李 合，田由京，張 浩，陳興超

海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普通外科，海南 海口 570102

目前，結(jié)直腸癌是全球第三高發(fā)病率的腫瘤性疾病，與其他實體腫瘤相似，結(jié)直腸癌的死亡率往往是由轉(zhuǎn)移引起的[1-2]。目前臨床上用于監(jiān)測結(jié)直腸癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的唯一生物標志物是血清癌胚抗原(CEA)。層粘連蛋白同樣可參與包括增殖、黏附、遷移、侵襲和血管生成等，這些過程通過整合素信號介導[3-5]。在這些糖蛋白中，層粘連蛋白-1(LAMB1)被觀察到在E1細胞中過度分泌，而之前并未發(fā)現(xiàn)其在結(jié)直腸癌細胞中分泌[6-7]。本研究通過收集參與者的血液，分析LAMB1在結(jié)直腸癌中的濃度及與相關病理分型的關系，并通過ROC曲線判斷其對結(jié)直腸癌的診斷作用?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集在我院普通外科住院并由結(jié)腸鏡活檢病理學診斷為結(jié)直腸癌患者80例作為結(jié)直腸癌組，男42例，女38例，年齡(54.84±5.7)歲(40～75歲)。納入標準：(1)符合結(jié)直腸癌臨床癥狀、影像學及病理學診斷標準；(2)入組前未接受任何治療，包括放療、化療、靶向藥物及手術治療的患者；(3)自愿簽署知情同意書。排除標準：(1)未能按照預期完成研究的患者；(2)既往已確診結(jié)直腸癌，并接受抗癌治療或復發(fā)的患者；(3)存在肝腎功能損傷、心臟及其他臟器功能異常的患者；(4)合并其他系統(tǒng)腫瘤者。

對照組為符合納入及排除標準的未患結(jié)直腸癌的同期住院患者80例，男39例，女41例，年齡(55.12±3.2)歲(45～70歲)。納入標準：(1)未患任何癌癥的患者；(2)無結(jié)直腸癌的家族史；(3)近3個月內(nèi)影像學及結(jié)腸鏡檢查明確無結(jié)直腸癌；(4)自愿簽署知情同意書。排除標準：(1)既往患有其他系統(tǒng)腫瘤疾?。?2)存在肝腎功能損傷、心臟及其他臟器功能異常；(3)妊娠期女性。本研究經(jīng)過我院評審委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及處理：所有入組者在空腹情況下(8 h未進食任何食物和水)采集外周靜脈血5 ml，于低溫離心機，1 500 r/min離心10 min，使用1 ml加樣槍緩慢將上層血清吸入1.5 ml EP管中并分裝，保存于-80 ℃冰箱中待檢測。

1.2.2 血清中LAMB1和CEA濃度的檢測：使用USCN Life Sciences(SEA184Hu)提供的ELISA試劑盒測定血清樣本中LAMB1和CEA的濃度。ELISA過程中所有洗版步驟均采用ELx50微板帶式洗版機(BioTek，Winooski)進行。使用酶標儀(Thermo Fisher)對樣本OD450 nm的吸光度進行檢測。所有的ELISA數(shù)據(jù)采用OriginPro 8.6(OriginLabs)統(tǒng)計軟件進行分析。ELISA具體操作步驟：(1)加樣：取出孵育相應抗體的ELISA試劑盒，將稀釋好的樣品加入酶標反應孔中，每樣品至少加3孔，每孔100 μl，置于37 ℃，40～60 min；(2)洗滌：用洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍3 min；(3)加入酶標抗體：根據(jù)酶結(jié)合物提供商提供的參考工作稀釋度進行稀釋，37 ℃孵育30～60 min；(4)洗滌：用洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍3 min；(5)終止反應：每孔加入終止液50 μl終止反應，于20 min內(nèi)測定實驗結(jié)果；(6)檢測結(jié)果：用酶標儀對樣本OD450 nm的吸光度進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者血清中LAMB1與CEA的比較結(jié)直腸癌組患者血清中的LAMB1含量明顯高于對照組(t=29.712，P=0.000)，結(jié)直腸癌組患者血清中的CEA含量明顯高于對照組(t=23.125，P=0.001)(見表1)。

2.2 結(jié)直腸癌患者血清中LAMB1、CEA與臨床特征的關系結(jié)直腸癌患者血清中的LAMB1含量和CEA與性別、年齡、腫瘤直徑及腫瘤部位無相關性(P>0.05)；但與腫瘤浸潤深度及TNM分期呈正相關(P<0.05)，與結(jié)直腸癌分化程度呈負相關(P<0.05)(見表2)。

表1 兩組患者血清中LAMB1和CEA的比較 Tab 1 Comparison of serum LAMB1 and CEA between two groups

表2 結(jié)直腸癌患者血清中的LAMB1、CEA與臨床特征的關系Tab 2 Relationship of levels of serum LAMB1 and CEA in colorectal cancer patients with clinical characteristics

續(xù)表2

臨床特征例數(shù)LAMB1/(pg/ml)CEA/(ng/ml)P1值P2值分化程度0.0340.038 高分化2189.95±8.126.31±1.22 中分化1998.82±7.037.01±1.29 低分化40107.96±10.237.54±1.25TNM分期0.0120.015 Ⅰ～Ⅱ期4586.51±3.996.32±1.71 Ⅲ期35106.22±9.877.92±1.12

注：P1值為LAMB1含量與病理分型關系的比較；P2值為CEA含量與病理分型關系的比較。

2.3ROC曲線評估及分析評估LAMB1、CEA對結(jié)直腸癌的診斷效果，在區(qū)分結(jié)直腸癌組與對照組時，LAMB1對結(jié)直腸癌診斷時的ROC曲線下面積(AUC)為0.887，臨界值為89.02 pg/ml，CEA對結(jié)直腸癌診斷時的AUC為0.842，臨界值為5.02 ng/ml，LAMB1與CEA同時對結(jié)直腸癌診斷時的AUC為0.901，表明LAMB1對結(jié)直腸癌的診斷具有一定效果，尤其與CEA聯(lián)合檢測時準確率更高(見圖1)。

圖1 單獨或聯(lián)合檢測血清中LAMB1與CEA水平的ROC曲線Fig 1 ROC curve of levels of serum LAMB1 and CEA detected alone or combination

3 討論

結(jié)直腸癌Ⅳ期患者的5年生存率為8.1%，較Ⅲc期患者的44.3%大幅下降。結(jié)直腸癌患者最常見的遠處轉(zhuǎn)移形式是肝轉(zhuǎn)移[8]。在診斷時，約1/4的患者會出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移(同步轉(zhuǎn)移)，另有25%～30%的患者隨后會在肝臟中發(fā)展為繼發(fā)性腫瘤。即使患者接受手術切除，約有1/2的患者會復發(fā)，超過60%的患者與肝相關[9-11]。

層粘連蛋白(LAMB)是組成基底膜最豐富的非膠原糖蛋白。已鑒定出超過14種層粘連蛋白亞型，每一種均具有不同的組織分布和功能[11]。目前，人們對腫瘤中分泌蛋白的富集也越來越感興趣，以增強對低豐度腫瘤特異性生物標志物的檢測。在各種用于富集分泌蛋白的策略中，糖蛋白富集是最常用的方法之一。在各種富集技術中，多凝集素親和層析法(MLAC)是最有效、最靈活、最經(jīng)濟的糖蛋白捕獲方法之一。LAMB1的YIGSR肽被證明與67 kDa層粘連蛋白受體(LamR)結(jié)合，這種相互作用被發(fā)現(xiàn)促進細胞黏附[12]。后續(xù)研究進一步表明，LamR還可能參與增殖、血管生成、遷移和侵襲。此外，LamR的過表達已被證明與結(jié)直腸癌的進展和轉(zhuǎn)移有關[13]。因此，過度分泌LAMB1及其受體LamR的過度表達可能在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。另一方面，LAMB1的機制也可以通過其所附的碳水化合物分子來介導。由于糖基化模式的改變是癌癥進展的一個常見特征，碳水化合物分子的增加或修飾可能導致LAMB1的相應增加。我們的發(fā)現(xiàn)與文獻中的幾篇報道相似，在文獻中發(fā)現(xiàn)LAMB1在肝細胞癌組織中表達增加[14-15]，并與角蛋白-19共同表達，與肝細胞癌預后不良相關。因此，由于目前尚無任何結(jié)直腸癌臨床樣本中LAMB1的研究，我們決定進一步驗證結(jié)直腸癌患者血清樣本中LAMB1的水平。

結(jié)直腸癌手術切除后常規(guī)監(jiān)測CEA水平，因為高CEA水平已被證明與患者預后較差相關[16]。然而，CEA的升高也可能發(fā)生在炎癥條件下，如肝炎和炎癥性腸病。此外，文獻中關于CEA對結(jié)直腸癌預后的作用存在相互矛盾的數(shù)據(jù)[17-18]。因此，迫切需要具有更高靈敏度和特異度的新型生物標志物來改善患者預后。本研究中我們通過收集結(jié)直腸癌患者及未患結(jié)直腸癌疾病對照的血清樣本，并采用ELISA法分別檢測LAMB1和CEA的含量，結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組患者血清中的LAMB1和CEA含量明顯高于未患結(jié)直腸癌的對照組，結(jié)果表明，結(jié)直腸癌組患者血清中的LAMB1含量變化可能與CEA一樣作為結(jié)直腸癌診斷的新型生物標志物。同樣，有學者研究顯示，LAMB1基因在耐化學反應的結(jié)直腸癌中上調(diào)[19]，并與潰瘍性結(jié)腸炎相關，而潰瘍性結(jié)腸炎已知會增加結(jié)直腸癌的風險。此外，據(jù)報道，在結(jié)直腸癌患者中發(fā)現(xiàn)了LAMB1錯義/無義突變，在不同的研究中觀察到的頻率為1%～4.5%。目前，只有Lin等[20]對結(jié)直腸癌患者血清LAMB水平進行了研究，但他們研究中使用的抗層粘連蛋白酶免疫檢測試劑盒似乎針對的是LAMB1鏈。我們需要進一步研究結(jié)直腸癌患者血清中的LAMB1濃度與患者的臨床病理分型及預后的關系，在本研究中結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者血清中的LAMB1和CEA與性別、年齡、腫瘤直徑及腫瘤部位無相關性，但與腫瘤浸潤深度及TNM分期均呈正相關，與結(jié)直腸癌分化程度呈負相關。

此外，我們觀察到LAMB1比CEA具有更好的診斷性能。單分析LAMB1、單分析CEA及同時分析LAMB1與CEA對結(jié)直腸癌診斷時的AUC分別為0.887、0.842及0.901，ROC分析表明，LAMB1在區(qū)分結(jié)直腸癌患者和對照者方面優(yōu)于CEA。此外，LAMB1聯(lián)合CEA可進一步提高診斷性能。與CEA聯(lián)合應用時，可將結(jié)直腸癌患者與未患結(jié)直腸癌對照者區(qū)分開。這表明LAMB1可能作為一種血清學生物標志物用于結(jié)直腸癌的診斷。

綜上所述，LAMB1在結(jié)直腸癌患者血清中的表達情況可反映患者病理分型，并且對于結(jié)直腸癌的診斷具有較高的準確率。雖然我們的研究結(jié)果表明分泌的LAMB1可能參與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移，但其確切機制尚不清楚。