張曉倩， 楊 慧， 孟 蝶， 張曉華

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院感染科，山西 太原 030001

隨著近年來(lái)新藥的不斷涌現(xiàn)及臨床用藥的增多，藥物性肝損傷(drug induced liver injury, DILI)的發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)。繼2014年美國(guó)和2015年中國(guó)發(fā)布DILI臨床實(shí)踐指南后,歐洲肝病學(xué)會(huì)(EASL)于2019年正式批準(zhǔn)并發(fā)布了最新DILI指南。將其定義為各類(lèi)處方或非處方的化學(xué)藥物、生物試劑、傳統(tǒng)中藥、天然藥品、保健品、膳食補(bǔ)充劑及其代謝產(chǎn)物乃至輔料所誘發(fā)的肝損傷[1]。該病病因多樣、致病機(jī)制復(fù)雜，迄今仍缺乏簡(jiǎn)便、客觀、特異的診斷及病情預(yù)測(cè)指標(biāo)，但藥物及其代謝產(chǎn)物的直接肝毒性及特異質(zhì)性肝毒性致病過(guò)程中均伴隨有明顯的炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)[2]。核因子相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)作為調(diào)控細(xì)胞氧化損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其與抗氧化反應(yīng)原件(antioxidant response element, ARE)被視作內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的核心調(diào)控通路。當(dāng)細(xì)胞受到氧化損傷刺激時(shí)，Nrf2轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核與ARE結(jié)合，進(jìn)而通過(guò)調(diào)控其下游靶基因血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1, HO-1)發(fā)揮強(qiáng)大的抗炎、抗氧化和細(xì)胞保護(hù)作用[3]。

目前，Nrf2、HO-1已被證實(shí)在多種肝臟損傷中發(fā)揮著重要的作用，但在DILI患者血清中的水平及同病情的相關(guān)性鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)急性藥物性肝損傷(acute drug induced liver injury, ADILI)患者血清中Nrf2、HO-1的含量并分析其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，旨在探討二者在ADILI中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料納入2018年6月至2018年10月就診于山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院的ADILI患者60例，男30例，女30例，年齡(52.3±10.4)歲(27～68歲)。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均符合2019年EASL最新發(fā)布的藥物性肝損傷指南[1]的診斷標(biāo)準(zhǔn)及國(guó)際嚴(yán)重不良反應(yīng)協(xié)會(huì)(iSAEC)于2011年的DILI生化學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，并結(jié)合羅素·烏克拉夫因果關(guān)系評(píng)估方法(Roussel Uclaf Causality Assessment Method, RUCAM)[5]及患者用藥史、臨床表現(xiàn)、肝功能檢查等綜合做出診斷。建議調(diào)整為出現(xiàn)以下任一情況：(1)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)≥5 正常值上限(ULN)；(2) 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)≥2 ULN，特別是伴 5-核甘酸酶 (5-NT) 或谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(glutamyl transpeptidase, GGT)升高且排除骨病所致的 ALP 升高；(3)ALT≥3 ULN且總膽紅素(total bilirubin, TBIL)≥2 ULN。 排除標(biāo)準(zhǔn)：合并病毒性肝炎、自身免疫性肝病、非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、各種原因肝硬化的患者；合并妊娠期、哺乳期的患者；合并腫瘤及肝臟衰竭的患者；有骨骼性疾病、血流動(dòng)力學(xué)障礙性疾病、遺傳代謝性疾病等患者；影像學(xué)(超聲和CT及MRI、MRCP、ERCP)有肝外梗阻性疾病的患者。

另收集同期健康體檢人群60名作為對(duì)照組，男30名，女30名，年齡(51.6±9.8)歲(26～65歲)。兩組性別比例、年齡、體質(zhì)量指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性?；颊呒凹覍僖押炇鹬橥鈺?shū)，并通過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

相關(guān)定義：ADILI患者根據(jù)醫(yī)學(xué)科學(xué)國(guó)際組織委員會(huì)(CIOMS)提出的DILI分型標(biāo)準(zhǔn)：(1)肝細(xì)胞損傷型: ALT≥3 ULN，且 R≥5；(2)膽汁淤積型:ALP ≥2 ULN，且R≤2；(3)混合型:ALT≥3 ULN，ALP≥2 ULN，且 2

1.2 方法研究對(duì)象均于入院次日清晨空腹采集靜脈血5 ml，分離血清，采用日本全自動(dòng)生化分析儀(日立7180型號(hào))及羅氏試劑進(jìn)行患者生化指標(biāo)檢測(cè)，如TBIL、直接膽紅素(direct bilirubin, DBIL)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、ALT、ALP、GGT及總膽汁酸(total bile acid，TBA)等；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血清中Nrf2、HO-1的含量，試劑盒選自上海優(yōu)選生物科技有限公司，均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 ADILI患者與健康對(duì)照組各血清指標(biāo)比較ADILI組ALT、AST、ALP、GGT、TBA、TBIL、DBIL、Nrf2及HO-1均顯著高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)(見(jiàn)表1)。

2.2 不同病理?yè)p傷類(lèi)型ADILI患者血清中Nrf2和HO-1的含量比較Nrf2的含量在三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其在膽汁淤積型患者血清中的含量顯著高于肝細(xì)胞損傷型(P=0.006)，與混合型相比雖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.346)但也呈現(xiàn)升高趨勢(shì)；而肝細(xì)胞損傷型與混合型患者Nrf2含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.138)。HO-1的含量在三組中雖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但在膽汁淤積型患者中其含量同樣高于肝細(xì)胞損傷型及混合型(見(jiàn)圖1)。

表1 ADILI組及健康對(duì)照組各指標(biāo)的比較Tab 1 Comparison of indicators in patients with ADILI and healthy controls

圖1 Nrf2和HO-1在不同病理?yè)p傷類(lèi)型ADILI患者血清中含量的比較 A: Nrf2含量；B: HO-1含量

Fig 1 Comparison of serum levels of Nrf2 and HO-1 in ADILI patients with different pathological injury typesA: serum levels of Nrf2；B: serum levels of HO-1

2.3 ADILI患者血清中Nrf2、HO-1與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性分析ADILI患者血清中Nrf2、HO-1水平與ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與ALP、GGT無(wú)線性相關(guān)性(P>0.05,見(jiàn)表2)。

表2 ADILI患者血清Nrf2、HO-1水平與ALT等指標(biāo)的相關(guān)性分析Tab 2 Correlation analysis of serum levels of Nrf2, HO-1 with ALT and other indicators in patients with ADILI

2.4 血清中Nrf2及HO-1對(duì)ADILI病情評(píng)估價(jià)值ROC曲線分析結(jié)果顯示，以Nrf2=516.14 U/L作為最佳截?cái)嘀?預(yù)測(cè)ADILI疾病的敏感度為95.0%，特異度為77.1%，曲線下面積為0.918,標(biāo)準(zhǔn)誤為0.029；以HO-1=15.19 U/L作為最佳截?cái)嘀?，預(yù)測(cè)該疾病的敏感度為75.1%，特異度為60.9%，曲線下面為0.799，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.053(P均<0.001， 見(jiàn)圖2)。

圖2 Nrf2及HO-1預(yù)測(cè)ADILI疾病病情的敏感度及特異度

3 討論

肝臟作為人類(lèi)重要的代謝器官，在藥物的生物轉(zhuǎn)化及清除中有著重要的作用，各種藥物及其代謝產(chǎn)物均可能對(duì)肝臟產(chǎn)生毒性作用，誘發(fā)肝臟損傷，甚至肝功能衰竭的發(fā)生。臨床上以ADILI較為常見(jiàn)，約占急性肝損傷住院及門(mén)診患者的20%[6]。近年來(lái)DILI的相關(guān)致病機(jī)制研究中，藥物及代謝產(chǎn)物的直接肝毒性及特異質(zhì)性肝毒性這兩種機(jī)制已得到廣泛的認(rèn)可。如臨床常見(jiàn)的致肝損傷藥物對(duì)乙酰氨基酚，當(dāng)攝入高于推薦劑量時(shí)，由于葡萄糖醛酸化和硫酸化代謝途徑飽和，導(dǎo)致被細(xì)胞色素P4502E1代謝，產(chǎn)生N-乙?；?對(duì)苯醌亞胺，而N-乙酰基-對(duì)苯醌亞胺則作為誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的中間代謝產(chǎn)物激活c-Jun N-末端激酶并消耗谷胱甘肽，誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生，導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷[7]。除此之外，對(duì)乙酰氨基酚還可激活Kupffer 細(xì)胞，增加轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor α，TGFα)、白細(xì)胞介素β(interleukin，ILβ)等炎癥因子，導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激[8]。藥物誘導(dǎo)的肝損傷機(jī)制還表明，線粒體是藥物毒性的關(guān)鍵靶標(biāo)，藥物直接或間接產(chǎn)生的活性產(chǎn)物促使線粒體發(fā)生氧化應(yīng)激，進(jìn)一步造成線粒體DNA的損傷，導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)化(MPT)孔開(kāi)放，從而引起肝臟損傷[9]。相關(guān)臨床研究還發(fā)現(xiàn)，某些中藥的致肝損傷機(jī)制也是由于藥物本身或其代謝產(chǎn)物可打破抗氧化及氧化系統(tǒng)的平衡，產(chǎn)生大量的氧自由基，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[10]。以上均證明，炎癥及氧化應(yīng)激參與了DILI的發(fā)生、發(fā)展。

Nrf2作為抵御氧化應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)因子，一般與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein-1, KEAP-1)結(jié)合于胞質(zhì)內(nèi)，處于抑制狀態(tài)，當(dāng)接受到胞外氧化應(yīng)激信號(hào)刺激后，Nrf2與KEAP-1發(fā)生解離，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，然后與ARE結(jié)合并激活其下游HO-1等抗氧化酶的產(chǎn)生而發(fā)揮抗氧化、抗炎等細(xì)胞保護(hù)作用，從而保護(hù)肝細(xì)胞免受氧化應(yīng)激[11]。Jadeja等[12]在使用對(duì)乙酰氨基酚所致的DILI動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞中Nrf2核轉(zhuǎn)位增加，同時(shí)幾種Nrf2靶基因的表達(dá)也隨之增加。在臨床觀察中也顯示ADILI患者血清中Nrf2、HO-1的含量明顯高于健康對(duì)照組，表明Nrf2/HO-1作為人體中重要的抗氧化通路之一，為避免肝細(xì)胞過(guò)度損傷，可能在氧化損傷發(fā)生時(shí)代償性表達(dá)增加，通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化反應(yīng)來(lái)保護(hù)肝臟。藥物及代謝產(chǎn)物在肝臟的堆積還可損傷及堵塞膽道，使具有毒性的膽汁酸在膽道內(nèi)蓄積，引起膽汁淤積，其機(jī)制涉及膽鹽輸出泵(bile salt export pump, BSEP)及多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein, MRP)的表達(dá)減少和缺失[13-14]。已有研究指出，Nrf2/HO-1作為抗氧化通路可以發(fā)揮協(xié)同作用上調(diào)BSEP和MRP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，促進(jìn)膽汁酸的排泄，減輕肝臟損傷[15-16]，我們研究結(jié)果中，Nrf2、HO-1的含量隨TBA的升高而下降，且肝細(xì)胞損傷型DILI患者血清中二者含量相對(duì)較低，這可能與患者血清中Nrf2、HO-1低表達(dá)，無(wú)法有效上調(diào)BSEP和MRP，使膽汁酸蓄積，進(jìn)一步加重肝細(xì)胞損傷有關(guān)。特異質(zhì)DILI的機(jī)制與免疫及炎癥應(yīng)激也密切相關(guān)，何首烏等導(dǎo)致大鼠血清中IL-2、IL-6、TGF-β等炎癥因子的過(guò)度表達(dá)，可誘發(fā)炎癥應(yīng)激相關(guān)的特異質(zhì)肝損傷[17]，而上調(diào)Nrf2和靶基因HO-1表達(dá)，可降低血清中 IL-6、TGF-β等炎癥因子的水平，在敲除Nrf2后，其抗炎作用被消除，無(wú)法保護(hù)受損的肝細(xì)胞[18]?？梢?jiàn)Nrf2、HO-1與特異性DILI的發(fā)生、發(fā)展也有一定關(guān)聯(lián)，二者可能對(duì)疾病的診斷及療效判斷具有一定的臨床意義。

準(zhǔn)確評(píng)價(jià)藥物潛在的肝毒性和早期預(yù)測(cè)DILI的發(fā)生對(duì)于藥物應(yīng)用、臨床診斷及對(duì)癥治療至關(guān)重要。目前，血清 ALT、ALP、GGT 和 TBIL等改變是判斷是否有肝損傷和診斷藥物性肝損傷的主要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，且DILI的嚴(yán)重程度依據(jù)ALT、ALP是否可以恢復(fù)性升高及TBIL的高低進(jìn)行分級(jí)[19]，但對(duì)于DILI的病情進(jìn)展缺乏較為敏感及特異性的指標(biāo)。本研究顯示，Nrf2、HO-1的含量在肝細(xì)胞損傷性ADILI中的含量相對(duì)較低，且隨損傷指標(biāo)ALT、AST、TBIL的升高而下降，說(shuō)明Nrf2、HO-1在ADILI存在的情況下，隨著肝臟損傷程度的加重，其代償修復(fù)機(jī)制可逐漸被耗竭而出現(xiàn)下降。我們進(jìn)一步利用ROC發(fā)現(xiàn)，Nrf2對(duì)評(píng)估DILI病情的預(yù)測(cè)敏感性為95.0%，HO-1的敏感性為75.1%，這提示我們可以通過(guò)觀察患者血清中Nrf2、HO-1的含量變化來(lái)評(píng)估DILI的疾病進(jìn)展，但其特異性相對(duì)較低，還需結(jié)合其他臨床指標(biāo)進(jìn)行疾病評(píng)估。Copple等[20]最新研究也證明，Nrf2是臨床DILI關(guān)注度較低的敏感指標(biāo)，但對(duì)比相對(duì)特異性指標(biāo)ALT、TBIL，對(duì)于后期階段的預(yù)測(cè)更有價(jià)值。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)Nrf2和HO-1在ADILI患者血清中的含量明顯升高，但隨著肝細(xì)胞損傷指標(biāo)的增加而下降，二者的表達(dá)水平可能作為急性藥物性肝臟損傷疾病進(jìn)展及動(dòng)態(tài)變化轉(zhuǎn)歸較為敏感的預(yù)測(cè)指標(biāo)。但藥物性膽汁淤積形成機(jī)制復(fù)雜，判斷及驗(yàn)證指標(biāo)多樣，與Nrf2、HO-1關(guān)系的追蹤也尚待擴(kuò)大病例數(shù)及延長(zhǎng)觀察時(shí)間進(jìn)一步總結(jié)完善。