韓 冰， 申玉翠， 王 慧， 張其勝

上海市第四人民醫(yī)院消化科，上海 200081

結(jié)直腸癌是我國發(fā)病率及死亡率占前5位的惡性腫瘤之一，2014年全國結(jié)直腸癌發(fā)病率為27.47/10萬，死亡率為13.27/10萬[1]。近20年，結(jié)直腸癌在發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率明顯下降，但在我國卻呈升高趨勢，這一增長變化值得關(guān)注[2]。結(jié)直腸癌作為一種十分常見且死亡率較高的惡性腫瘤[3-4]，非常適合且有必要實行大范圍和針對性的篩查工作，也是國際上公認(rèn)的可以通過人群篩查的手段來早期發(fā)現(xiàn)從而降低死亡率的惡性腫瘤之一。目前應(yīng)用非常普遍的篩查方法是糞便隱血試驗(gFOBT/FIT)，但均有其限制性，因此，為了提高篩查的性能，必須探索替代或互補(bǔ)的檢測方法。

人們發(fā)現(xiàn)DNA甲基化修飾可以調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，糞便DNA的檢測是一種基于腫瘤細(xì)胞脫落進(jìn)入腸腔，檢測其中突變DNA的方法。研究表明，以單個基因甲基化為糞便DNA篩查標(biāo)記，檢測結(jié)直腸癌敏感性為38%～94%，檢測結(jié)直腸腺瘤的敏感性為31%～70%，特異性為79%～100%[6]。Vimentin是中間絲纖維蛋白家族的一員，與微絲、微管共同維持細(xì)胞骨架構(gòu)象，它與腫瘤的惡性程度及腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移、侵襲和細(xì)胞信號傳導(dǎo)有關(guān)。Vimentin基因啟動子甲基化與其表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)，這與結(jié)直腸癌及其癌前病變的產(chǎn)生相關(guān)[4-5]。SFRP2基因定位于染色體 4q31.3，包含2個內(nèi)含子和3個外顯子，第1個外顯子周圍有著高密度的 CpG島，與腫瘤細(xì)胞 DNA甲基化密切相關(guān)，是腫瘤發(fā)生通路—Wnt信號通路的信號拮抗因子之一，SFRP2基因在結(jié)直腸癌及其癌前病變中發(fā)生頻繁的超甲基化，與結(jié)直腸癌密切相關(guān)[7-8]。因此，本研究在眾多結(jié)直腸癌早期篩查的DNA甲基化標(biāo)記中，選取Vimentin 和SFRP2作為研究對象，旨在探討糞便中Vimentin和SFRP2基因甲基化狀態(tài)與結(jié)直腸癌及其癌前病變的關(guān)系，并進(jìn)一步評價其在結(jié)直腸癌篩查中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2017年6月1日至2018年12月31日在上海市第四人民醫(yī)院接受結(jié)腸鏡檢查者，經(jīng)我院病理明確診斷為結(jié)直腸癌或進(jìn)展期腺瘤，留取其糞便標(biāo)本。結(jié)直腸癌組納入患者23例，其中男13例，女10例，確診年齡(70.7±10.7)歲，進(jìn)展期腺瘤組納入患者24例，其中男10例，女14例，確診時年齡(65.6±11.1)歲。納入要求：(1)腫瘤患者均為首次確診病例，無復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移；(2)收集標(biāo)本前未行藥物治療或操作性腸道檢查。 排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他部位腫瘤；(2)腫瘤患者檢查前已接受手術(shù)或放化療等；(3)合并其他腸道器質(zhì)性疾病者如炎癥性腸病、腸結(jié)核等；(4)因不能耐受或腸道準(zhǔn)備差而未完成全結(jié)腸檢查者。同時收集結(jié)腸鏡檢查陰性的健康人群糞便標(biāo)本作為正常對照。正常對照組共22名，其中男12名，女10名，年齡(57.2±14.4)歲。本研究已獲取上海市第四人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本處理所有研究對象均在術(shù)前或內(nèi)鏡檢查前留取清晨新鮮糞便標(biāo)本，糞便標(biāo)本收集后2 h內(nèi)進(jìn)行分裝，置于-80 ℃冰箱保存。所有標(biāo)本均行免疫法糞便隱血試驗檢測(FIT)。

1.3 研究方法

1.3.1 主要試劑和儀器：QlAamp DNA Stool Mini Kit購自德國Qiagen公司；Epi Tect?Bisulfite Kit 購自德國Qiagen公司； TaKaRa EpiTaq TMHS酶購自寶生物工程(大連)有限公司；全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)Tanon-2500購自上海天能。

1.3.2 糞便DNA提?。喝?00 mg糞便樣本根據(jù)QIAamp DNA Stool Mini Kit操作步驟進(jìn)行DNA抽提。

1.3.3 DNA的轉(zhuǎn)化和純化：取DNA 1μg，根據(jù)Epi Tect?Bisulfite Kit操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)化和純化，即完成DNA亞硫酸氫鹽的修飾。

1.3.4 甲基化特異性PCR反應(yīng)(MSP)：(1) 引物設(shè)計和合成：根據(jù)Vimentin和SFRP2基因CpG島序列由上海生工公司設(shè)計合成引物(見表1)；(2)反應(yīng)體系：PCR Buffer 2 μl+引物1 μl+轉(zhuǎn)化后的DNA 1 μl+dNTP Mix 2 μl+MgCl22 μl+Ex Taq HS 1.25 μl+H2O 10.75 μl；Vimentin循環(huán)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，67 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，37個循環(huán)；SFRP2循環(huán)條件：95 ℃ 9 min，95 ℃ 45 s，70 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 10 min，45個循環(huán)。配制質(zhì)量濃度為20 g/L瓊脂糖凝膠2 g+1×TAE 100 ml微波爐融化+5 μl EB染料，在膠槽中冷卻后電泳。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩樣本率的比較采用χ2或Fisher精確檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糞便單個Vimentin和SFRP2基因甲基化檢出情況結(jié)直腸癌組中糞便單個Vimentin和SFRP2基因甲基化陽性檢出率分別為82.6%(19/23)和69.6%(16/23)，進(jìn)展期腺瘤組為62.5%(15/24)和41.7%(10/24)，正常對照組為13.6%(3/22)和13.6%(3/22)。結(jié)直腸癌組單個基因甲基化檢出率高于正常對照組(Vimentin：χ2=21.41，P<0.01；SFRP2：χ2=14.42，P<0.01)，進(jìn)展期腺瘤組糞便單個基因甲基化檢出率也高于正常對照組(Vimentin：χ2=11.51，P<0.01；SFRP2：χ2=4.45，P<0.05)，結(jié)直腸癌組糞便單個基因甲基化檢出率與進(jìn)展期腺瘤相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Vimentin：χ2=2.37，P>0.05；SFRP2：χ2=3.70，P>0.05)(見圖1)。

表1 Vimentin和SFRP2基因的甲基化和非甲基化特異性PCR序列引物Tab 1 Methylated and non-methylated specific PCR primers of Vimentin and SFRP2

圖1 各組糞便Vimentin和SFRP2基因MSP檢測結(jié)果 A：結(jié)直腸癌組；B：進(jìn)展期腺瘤組；C:正常對照組Fig 1 MSP results of fecal Vimentin and SFRP2 in each group A: colorectal cancer group; B: advanced adenoma group; C: control group

2.2 聯(lián)合糞便Vimentin和SFRP2基因甲基化檢測的靈敏度和特異度聯(lián)合檢測時只要有1項檢測為陽性即判定該樣本為陽性，各種檢測方法在不同組別的靈敏度和特異度如表2所示。Vimentin和SFRP2兩個基因聯(lián)合檢測在結(jié)腸癌組中的靈敏度為87.0%，高于FIT靈敏度56.5%(χ2=5.25，P<0.05)，與單基因檢測相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Vimentin：χ2=0.17，P>0.05；SFRP2：χ2=2.04，P>0.05)。進(jìn)展期腺瘤組中基因聯(lián)合檢測的靈敏度為70.8%，高于單個SFRP2靈敏度41.7%(χ2=4.15，P<0.05)和FIT靈敏度29.2%(χ2=8.33，P<0.01)，與單基因Vimentin靈敏度(62.5%)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.38，P>0.05)。在正常對照組中，基因聯(lián)合檢測的特異度為86.4%，與單基因特異度相同，與FIT特異度(72.7%)相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.26，P>0.05)。

表2 不同檢測方法靈敏度和特異度比較

2.3 糞便Vimentin和SFRP2基因甲基化與進(jìn)展期腺瘤病理資料的關(guān)系單基因和聯(lián)合基因甲基化檢測在進(jìn)展期腺瘤組中不同病理類型之間的檢出率如表3 所示。Vimentin與SFRP2單基因甲基化檢測在不同病理類型中檢出率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。聯(lián)合基因在管狀腺瘤中檢出率高于SFRP2(χ2=4.9，P<0.05)，與Vimentin比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.18，P>0.05)；在絨毛狀管狀腺瘤和管狀腺瘤/絨毛狀管狀腺瘤中，聯(lián)合基因檢出率與Vimentin相同，與SFRP2比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(絨毛狀管狀腺瘤：χ2=0.44，P>0.05；管狀腺瘤/絨毛狀管狀腺瘤：χ2=1.67，P>0.05)。聯(lián)合基因檢出率在伴有低級別上皮內(nèi)瘤變中與單基因檢測差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Vimentin：χ2=0.53，P>0.05；SFRP2：χ2=3.14，P>0.05)，在高級別上皮內(nèi)瘤變中與Vimentin相同，與SFRP2比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.17，P>0.05)。另外，聯(lián)合基因在管狀腺瘤中檢出率比絨毛狀管狀腺瘤高(χ2=7.36，P<0.05)，與管狀腺瘤/絨毛狀管狀腺瘤相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.71，P>0.05)，在上皮內(nèi)瘤變亞組中檢出率的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.02，P>0.05)。

表3 糞便基因甲基化與進(jìn)展期腺瘤病理資料的關(guān)系Tab 3 Relationship between fecal gene methylation and pathological data of advanced adenoma %

注：χ2：單個基因甲基化在進(jìn)展期腺瘤不同亞組中檢出率比較的卡方值，P均>0.05。

3 討論

結(jié)直腸癌起病隱匿，早期往往無明顯的臨床表現(xiàn)，當(dāng)出現(xiàn)癥狀時大多已到了中晚期，治療方法較為局限，生存率也急劇下降，因此，加強(qiáng)人群結(jié)直腸癌篩查及探索合適有效的篩查方法，對于提高早期腫瘤的檢出率和降低死亡率有重要意義。

研究表明，DNA甲基化狀態(tài)改變與結(jié)直腸癌關(guān)系密切，并且貫穿腫瘤發(fā)生、發(fā)展的整個過程。異常甲基化的改變往往發(fā)生在腫瘤早期，對于近端和遠(yuǎn)端結(jié)直腸癌及較大腺瘤的檢測具有同等高的效率[9]，同時，甲基化標(biāo)記也具有穩(wěn)定性強(qiáng)和易檢測的特點。一般而言，基因聯(lián)合檢測要比單個基因檢測性能更好[10]，因為聯(lián)合檢測能夠覆蓋多種腫瘤形成的分子途徑，具有潛在的應(yīng)用價值。

在本研究中，結(jié)直腸癌患者糞便中Vimentin和SFRP2單個基因甲基化的靈敏度分別為82.6%和69.6%，基因聯(lián)合檢測的靈敏度為87.0%，較單基因檢測略高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。進(jìn)展期腺瘤患者糞便中Vimentin和SFRP2單個基因甲基化的靈敏度分別為62.5%和41.7%，基因聯(lián)合檢測的靈敏度為70.8%，較SFRP2高，但與Vimnetin比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。正常對照組中，基因聯(lián)合檢測的特異度為86.4%，與單基因相同。糞便Vimentin單基因檢測在結(jié)直腸癌進(jìn)展期瘤中的靈敏度與國外文獻(xiàn)中的81%和65.5%相仿，特異度均為86.4%，較文獻(xiàn)中的82%相仿甚至略高[11]。單基因SFRP2檢測在結(jié)直腸癌和進(jìn)展期腺瘤中的靈敏度比國外文獻(xiàn)資料中的77%～94%和62%～74%較低，特異度均為86.4%，與文獻(xiàn)中77%～93%一致[12]。在國內(nèi)，糞便DNA檢測起步較晚，發(fā)展速度較為緩慢，缺少大規(guī)模的篩查數(shù)據(jù)或部分資料仍在收集過程中[13]，現(xiàn)有的國內(nèi)資料顯示，糞便Vimentin和SFPR2單基因檢測在結(jié)直腸癌中的靈敏度為36%～55%和70%～88%，進(jìn)展期腺瘤的靈敏度為22.5%～48%和46%～64%，特異度為86.5%～93.3%和93.3%～100%[14-18]，靈敏度普遍較國外資料中的數(shù)據(jù)低，特異度與之相仿或略高。這些國內(nèi)外數(shù)據(jù)的差異可能與樣本量大小和甲基化檢測方法不同有關(guān)。理論上而言，聯(lián)合基因檢測比單基因性能更好，但此次研究結(jié)果來看優(yōu)勢卻并不十分明顯，考慮與樣本量較小有關(guān)。

FIT是使用標(biāo)記抗體檢測糞便中人體的血紅蛋白，具有價格低廉、操作簡便、非創(chuàng)傷性等優(yōu)點，是目前結(jié)直腸癌篩查應(yīng)用較為普遍的方法，但其靈敏度和特異度存在一定的不足。 在本研究中，F(xiàn)IT對結(jié)直腸癌和進(jìn)展期腺瘤檢測的靈敏度分別為56.5%和29.2%， 與文獻(xiàn)報道的73.8%和23.8%相比[19]，在結(jié)直腸癌組中偏低,在進(jìn)展期腺癌組中相仿甚至略高，但明顯低于Vimentin和SFRP2基因聯(lián)合的靈敏度。FIT檢測的特異度為72.7%，比基因聯(lián)合檢測略低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。需要說明的是，F(xiàn)IT有時需要多次采樣，且結(jié)果受腸道其他疾病的影響，如炎癥性腸病、腸道炎癥、腸結(jié)核、結(jié)腸毛細(xì)血管擴(kuò)張、消化道其他腫瘤等，本研究未納入該類患者作為干擾項來評判糞便DNA與FIT在結(jié)直腸癌篩查中的作用，這需要在今后的工作后進(jìn)一步完善。但與FIT相比，Vimentin和SFRP2聯(lián)合檢測在結(jié)直腸癌及進(jìn)展期腺瘤的靈敏度上具有明顯優(yōu)勢。

結(jié)直腸癌大多是通過“腺瘤-癌”的途徑發(fā)生演變，需要10～20年，結(jié)腸腺瘤發(fā)展成浸潤性癌的年轉(zhuǎn)化率約為0.25%[20]，但進(jìn)展期腺瘤[21](具備直徑≥10 mm、有25% 以上的絨毛成分、有高級別異型增生中的任一條即可)發(fā)展為浸潤性癌的年轉(zhuǎn)化率高，為2.6%～5.7%[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，Vimentin和SFRP2單基因檢測在不同病理亞型或上皮內(nèi)瘤變中檢出率相仿，但基因聯(lián)合在管狀腺瘤中較單個SFRP2檢出率高，其余無論在其他病理類型中或是不同上皮內(nèi)瘤變中聯(lián)合基因雖大多較單個基因檢出率高，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。同時，聯(lián)合基因在檢測管狀腺瘤中更占優(yōu)勢，但在伴有高級別上皮內(nèi)瘤變中檢出情況的優(yōu)勢不明顯。在該部分的研究結(jié)果中，似乎聯(lián)合基因檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義的項目并不多，考慮原因可能在病理亞型中樣本未能平均分配，且部分樣本量過少(1～3個)，從而極大程度地影響了統(tǒng)計結(jié)果。雖然結(jié)果并不十分令人滿意，但顯現(xiàn)出一定的有利趨勢，因此，聯(lián)合基因檢測在進(jìn)展期腺瘤亞型分類中的應(yīng)用價值仍值得期待。

結(jié)腸鏡檢查及病理是確診結(jié)直腸癌及其癌前病變最確切有效的方法，但我國幅員遼闊，人口基數(shù)大，如所有篩查對象都采用結(jié)腸鏡檢查，將會產(chǎn)生龐大的應(yīng)檢人群，與現(xiàn)有的醫(yī)療資源不相符[23]。結(jié)直腸癌篩查作為一項大規(guī)模的檢測項目，需要具備幾個重要特點[24]，包括低風(fēng)險性、較高的特異度和靈敏度。一項好的無創(chuàng)性的篩查項目不僅可以提高公眾居民對此次及之后檢查的依從性，更有機(jī)會增加一些偏遠(yuǎn)地區(qū)不流通的人口參與進(jìn)入結(jié)直腸癌篩查中來。作為一種新興、非侵入性的結(jié)直腸癌早期診斷方法，糞便DNA檢測技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生且飛速發(fā)展，它符合“精準(zhǔn)醫(yī)療”概念并且遵從“精準(zhǔn)醫(yī)療”趨勢，現(xiàn)已成為篩查結(jié)直腸腫瘤的有效手段之一[25]。但糞便DNA檢測最大的限制在于其費(fèi)用昂貴，成本效益較低，國內(nèi)缺乏大樣本的研究證據(jù)，因此，目前尚無法廣泛應(yīng)用。不過，2018年美國癌癥協(xié)會更新了結(jié)直腸癌篩查的指南[26]，其中提到建議每年1次FIT，每3年1次mt-sDNA(多靶點糞便DNA)，值得我們借鑒。

綜上所述，聯(lián)合檢測糞便中Vimentin和SFRP2甲基化狀態(tài)的性能優(yōu)于單基因和FIT檢測，有望成為結(jié)直腸癌篩查的新途徑[27]， 但其中仍舊存在一些問題有待進(jìn)一步研究和解決。