郭慶英，劉 敏,*，趙燕娜，吳玉姝，孫 彬，劉 杰，韓 軍

1.聊城大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 聊城 252059 2.聊城大學(xué)生物制藥研究院，山東 聊城 252059

引 言

柔紅霉素[Daunomycin，DNR，圖1(a)]為第一個(gè)臨床應(yīng)用的抗腫瘤抗生素[1]。但其在臨床化療中的不良反應(yīng)，尤其是心臟毒性，使其應(yīng)用受到了限制[2]。微生物藥物學(xué)和腫瘤藥理學(xué)家甄永蘇院士指出：茶多酚與抗腫瘤藥物聯(lián)用具有增效、減毒以及逆轉(zhuǎn)耐藥性的作用，可作為生化調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于臨床[3]。兒茶素類化合物為茶多酚的主要成分，其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯[epigallocatechin-3-gallate,EGCG，圖1(b)]含量最高(約占兒茶素的50%)且具有最大活性[3]。

人血清白蛋白(HSA)是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，因其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)及良好的生物相容性而成為藥物傳輸領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。晶體結(jié)構(gòu)表明HSA由585個(gè)氨基酸組成，包括三個(gè)結(jié)構(gòu)相似的域(Ⅰ—Ⅲ)。藥物與蛋白的結(jié)合直接影響藥物的吸收、分布和代謝方式，進(jìn)而影響藥效的發(fā)揮。EGCG和DNR單一藥物與人血清白蛋白之間的相互作用已有報(bào)導(dǎo)[4-5]。但遺憾的是EGCG對(duì)DNR與人血清白蛋白的相互作用及細(xì)胞毒性的影響尚未見文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。本工作利用熒光光譜法、紫外-可見吸收光譜法、圓二色譜法、動(dòng)態(tài)光散射研究了EGCG存在下DNR與人血清白蛋白的相互作用,測(cè)定了其結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、焓變、熵變等熱力學(xué)參數(shù)，并從微觀結(jié)構(gòu)出發(fā)加以討論。同時(shí)考察了單一藥物、聯(lián)合藥物及藥物與蛋白復(fù)合物對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。所得結(jié)果將為EGCG與DNR的聯(lián)合用藥提供理論基礎(chǔ)。

圖1 DNR (a)和EGCG (b)的分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Molecular structures of DNR (a) and EGCG (b)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和細(xì)胞

人血清白蛋白(HSA，純度≥98%，分子量為66.5 kDa)，鹽酸柔紅霉素(DNR，純度≥98%)，血晶素(純度≥99%) 和四丁基溴化銨(TBAB，純度≥99%) 購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；華法林(純度≥99%) 和布洛芬(純度≥99%)購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；人宮頸癌HeLa細(xì)胞株購(gòu)自武漢普賽諾生命科技有限公司。實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為分析純且使用前無需再次純化。實(shí)驗(yàn)中使用Milli-Q水凈化系統(tǒng)中獲得的去離子水制備溶液。實(shí)驗(yàn)所用緩沖溶液為在不同溫度下配制的pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液(0.05 mol·L-1)。人血清白蛋白的儲(chǔ)備液在4 ℃下儲(chǔ)存過夜。

1.2 儀器

熒光分光光度計(jì)(F-4600型，日立，日本)；紫外分光光度計(jì)(T9CS，北京，中國(guó))；動(dòng)態(tài)光散射儀(Zetasizer Nano ZS，馬爾文，英國(guó))；圓二色光譜儀(J-810，Jasco，日本)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(HERAcell150i，Thermo，美國(guó))；酶標(biāo)儀(Elx 808，Bio tek，美國(guó))。

1.3 熒光光譜

1.3.1 二元體系熒光光譜

在DNR+HSA二元體系中，HSA的濃度為4×10-6mol·L-1，DNR的濃度為(0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4，2.8，3.2，3.6，4.0，4.8)×10-5mol·L-1。激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度均為5.0 nm，測(cè)量溫度為298.2，302.2，306.2和310.2 K，配制好的樣品恒溫30 min后測(cè)定305～420 nm范圍的熒光光譜。固定激發(fā)和發(fā)射的波長(zhǎng)差分別為60和15 nm，其他與上述條件相同，掃描DNR存在下HSA的同步熒光光譜。

1.3.2 位點(diǎn)標(biāo)記

為了確定DNR在蛋白上的結(jié)合位置，用血晶素、華法林和布洛芬為標(biāo)記探針，分別標(biāo)記HSA的ⅠB，ⅡA和ⅢA結(jié)構(gòu)域[6]。首先制備標(biāo)記物與HSA的混合溶液，其中標(biāo)記物與HSA的濃度均為4×10-6mol·L-1，平衡30 min后向上述溶液中加入不同量的DNR溶液，DNR的濃度與二元體系熒光光譜實(shí)驗(yàn)中相同，利用1.3.1中的實(shí)驗(yàn)參數(shù)記錄DNR+(標(biāo)記物+HSA)的熒光數(shù)據(jù)。

1.3.3 三元體系熒光光譜

EGCG存在下的DNR+(EGCG+HSA)三元體系中，EGCG與HSA的摩爾比為1∶1，其他條件均與二元體系熒光光譜實(shí)驗(yàn)一致。

1.4 紫外吸收光譜

HSA的濃度為5×10-6mol·L-1，DNR 的濃度分別為(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0和6.0)×10-5mol·L-1，以pH 7.4的Tris-HCl 緩沖溶液為參比，測(cè)定DNR存在下HSA在245～305 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。

1.5 圓二色光譜

所測(cè)溶液為HSA (2×10-6mol·L-1)、HSA+DNR (HSA∶DNR=1∶5或1∶15)、HSA+EGCG (HSA∶EGCG=1∶2)與(HSA+EGCG)+DNR(HSA∶EGCG∶DNR=1∶2∶15)。掃描波長(zhǎng)為200～250 nm，掃描速率為200 nm·min-1，分辨率為0.1 nm，響應(yīng)時(shí)間為1 s，累積次數(shù)3次。

1.6 動(dòng)態(tài)光散射

HSA的濃度保持為1.5×10-5mol·L-1。HSA+DNR二元體系中，HSA與DNR的摩爾比為1∶5或1∶15。(HSA+EGCG)+DNR三元體系中，HSA∶EGCG∶DNR為1∶2∶15。測(cè)量粒徑前所有溶液皆通過0.22 μm的水系過濾頭(Millipore公司，美國(guó))進(jìn)行過濾，測(cè)量溫度為25 ℃。

1.7 體外細(xì)胞毒性

所用HeLa細(xì)胞株利用DMEM培養(yǎng)基 (含10%胎牛血清和100 U·mL-1的青霉素、鏈霉素)，于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換一次培養(yǎng)液，用胰酶消化并傳代，留取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于MTT實(shí)驗(yàn)，以測(cè)定DNR，HSA+DNR，EGCG+DNR以及HSA+EGCG+DNR復(fù)合物對(duì)HeLa細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性。將HeLa細(xì)胞以3×103個(gè)·孔-1的密度接種在96孔板上，0.1 mL含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，然后用0.1 mL含有藥物或藥物復(fù)合物且不含有血清的培養(yǎng)基替換原先培養(yǎng)基，其中HSA∶DNR=1∶1，HSA∶EGCG∶DNR=1∶1∶1，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入20 μL MTT (PBS配制濃度為5 mg·mL-1)，培養(yǎng)4 h后除去孔中溶液，每孔加入150 mL DMSO使用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜法

2.1.1 DNR對(duì)HSA猝滅機(jī)制的研究

如圖2所示，在激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm時(shí)，HSA在338 nm處產(chǎn)生內(nèi)源熒光。隨著DNR濃度的增大，HSA的熒光強(qiáng)度出現(xiàn)有規(guī)律的降低，峰形和峰位保持不變，表明DNR對(duì)HSA存在熒光猝滅現(xiàn)象，二者存在相互作用。

熒光猝滅機(jī)制分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，可以通過猝滅常數(shù)與溫度的關(guān)系來進(jìn)行判斷。熒光猝滅常數(shù)可利用Stern-Volmer方程求得[7]

F0/F=1+KSV[Q]=1+kqτ0[Q]

(1)

式(1)中，F(xiàn)0和F分別為加入猝滅劑前后HSA的熒光強(qiáng)度，KSV為猝滅常數(shù)，kq為猝滅速率常數(shù)，τ0為HSA的熒光壽命，約為10-8s[8]，[Q]為猝滅劑的濃度。

圖2 pH 7.4，298.2 K下DNR對(duì)HSA的熒光猝滅光譜(DNR∶HSA=1～12)Fig.2 Fluorescence emission spectra of HSA in the presence of DNR (DNR∶HSA=1～12) at 298.2 K,pH 7.4

不同溫度下的F0/F對(duì)DNR濃度作圖均呈良好線性關(guān)系，所得猝滅速率常數(shù)列于表1中。由表1可見，猝滅速率常數(shù)kq數(shù)量級(jí)均為1012，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1，并且可以看出在298.2，302.2，306.2和310.2 K下，隨著溫度的升高HSA的猝滅常數(shù)減小，由此可以推測(cè)出DNR與HSA形成復(fù)合物，此過程為靜態(tài)猝滅過程。

紫外吸收光譜法用于DNR與HSA結(jié)合機(jī)制的驗(yàn)證。不同濃度DNR對(duì)HSA紫外吸收光譜的影響如圖3所示，隨著DNR濃度的增加，HSA吸光度增大，表明DNR與HSA之間形成復(fù)合物。另外對(duì)于靜態(tài)猝滅來說，蛋白的吸收強(qiáng)度由于生成復(fù)合物而改變，動(dòng)態(tài)猝滅則不會(huì)變化。圖3中插圖所示為紫外差譜圖，圖中(HSA+DNR)-DNR吸收譜線與HSA的吸收譜線存在差異，該結(jié)果進(jìn)一步表明DNR與HSA相互作用為靜態(tài)猝滅過程[9]。

圖3 298.2 K時(shí)DNR存在下HSA的紫外吸收光譜圖，插圖為差譜圖，c(HSA)=c(DNR)=5×10-6 mol·L-1Fig.3 Absorption spectra of HSA in the presence of DNR at 298.2 K. The inset corresponds to the absorption spectra of HSA only and the difference absorption spectra between HSA+DNR and DNR at the same concentration,c(HSA)=c(DNR)=5×10-6 mol·L-1

表1 不同溫度下DNR與HSA相互作用的猝滅速率常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和吉布斯自由能變Table 1 Quenching rate constants,binding constants,the number of binding sites and Gibbs free energy changes for the interaction of DNR with HSA at different temperatures

2.1.2 DNR與HSA結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)

對(duì)于靜態(tài)猝滅，相互作用過程中的結(jié)合常數(shù)(Ka)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)可以通過下列方程得到[10]

log[(F0-F)/F]=logKa+nlog([Q]0-n(F0-F)[P]0/F0)

(2)

其中[Q]0和[P]0分別為藥物與蛋白的總濃度。如本課題組前期工作[8]中所述，在Microsoft Excel中賦予n的初值為1，log[(F0-F)/F]對(duì)log([Q]0-n(F0-F)[P]0/F0)作圖并線性擬合得到一個(gè)n值，多次擬合直到n值為定值不再變化。由log[(F0-F)/F]對(duì)log([Q]0-n(F0-F)[P]0/F0)的最終線性作圖(圖4)，所得結(jié)合常數(shù)Ka與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n列于表1中。由表1數(shù)據(jù)可見，所測(cè)溫度下的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n均約為1，表明利用熒光方法所得DNR在HSA上有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。四個(gè)溫度下結(jié)合常數(shù)數(shù)量級(jí)均為104，且隨著溫度升高而增加，表明DNR與HSA的結(jié)合為中等強(qiáng)度的結(jié)合，高溫有利于DNR的結(jié)合。

當(dāng)溫度變化不太大時(shí)，焓變可看作一個(gè)常數(shù)，則焓變和熵變可由298.2，302.2，306.2和310.2 K四個(gè)溫度下DNR與HSA相互作用的結(jié)合常數(shù)利用Van’t Hoff方程式(3)求得[11]

lnKa=-ΔHo/RT+ΔSo/R

(3)

吉布斯自由能變?chǔ)o由式(4)求得[11]

ΔGo=ΔHo-TΔSo=-RTlnKa

(4)

lnKa對(duì)1/T作圖得DNR與HSA相互作用的焓變和熵變分別為40.92±0.52 kJ·mol-1和221.83±1.70 J·mol-1·K-1，表明結(jié)合過程主要為熵驅(qū)動(dòng)，且疏水作用為結(jié)合過程的主要驅(qū)動(dòng)力[12]。

圖4 不同溫度下，DNR+HSA作用的Stern-Volmer曲線Fig.4 Modified Stern-Volmer plots for DNR+HSA interaction at different temperatures

2.1.3 DNR在HSA上的結(jié)合位點(diǎn)

為了確定DNR在HSA上的結(jié)合位置，在298.2 K下分別用血晶素、華法林和布洛芬作為位點(diǎn)ⅠB，ⅡA和ⅢA的特異性探針進(jìn)行了競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。標(biāo)記物存在下，DNR與HSA相互作用的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)列于表2。與不存在標(biāo)記物相比，存在華法林時(shí)DNR與HSA的結(jié)合明顯減弱；布洛芬和血晶素存在下，結(jié)合常數(shù)略有減小，表明DNR與華法林存在競(jìng)爭(zhēng)作用，即主要結(jié)合在HSA的位點(diǎn)ⅡA上。

表2 298.2 K，標(biāo)記物存在下DNR與HSA的結(jié)合常數(shù)(Ka)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)Table 2 Binding constants (Ka) and the number of binding sites (n) for the binding of DNR to HSA in the presence of site markers at 298.2 K

2.1.4 DNR存在下HSA的同步熒光光譜

當(dāng)Δλ為15和60 nm時(shí)，同步熒光分別為酪氨酸和色氨酸殘基的熒光特性。圖5所示為DNR與HSA結(jié)合的同步熒光光譜圖。當(dāng)Δλ=15 nm和Δλ=60 nm時(shí)，同步熒光的最大發(fā)射波長(zhǎng)均沒有明顯變化，表明DNR的加入不會(huì)使色氨酸和酪氨酸周圍的微環(huán)境發(fā)生明顯變化。DNR對(duì)HSA同步熒光的猝滅結(jié)果表明Δλ=60 nm時(shí)的熒光猝滅程度明顯高于Δλ=15 nm時(shí)，這表明Δλ=60 nm時(shí)DNR對(duì)HSA的猝滅更明顯，即DNR在HSA上的結(jié)合位置更接近色氨酸殘基。

2.1.5 EGCG存在下對(duì)DNR與HSA親和力的影響

由標(biāo)記實(shí)驗(yàn)得出DNR結(jié)合于HSA的ⅡA位點(diǎn)，文獻(xiàn)表明EGCG同樣結(jié)合于ⅡA位點(diǎn)[8]。為說明一種藥物的存在對(duì)HSA與另一種藥物親和力的影響，進(jìn)行了三元體系競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。圖6為EGCG存在下DNR與HSA在298.2 K下相互作用的熒光光譜圖。由圖可看見，DNR的加入導(dǎo)致HSA的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步降低，表明EGCG存在下DNR繼續(xù)與HSA結(jié)合。

圖5 HSA (4×10-6 mol·L-1)與DNR (0～4.8×10-5 mol·L-1) 相互作用的同步熒光光譜圖Fig.5 Synchronous fluorescence spectra for the interaction of HSA (4×10-6 mol·L-1) with DNR (0～4.8×10-5 mol·L-1)

圖6 DNR與HSA在EGCG存在下的熒光光譜圖1:HSA；2:HSA+EGCG；3～13:(HSA+EGCG)+DNRFig.6 Fluorescence spectra of DNR+HSA in the presence of EGCG1:HSA；2:HSA+EGCG；3～13:(HSA+EGCG)+DNR

由于EGCG和DNR結(jié)合在蛋白的相同位點(diǎn)上，則可如前期工作[8]所述建立三元體系模型。利用EGCG存在下不同濃度的DNR對(duì)應(yīng)的HSA熒光強(qiáng)度，通過Matlab進(jìn)行非線性最小二乘回歸使實(shí)驗(yàn)測(cè)量的熒光強(qiáng)度Fexp與計(jì)算所求熒光強(qiáng)度Fcalc之差的平方和∑(Fexp-Fcalc)2最小，則可擬合得到EGCG存在下DNR與HSA相互作用的Kα2和n(表3)。由表3可知，DNR在EGCG存在下與HSA作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均明顯減小，這主要是由于EGCG和DNR結(jié)合在HSA的相同位點(diǎn)上，EGCG的存在降低了DNR與HSA的親和力，從而導(dǎo)致DNR的游離濃度增加。此外，當(dāng)溫度由298.2 K升高至310.2 K時(shí)，三元體系的結(jié)合常數(shù)增大，表明EGCG存在下，DNR與HSA的結(jié)合仍為吸熱過程，即EGCG存在下，DNR與HSA的主要作用力仍為疏水作用。

表3 存在和不存在EGCG下，DNR與HSA結(jié)合的結(jié)合常數(shù)(Ka)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)Table 3 Binding constants (Ka) and the number of binding sites (n) for the binding of DNR to HSA in the absence and presence of EGCG

2.2 EGCG存在下DNR與HSA結(jié)合的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

HSA，HSA+DNR及(HSA+EGCG)+DNR的圓二色光譜圖在208和220 nm處出現(xiàn)兩個(gè)負(fù)峰，表明體系中主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成為α-螺旋[13-14]。α-螺旋含量可用式(5)和式(6)計(jì)算[8]

MRE=observed CD/(cp×n×l×10)

(5)

α-helix(%)=[(-MRE208-4 000)/

(33 000-4 000)]×100

(6)

其中，MRE表示殘基橢圓率，cp表示蛋白的濃度，n和l分別為氨基酸殘基數(shù) (585)和光路徑長(zhǎng)度(0.1 cm)。表4中數(shù)據(jù)表明DNR的加入使HSA的α-螺旋含量減少，且隨著DNR濃度增加進(jìn)一步減少，表明DNA的結(jié)合使得HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微變化。EGCG的存在使HSA的α-螺旋含量減少，但是在EGCG存在的三元體系中α-螺旋含量大于相應(yīng)的二元體系的α-螺旋含量，表明兩種藥物存在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，即EGCG的存在阻礙了DNR與HSA的結(jié)合。

表4 存在或不存在EGCG時(shí)，HSA和DNR+HSA的α-螺旋含量與水合粒徑(Dh)Table 4 The α-helical contents and hydrodynamic diameters of HSA and HSA+DNR in the absence and presence of EGCG

2.3 EGCG存在下DNR與HSA結(jié)合的粒徑變化

HSA，HSA+DNR及(HSA+EGCG)+DNR體系的水合粒徑(Dh)值列于表4中。所測(cè)體系的多分散性指數(shù)在0.1～0.2之間，表明即使藥物存在下的二元與三元復(fù)合物的尺寸也呈均勻分布。在DNR與HSA相互作用后，顆粒直徑略微增加，表明由于藥物分子與HSA的結(jié)合導(dǎo)致復(fù)合物結(jié)構(gòu)松散。但是HSA∶DNR=1∶15時(shí)，EGCG的存在使Dh的值相較于二元體系減小，表明EGCG與DNR存在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，EGCG使DNR與HSA的結(jié)合減弱，與CD結(jié)果一致。

2.4 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

通過MTT法測(cè)量DNR，HSA+DNR，EGCG+DNR和HSA+EGCG+DNR對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性。細(xì)胞毒性的計(jì)算方法如式(7)[15]

Cytotxicity=(A-B)/A×100%

(7)

其中，A和B分別為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)及加有藥物或藥物-蛋白復(fù)合物的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞的吸光度。

圖7 DNR，HSA+DNR(a)，EGCG+DNR以及HSA+EGCG+DNR(b)對(duì)HeLa細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性Fig.7 In vitro cytotoxicity of DNR，HSA+DNR (a)，EGCG+DNR and HSA+EGCG+DNR (b) in HeLa Cells

兩種藥物對(duì)同一細(xì)胞的協(xié)同作用可通過式(8)計(jì)算[16]

CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2

(8)

其中，CI表示組合指數(shù)，(Dx)1和(Dx)2為單一藥物作用達(dá)到x%時(shí)藥物的濃度，D1和D2為兩種藥物共同作用達(dá)到x%時(shí)藥物的濃度。本文中，x%指50%抑制。

圖7(a,b)為DNR，HSA+DNR，EGCG+DNR及HSA+EGCG+DNR對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性。由圖看見，DNR對(duì)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性具有劑量依賴性[圖7(a)]。計(jì)算得到上述四個(gè)體系的IC50值分別為(0.09，0.04，0.07和0.01)×10-6mol·L-1。IC50值表明HSA的加入使DNR的細(xì)胞毒性增大，其原因可能為DNR+HSA大分子復(fù)合物更容易使藥物通過內(nèi)吞的形式進(jìn)入細(xì)胞，從而更好地發(fā)揮作用。

CI>1，CI=1和CI<1時(shí)分別表示兩種藥物的加和、拮抗和協(xié)同作用。EGCG+DNR和HSA+EGCG+DNR復(fù)合物的CI50值分別為0.82和0.78，均小于1，表明EGCG與DNR存在協(xié)同作用，并且HSA存在下協(xié)同作用進(jìn)一步增強(qiáng)。這主要是由于EGCG與DNR結(jié)合在HSA的相同位點(diǎn)上，EGCG的存在導(dǎo)致DNR的游離濃度增加。并且藥物與HSA結(jié)合形成的大分子復(fù)合物更容易內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，從而更好地發(fā)揮作用。此結(jié)果表明EGCG能夠增強(qiáng)DNR對(duì)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性。此結(jié)果將為EGCG和DNR用于癌癥聯(lián)合治療提供理論依據(jù)。

3 結(jié) 論

通過多種光譜方法研究了模擬生理?xiàng)l件下DNR與HSA的相互作用以及EGCG對(duì)DNR與HSA結(jié)合的影響。并且通過MTT法考察了單一藥物、組合藥物及其與HSA的復(fù)合物對(duì)HeLa細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DNR與HSA的結(jié)合為靜態(tài)猝滅過程，其結(jié)合過程的主要驅(qū)動(dòng)力為疏水作用力。標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明DNR主要結(jié)合在HSA的位點(diǎn)ⅡA上。同步熒光光譜表明DNR在HSA上的結(jié)合更接近色氨酸殘基。在(HSA+EGCG)+DNR三元體系中，EGCG的存在阻礙了DNR與HSA的結(jié)合，這是由于兩種藥物結(jié)合于HSA的同一位點(diǎn)，而存在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。CD光譜和DLS結(jié)果表明與DNR結(jié)合后蛋白的構(gòu)象發(fā)生了變化，α-螺旋含量減少，蛋白粒徑增大。EGCG存在下α-螺旋含量大于相應(yīng)的二元體系，而粒徑相對(duì)于二元體系的有所減小。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EGCG與DNR的組合對(duì)HeLa細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用。此外，DNR單一藥物和EGCG+DNR組合藥物的細(xì)胞毒性可通過它們與HSA的結(jié)合在一定程度上得到增強(qiáng)。本研究可為EGCG和DNR聯(lián)合用于癌癥臨床治療提供理論依據(jù)。