閆玉棟，姜海行，羅 薇，胡榜利，于 冰，李 凡，付艷君

1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 南寧 530021； 2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實驗研究部； 3.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；4.湖南省長沙市第四人民醫(yī)院藥劑科; 5.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院

研究[1]表明，肝纖維化的進程離不開固有免疫的參與，而廣泛散布于人體各組織、臟器,巨噬細胞是其重要的一份子，它們利用自身免疫特性可影響肝纖維化的進展。巨噬細胞因其有高度可塑性為人熟知，在脂多糖(LPS)所致的炎性環(huán)境下，其可轉(zhuǎn)變?yōu)榻?jīng)典活化型(M1)，而IL-4營造的抗炎環(huán)境可促其分化為替代活化型(M2)。這兩種不同類型的巨噬細胞，在疾病發(fā)展過程中起到不同作用[2]，巨噬細胞在肝臟炎癥和纖維化形成過程中，扮演核心角色[3]，以上兩種類型巨噬細胞可通過不同途徑，影響肝纖維化進展，M1型巨噬細胞可通過增加肝臟星狀細胞的凋亡和對內(nèi)源性巨噬細胞的募集作用，改善CCl4肝纖維化小鼠的肝臟纖維化[4]，巨噬細胞可被間充質(zhì)細胞誘導(dǎo)向M2型轉(zhuǎn)化，并改善肝纖維化[5]。白藜蘆醇是一類多酚類化合物，具有良好的抗炎、抗氧化、抗腫瘤活性等藥理作用[6]，研究表明LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞炎性反應(yīng)可被白藜蘆醇顯著降低，其主要途徑是抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等致炎因子的表達，促進LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞向其M2型轉(zhuǎn)化[7]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有抑制大鼠肝星狀細胞增殖作用，通過抑制肝星狀細胞和抗氧化作用來發(fā)揮抗肝纖維化作用[8]，有研究證實M1型巨噬細胞可被白藜蘆醇誘導(dǎo)為M2型，抑制小鼠肝纖維化進展[9]，提示白藜蘆醇通過改變巨噬細胞極化方向，以達到抗肝纖維化作用，但其機制尚未闡明。NF-κB通路是已經(jīng)被證實的炎癥反應(yīng)和細胞免疫中的重要通路之一，肝纖維化的發(fā)病過程也有它的參與[10]，阻斷TLR4/MyD88/MAPK/NF-κB可改善肝纖維化小鼠的肝臟纖維化情況[11]，NF-κB作為該通路上的關(guān)鍵炎癥因子之一，便于檢測且對調(diào)節(jié)炎癥走向非常重要。然而，目前尚不清楚白藜蘆醇是否通過這種途徑抗肝纖維化，本研究將進行體內(nèi)和體外實驗，通過抑制肝組織M1型巨噬細胞內(nèi)的NF-κB通路來明確白藜蘆醇是否可經(jīng)該通路抗肝纖維化。

1 材料與方法

1.1 材料BALB/C小鼠18只(雄性、健康)，體質(zhì)量20～22 g，6～8周齡(購自廣西壯族自治區(qū)動物中心)。CCl4(上海國藥集團)、白藜蘆醇粉劑(上海TCI 公司)、橄欖油(上海國藥集團)、Masson三色染色試劑盒(南京建成科技公司)、胎牛血清(美國 GIBCO)、DMEM 培養(yǎng)基(美國 GIBCO)、4%多聚甲醛固定液(北京索萊寶科技有限公司)、脂多糖(美國 SIGMA)、磷酸鹽緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)、青鏈霉素混合液(100×)(北京索萊寶科技有限公司)，30%丙烯酰胺、pH8.8 HCl(北京索萊寶科技有限公司)、pH6.8 HCl(北京索萊寶科技有限公司)、過硫酸銨(北京索萊寶科技有限公司)、TEMED(美國Sigma公司)，PVDF膜(美國Merck Millipore公司)，RAW264.7 細胞系(購自美國 ATCC)。柱式動物組織總RNA抽提純化試劑盒(上海生物工程公司)、Real-time qPCR 試劑盒(Takara 寶生生物工程有限公司)，5×蛋白上樣緩沖液(北京索萊寶科技有限公司),一抗稀釋液、二抗稀釋液(北京索萊寶科技有限公司)，玻璃板、制膠架、電源、電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽(美國伯樂公司)，NF-κB抗體(兔抗，美國CST公司)、二抗(兔抗700W Licor公司)。

1.2 建立各組小鼠模型小鼠按隨機原則分為3組，每組6只。分別予橄欖油、橄欖油+CCl4、橄欖油+CCl4+白藜蘆醇腹腔內(nèi)注射，橄欖油和CCl4用量為2 mg/kg，白藜蘆醇用量為400 mg·kg-1·d-1[12]，CCl4溶于橄欖油中，濃度為10%；白藜蘆醇均勻混于橄欖油中，20 g/L，用法及造模時間均為2次/周，持續(xù)5周，造模過程中干預(yù)組動物死亡2只。

1.3 小鼠標本留取造模滿5周后，將小鼠麻醉后采眶動脈及眶靜脈血，4 ℃靜止放置3 h后離心(2 000 r/min，5 min)，留上清-80 ℃存放。然后剪開小鼠腹部皮膚及腹膜，暴露下腔靜脈和肝門靜脈，用磷酸鹽緩沖液(PBS)經(jīng)肝臟門脈進行灌注，至肝臟顏色發(fā)白，剪破下腔靜脈，反復(fù)沖洗，充分釋放肝內(nèi)血液，將整個肝臟完整取下。部分肝臟先于液氮內(nèi)放置5 min，再轉(zhuǎn)-80 ℃存放，其余肝臟固定于10%甲醛溶液中。

1.4 Masson檢測肝組織纖維化組織固定24 h后，依次經(jīng)水洗、脫水、透明及包埋等處理后切片(片厚3～4 μm)。切片后常規(guī)脫蠟、水化；按說明書依次滴加試劑A-Masson、C-磷鉬酸、D-苯胺藍、B-分化液等，再經(jīng)脫水、透明、封片后，即可觀察、攝片。采用Masson三色染色法進行肝臟膠原纖維染色，用CMIAS 圖像分析系統(tǒng)來分析Masson圖像。

1.5 LPS誘導(dǎo)M0巨噬細胞極化先用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基孵育RAW264.7巨噬細胞18 h，再在無血清培養(yǎng)基內(nèi)中性培育24 h后，分為PBS對照組、LPS(100 ng/ml)組、LPS(100 ng/ml)+白藜蘆醇(30 μmol/L)組，前兩者分別刺激24 h，最后一組用LPS刺激24 h后，再加入白藜蘆醇刺激24 h，將細胞及其上清液分開收集，用于后續(xù)各項指標的檢測。

1.6 RT-PCR檢測NF-κB mRNA表達量采用Trizol法提取細胞總RNA。用瓊脂糖凝膠電泳驗證總RNA提取質(zhì)量，用紫外分光光度計測定總RNA水平。將總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA(37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s)，然后進行加樣、擴增，擴增采用Applied biosystems 7500進行，采用兩步法標準擴增程序，所用基因引物由上海Invitrogen公司提供，NF-κB核苷酸序列引物見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer of sequence

1.7 Western blotting檢測NF-κB蛋白表達量利用裂解液裂解小鼠肝臟,超聲波室溫勻漿0.5～1 min，然后4 ℃，14 000×g離心 5 min。取上清液獲得蛋白樣品，按1∶4比例加入5×蛋白上樣緩沖液沸水中煮15 min充分變性。依次經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、洗膜、室溫封閉、洗膜、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜、紅外熒光掃膜儀等步驟，獲得目的條帶，對所獲條帶進行量化分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，三組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇能抑制小鼠肝纖維化進展Masson染色結(jié)果顯示，使用CCl4腹腔注射造模后，在第5周白藜蘆醇干預(yù)組肝纖維化程度較CCl4組明顯減輕，提示其可改善肝纖維化(見圖1)。

注：A： 各組小鼠肝組織的Masson染色， 膠原纖維呈藍色，細胞核呈藍褐色， 細胞質(zhì)、肌纖維及紅細胞呈紅色，CCl4組及白藜蘆醇干預(yù)組可見大量肝細胞變性、壞死，肝臟原有結(jié)構(gòu)破壞，纖維增生明顯，箭頭所指位置可見假小葉形成，CCl4組最為明顯， 白藜蘆醇干預(yù)組次之，正常組無(放大200倍)；B：各組小鼠第5周肝組織Masson染色累積光密度值比較。與正常對照組比較，**P<0.05。

2.2 白藜蘆醇能降低肝纖維化小鼠肝組織中NF-κB mRNA表達水平RT-PCR法測定各組動物肝組織中NF-κB1 mRNA含量，CCl4組NF-κB mRNA的表達量較正常組高，白藜蘆醇干預(yù)后的肝纖維化模型小鼠肝組織中的NF-κB mRNA表達水平較CCl4組下降(見圖2)。

2.3 白藜蘆醇能降低肝纖維化小鼠肝組織中NF-κB蛋白表達分離提取肝組織中的蛋白后，Western blotting檢測顯示，肝纖維化組織中的NF-κB蛋白表達水平比正常肝組織的表達水平明顯升高，而使用白藜蘆醇干預(yù)小鼠肝纖維化模型后，肝組織表達的NF-κB蛋白較CCl4組顯著下降(見圖3)。

2.4 白藜蘆醇能抑制M1型巨噬細胞中NK-κB mRNA表達RT-PCR法檢測各組巨噬細胞模型中NF-κB mRNA結(jié)果顯示，NF-κB mRNA表達量由高到低依次為M1>M1+白藜蘆醇>M0(見圖4)。

注：與正常對照組比較，*P<0.05, **P<0.01。

注：與正常對照組比較，*P<0.05, **P<0.01。

圖4 白藜蘆醇可抑制M1型巨噬細胞內(nèi)NF-κB mRNA表達Fig 4 Expression of NF-κB mRNA in M1-type macrophages inhibited by Resveratrol

2.5 白藜蘆醇可抑制M1型巨噬細胞中NF-κB蛋白的表達Western blotting數(shù)據(jù)提示，M1型巨噬細胞產(chǎn)生的NF-κB蛋白量高于M0型，而白藜蘆醇干預(yù)M1型巨噬細胞使其NF-κB蛋白水平下降，提示其可抑制NF-κB蛋白表達(見圖5)。

3 討論

多種慢性肝病導(dǎo)致肝纖維化成為我國高發(fā)病之一，隨之而來的肝硬化嚴重危害國民健康。研究表明，肝纖維化的加重伴隨肝內(nèi)M1型巨噬細胞和炎癥細胞數(shù)量上升，而M2型巨噬細胞數(shù)量變化與M1型相反；肝纖維化的緩解伴隨肝內(nèi)炎性細胞數(shù)量下降，M1型巨噬細胞數(shù)量隨肝纖維化緩解而下降，而M2型則相應(yīng)增多；不難看出,M2型巨噬細胞改善肝纖維化，而M1型巨噬細胞加速肝纖維化進展[13]。

注：與M0巨噬細胞比較，*P<0.05, **P<0.01。

白藜蘆醇在哺乳類動物體內(nèi)生物利用度相對較低，主要以結(jié)合形式分布在肝臟、腎臟、心臟和腦等血流灌注豐富的器官，其他組織也有分布[14]。既往的體外細胞實驗表明，白藜蘆醇可促進M0型巨噬細胞轉(zhuǎn)化為M2型，并強化白介素10(IL-10)等抗炎因子的釋放，以減緩肝纖維化進展[9]。本研究在小鼠肝纖維化模型中使用白藜蘆醇干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)肝組織纖維化程度明顯改善，與既往報道結(jié)果相符。

已有研究提示，白藜蘆醇是利用其對多條信號通路的調(diào)控來實現(xiàn)其抗炎及免疫調(diào)節(jié)功能，有文獻報道其可通過降低NF-κB通路活化來緩解炎癥反應(yīng)。El-Sheikh等[15]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的多器官毒性的保護作用可能與抑制NF-κB/TNF-α途徑有關(guān)。而NF-κB通路已被證實與肝纖維的發(fā)病密切相關(guān)，一些藥物可以通過抑制該通路發(fā)揮抗肝纖維化作用。

本研究中，肝纖維化模型中NF-κB通路活性明顯增高，用白藜蘆醇抑制該通路活性后，肝纖維化情況得到改善，巨噬細胞模型檢測結(jié)果提示，白藜蘆醇可能是通過抑制肝纖維化小鼠肝內(nèi)M1型巨噬細胞的NF-κB通路活性來延緩肝纖維進程。

綜上所述，白藜蘆醇延緩肝纖維化的作用機制之一為抑制肝內(nèi)M1型巨噬細胞中NF-κB通路的活性。