接枝RGD 的Mg-HAnps 的XPS 檢測

圖1 碳元素峰的擬合解析圖

圖1 為使用origin 作圖軟件對C 元素峰的擬合結(jié)果。從圖可以看出，C 元素以C-C 鍵，C-N 鍵，O=C-N 鍵的形式存在，其中O=C-N 鍵為硅烷化的Mg-HAnps 與RGD 發(fā)生成肽反應后生成的化學鍵，說明兩者為化學結(jié)合，提示Mg-HAnps 接枝RGD成功。

2.2 Mg-HAnps-RGD-siRNA 對MG63 細胞增殖的影響

圖2 不同時間點細胞增殖的吸光度值

從實驗結(jié)果(表1)及圖(圖2)可以看出，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，各組的細胞數(shù)都有增多，相同的時間點，四個實驗組與對照組之間OD 值在統(tǒng)計學上沒有顯著差異(P＞0.05)，其中，四個實驗組之間的差異也不顯著(P＞0.05)。根據(jù)細胞相對增殖率(RGR)計算公式：RGR%=實驗組平均OD 值/對照組平均OD 值×100%，細胞的增殖情況可以直接用各組的OD 值反應，所以在同一時間點，各實驗組的成骨細胞增殖率在統(tǒng)計學上沒有顯著差異(P＞0.05)，所以摻Mg 和接枝RGD 的對成骨細胞的增殖影響不明顯。

2.3 Mg-HAnps-RGD-siRNA 對MG63 細胞分泌ALP 的影響

圖3 不同時間點細胞上清液中ALP 的吸光度值

從表2 及圖3 可以看出，細胞培養(yǎng)第1d，各組上清液中的ALP 濃度無明顯差異(P＞0.05)；隨著培養(yǎng)時間的延長，各實驗組組ALP 濃度均增加，但對照組增加不明顯。在細胞培養(yǎng)的第3、5、7d，在同一時間點上，ALP 濃度由高到低的順序為Mg-HAnps-RGD-siRNA 組＞HAnps-RGD-siRNA 組＞Mg-HAnps-siRNA 組＞HAnps-siRNA 組＞對照組，并且各實驗組均比對照組顯著提高(P＜0.01)，Mg-HAnps-siRNA 組與HAnps-siRNA 組比，摻Mg組的ALP 濃度比未摻Mg 組高，并且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；HAnps-RGD-siRNA 組 與HAnps-siRNA 組 比，接 枝RGD 組 的ALP 濃度比未接枝RGD 組明顯提高，(P＜0.01)；同時摻Mg 和接枝RGD 的Mg-HAnps-RGD-siRNA 組的ALP 濃度比其他組均高，并且差異有顯著性(P＜0.05)。由此可以得出，摻Mg 或接枝RGD均促進成骨細胞ALP 的分泌，同時摻Mg 和接枝RGD 更有利ALP的分泌。

表3 各組細胞上清第1，3，5，7 天OC 的濃度OD 值, n=4)

表3 各組細胞上清第1，3，5，7 天OC 的濃度OD 值, n=4)

分組 1 天 3 天 5 天 7 天Mg-HAnps-RGD-siRNA 組 0.0560±0.0029 0.0610±0.0041 0.1530±0.0059 0.2243±0.0051 HAnps-RGD-siRNA 組 0.0495±0.0035 0.0628±0.0043 0.1375±0.0026 0.2150±0.0028 Mg-HAnps-siRNA 組 0.0565±0.0037 0.0633±0.0038 0.1030±0.0035 0.1650±0.0073 HAnps-siRNA 組 0.0508±0.0033 0.0623±0.0043 0.0920±0.0084 0.1588±0.0036對照組 0.0515±0.0068 0.0543±0.0041 0.0650±0.0032 0.0673±0.0064

2.4 Mg-HAnps-RGD-siRNA 對MG63 細胞分泌OC 的影響

圖4 不同時間點細胞上清液中OC 的吸光度值

從表3 及圖4 可以看出，細胞培養(yǎng)第1、3 d，各組上清液中OC濃度無明顯差異(P＞0.05)；在細胞培養(yǎng)的第5、7 d，各實驗組OC濃度較第1、3 天明顯增加，對照組增加不明顯。在同一時間點，OC 濃度由高到低的順序為Mg-HAnps-RGD-siRNA 組＞HAnps-RGD-siRNA 組＞Mg-HAnps-siRNA 組＞HAnps-siRNA 組＞對照組，4 個實驗組均比對照組顯著提高(P＜ 0.01)； Mg-HAnpssiRNA 組與HAnps-siRNA 組比，摻Mg 組的OC 濃度比未摻Mg組高，并且差異有統(tǒng)計學意義(P＜ 0.05)； HAnps-RGD-siRNA 組與HAnps-siRNA 組比，接枝RGD 組的OC 濃度比未接枝RGD組明顯提高(P＜ 0.05) ；同時摻Mg 和接枝RGD 的Mg-HAnps-RGD-siRNA 組的OC 濃度比其他組均高(P＜ 0.05)。由此可以得出，摻Mg 或接枝RGD 均促進成骨細胞OC 的分泌，同時摻Mg 和接枝RGD 更有利OC 的分泌。

3 討論

本研究細胞增殖實驗結(jié)果表明與細胞培養(yǎng)基對照組相比，四個HAnps 基因載體系統(tǒng)實驗組在MG63 細胞增殖方面沒有明顯的差異，說明摻Mg 和接枝RGD 對MG63 細胞的增殖沒有影響，進而說明帶電HAnps 基因載體系統(tǒng)無細胞毒性。這與Webler[10]等研究的摻鎂的磷酸鈣納米顆粒沒有細胞毒性的結(jié)果相符，同時也說明該納米顆粒具有良好的生物相容性，是一種安全的基因載體。Park[11]等發(fā)現(xiàn)用RGD 修飾的鈦種植體對細胞的增殖沒有明顯影響。

用ALP、OC 評價細胞的分化功能，ELISA 酶聯(lián)免疫法測定ALP、OC 濃度的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，各組ALP、OC濃度均增加，對照組增加不明顯。ALP、OC 濃度分別從第三天和第五天開始，同一時間點上各個材料組均顯著高于對照組，并且，ALP、OC 濃度由高到低的順序為Mg-HAnps-RGD-siRNA 組＞HAnps-RGD-siRNA 組＞Mg-HAnps-siRNA 組＞HAnps-siRNA組，由此可以看出只摻雜Mg 或只接枝RGD 可促進ALP、OC 的分泌，但是既摻雜Mg 又接枝RGD 更有利于ALP、OC 的分泌。由此推測摻Mg 和接枝RGD 對成骨細胞的分化有協(xié)同作用。ALP 是成骨細胞早期分泌的細胞外酶蛋白，其表達活性是成骨細胞分化的一個明顯特征[12]；OC 也是成骨細胞合成并分泌的，是成骨細胞成熟的標志；所以ALP 第三天就開始分泌增加，而OC 從第五天才開始變化。有研究表明，Mg 通過激活PI3K/AKt 信號通道使成骨細胞的分化水平增強[13-15]。RGD 能促進材料與細胞之間的黏附，并且有研究表明，接枝RGD 的無機小牛骨粉能促進小鼠成骨細胞的黏附和分化[16]，與本實驗的結(jié)果是相符的。RGD 可抑制破骨細胞與基質(zhì)之間和破骨細胞之間的黏附，從而促進骨組織再生[17]。摻Mg 和接枝RGD 的Mg-HAnps-RGD-siRNA 基因載體系統(tǒng)的協(xié)同作用機制有待進一步研究。

綜上所述，摻Mg 和接枝RGD 的HAnps-siRNA 不影響MG63細胞增殖，帶電HAnps 基因載體系統(tǒng)無細胞毒性，但對MG63 細胞的分化功能有明顯影響，摻Mg 或接枝RGD 均促進成骨細胞分化，既摻Mg 又接枝RGD 的HAnps-siRNA 的載體系統(tǒng)對細胞的分化作用優(yōu)于其他組，并有協(xié)同作用。