王 娜，曠歷瓊，楊 英，王 黎，李 媛，王效杰，王 珺，彭 程

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 1.干部保健中心； 2.消化內科，新疆 烏魯木齊 830001

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease, GERD)是一種常見消化系統(tǒng)疾病，主要由胃、腸分泌液及內容物逆流侵蝕食管或組織黏膜而引起[1]。除食管外，咽喉部、呼吸道及口腔等處都可受累產生局部炎癥反應，進而出現臨床癥狀，即食管外表現。但由于對GERD食管外表現復雜多樣，其相關癥狀無統(tǒng)一的診斷標準，常導致誤診而影響治療[2]。加之GERD在不同地區(qū)發(fā)病率及癥狀表現存在明顯差異，更需要針對不同地區(qū)人群的研究來服務于臨床[3]。白細胞介素-1β(IL-1β)作為體內一種重要的炎性介質，能夠通過多種途徑調節(jié)胃酸分泌[4]，近來不斷有研究認為IL-1β在啟動子-511位點基因多態(tài)性與GERD發(fā)生密切相關[5]。但既往研究多停留在GERD易感性層面，少有對遺傳因素與GERD食管外表現差異的深入分析。本研究針對新疆地區(qū)GERD患者食管外表現進行流行病學研究，并分析其與白介素IL-1β基因多態(tài)性的相關性，以期為新疆地區(qū)GERD診治提供新的研究思路，推動我國GERD相關理論的發(fā)展和完善。

1 資料與方法

1.1 研究對象持續(xù)納入2018年1月至2019年4月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院確診為GERD并愿意配合此次研究的門診或住院患者，主要來自消化內科、耳鼻喉科和呼吸科、干部保健中心、微創(chuàng)外科。通過自制問卷在門診或病房搜集患者一般狀況及飲食情況并錄入醫(yī)院信息管理系統(tǒng)(HIS)，最后通過HIS匯總患者信息。在研究開始前對研究團隊成員進行統(tǒng)一的問卷培訓，調查過程中，使用統(tǒng)一的指導語并對問卷進行相應的解釋，以提高應答率及問卷完成的質量。本研究在開展前獲得本院倫理委員會的審核批準，并在倫理委員會的監(jiān)督指導下進行。

1.2 納入及排除標準納入標準：(1)臨床確診為GERD：胃食管反流病量表(gastroesophageal reflux disease questionnaire，Gerd Q)≥8分[6]；(2)年齡為20～75歲；(3)接受胃鏡檢查并同意提供胃黏膜樣本進行基因檢測；(4)愿意配合此次研究并簽署知情同意書。

排除標準：(1)繼發(fā)性食管炎，如胃食管手術后食管炎、合并消化性潰瘍、霉菌等感染因素有關的食管炎；(2)合并腹水、上呼吸道感染、惡性腫瘤及腸梗阻；(3)咳嗽變異性哮喘(CVA)、上氣道咳嗽綜合征(UACS)及嗜酸細胞性支氣管炎(EB)等引起有咳嗽癥狀的疾?。?4)嚴重的心、肺、腎、腦及肝臟疾病。

1.3 食管外表現診斷反流性咳嗽的診斷：依據2009年中華醫(yī)學會呼吸病學分會《咳嗽的診斷與治療指南》[7]，即慢性咳嗽，以白天咳嗽為主；24 h食管pH值監(jiān)測Demeester積分≥12.70，和(或)SAP≥75%；抗反流治療后咳嗽明顯減輕或消失。反流性咽喉炎的診斷：以針對纖維鏡檢查的反流性咽喉炎患者設立的反流體征評分量表(reflux finding score，RFS)作為評估標準，當RFS總分≥7分(總分26分)[8]時確診。反流性哮喘的診斷：哮喘診斷遵循2016年中華醫(yī)學會《支氣管哮喘防治指南》[9]相關標準，同時滿足以下條件：排除其他原因引起的哮喘如過敏性哮喘、運動性哮喘、感染性哮喘及嚴重哮喘持續(xù)發(fā)作期；經抗酸治療(標準劑量的質子泵抑制劑)后癥狀緩解或消失。

1.4 IL-1β-511位點基因多態(tài)性檢測方法選取所有食管外表現GERD患者，并從無外表現組患者中隨機抽取170例，取以上患者胃鏡檢查中獲得黏膜組織約100 mg，使用天根組織基因組DNA提取試劑盒(DP-304)提取基因組DNA，嚴格按照試劑盒說明書指導進行操作，無特殊變動。參照文獻[10]報道利用Primer5進行引物設計，PCR引物由北京鼎國生物技術工程有限責任公司合成。rs16944上游引物片段5′-TTGCAAACCATCTACCACAAGTT-3′，下游引物片段5′-CAGAGCTCATCTGGCATTGA-3′。PCR反應總體系為40 μl，反應液為：10×buffer(含Mg2+，20 μM/L)4 μl，dNTP(10 μM/L)1 μl，TaqDNA聚合酶(2 U/L)1 μl，模板DNA 1 μl，上下游引物各1 μl(10 μM/L)，加ddH2O至40 μl，在PTC-100 PCR擴增儀上擴增。反應程序：95 ℃預變性5 min，進入循環(huán)，95 ℃變性45 s，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。反應結束后取5 μl擴增產物于1TAE緩沖液中用質量濃度為10 g/L瓊脂糖凝膠電泳20 min(恒壓150 V)，電泳結果在凝膠成像系統(tǒng)下拍照并保存。PCR擴增產物由北京鼎國生物技術工程有限責任公司測序，采用正向測序方法，結果返回后對相應位點分型并記錄。

2 結果

2.1 新疆地區(qū)GERD患者食管外表現發(fā)生率研究期間共納入1 100例GERD患者，其中維族468例，漢族632例，年齡(50.00±12.60)歲(32～75歲)，體質量(70.32±14.58)kg(50～90.5 kg)。共524例患者出現食管外表現，其中30例患者同時發(fā)生反流性咽炎和反流性咳嗽，28例同時發(fā)生反流性咽炎和反流性哮喘，26例同時發(fā)生反流性咳嗽和反流性哮喘。新疆地區(qū)反流性咽喉炎、反流性咳嗽和反流性哮喘的發(fā)生率分別為26.91%、16.09%和12.27%。漢族患者食管外表現發(fā)生率總體低于維族(P=0.001)，但反流性咽喉炎發(fā)生率高于維族患者(P=0.001)，具體結果見表1。

表1 新疆地區(qū)GERD食管外表現的發(fā)生率[n(%)] Tab 1 Incidence of extra-esophageal manifestations in patients with GERD in Xinjiang region [n(%)]

2.2 新疆地區(qū)GERD患者IL-1β-511位點基因Hardy-Weinberg檢驗對rs16944位點基因型觀察值與期望值進行Hardy-Weinberg平衡分析，結果顯示，反流性咽喉炎(χ2=2.988，P=0.223)、反流性咳嗽(χ2=3.589，P=0.166)、反流性哮喘(χ2=3.944，P=0.139)以及無食管外表現組(χ2=3.782，P=0.151)吻合度良好。

2.3 IL-1β-511基因表型在不同新疆GERD食管外表現分布進一步對食管外表現組與無食管外表現組基因型差異分析顯示，無食管外表現組基因啟動子IL-1β-511等位基因G攜帶占比57.1%，高于反流性咽喉炎組(P<0.001)、反流性咳嗽組(P<0.001)與哮喘組(P<0.001)?；蛐头植挤治鲲@示，反流性咽喉炎(χ2=17.477，P<0.001)、反流性咳嗽(χ2=14.413，P=0.001)以及反流性哮喘(χ2=14.373，P=0.001)與無食管外表現人群相比,差異均有統(tǒng)計學意義，具體結果見表2。

表2 新疆GERD患者發(fā)生食管外表現IL-1β-511基因多態(tài)性[n(%)]Tab 2 IL-1β-511 gene polymorphism in GERD patients with extra-esophageal manifestations in Xinjiang region [n(%)]

注：*：與無食管外表現人群比較。

2.4 新疆地區(qū)GERD患者食管外表現影響因素的單因素分析對比有無食管外表現患者一般資料、飲食習慣和IL-1β-511基因型等進行單因素差異分析。結果顯示，兩組患者在性別、年齡、BMI資料相近，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而維族患者食管外發(fā)生率高于漢族患者，肉食、辛辣、高鹽飲食習慣及飲酒史更易導致食管外表現發(fā)生(P<0.05)。IL-1β-511基因型分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，具體結果見表3。

表3 新疆地區(qū)GERD食管外表現影響因素的單因素分析Tab 3 Univariate analysis of extra-esophageal manifestations in GERD patients in Xinjiang region

注：高鹽飲食的標準為：每日食鹽攝入量超過10 g/L；飲食結構分為肉食為主和素食為主，肉食為主的標準為：每周3次及以上食用肉食，每次食用肉食>100 g，2次以下為素食為主。IL-1β-511分析中無食管外表現組總例數為170。

2.5 IL-1β-511基因遺傳變異與食管外表現相關性分析在對出現食管外表現危險因素分析的基礎上，對IL-1β-511基因遺傳變異與不同食管外表現癥狀進行多因素Logistic回歸分析，其中因變量賦值(0=無食管外表現，1=相應外表現癥狀)。在校正民族、飲食結構、高鹽飲食、辛辣飲食幾個潛在影響因素后，基因型模型分析顯示，G等位基因增加對反流性咽喉炎(OR=0.656，95%CI：0.434～0.993)、反流性咳嗽(OR=0.886，95%CI：0.802～0.979)、反流性哮喘(OR=0.777，95%CI：0.650～0.929)均為保護因素；而顯性模型分析中同樣顯示AG與GG基因型是出現食管外表現(咽喉炎、咳嗽、哮喘)的保護因素，具體結果見表4。

表4 IL-1β-511基因遺傳變異與新疆地區(qū)GERD食管外表現關聯Tab 4 Correlation between IL-1β-511 gene polymorphism and extra-esophageal manifestations in Xinjiang region

注：基因型模型中的OR值表示控制民族、飲食結構、高鹽飲食、辛辣飲食等因素后，G等位基因數每增加一個食管外表現發(fā)生風險；顯性模型中的OR值表示控制民族、飲食結構、高鹽飲食、辛辣飲食等因素后，與A等位基因純合基因型比較，G等位基因雜合和純合型對食管外表現發(fā)生風險的影響。

3 討論

GERD除典型臨床癥狀胃灼熱和反酸外，還具有慢性咳嗽、聲音嘶啞、咽部異物感、慢性鼻炎、哮喘等食管外癥狀，部分患者甚至因食管外癥狀突出而就診于其他的科室，以致延誤GERD的診斷和治療[11]。國外報道，超過30%的GERD患者出現過食管外表現癥狀[12]。國內學者在回顧性分析上海市200例GERD患者中，95例合并有食管外表現，發(fā)生率達47.5%[13]。最近的研究顯示，國內GERD食管外表現主要以反流性咽喉炎、反流性哮喘和反流性咳嗽最為常見[14]。本文通過對新疆地區(qū)1 100例GERD患者反流性咽喉炎、反流性哮喘和反流性咳嗽發(fā)生情況匯總分析，結果顯示，新疆地區(qū)524例食管外表現并發(fā)率為47.64%，與既往研究報道相近。但對不同民族進行亞組分析發(fā)現，新疆地區(qū)漢族患者食管外表現(43.20%)明顯低于維族患者(53.63%)。這可能與維吾爾族生活和飲食習慣有關，雖然漢族與維吾爾族共同居住新疆，但受到宗教信仰、經濟條件和語言文化等多因素影響，飲食和生活習慣存在較大差異。維族人群飲食結構偏向肉食和高脂飲食，且維族男性普遍吸煙、飲烈酒，暴露更多的食管外表現危險因素，更易誘發(fā)食管外表現。進一步對不同民族食管外表現癥狀分析發(fā)現，維族患者更易發(fā)生反流性咳嗽與哮喘，而漢族患者反流性咽喉炎的發(fā)生概率更高。新疆地區(qū)漢族人群更多從事室內工作，更易受到室內外溫差大的刺激，同時缺少運動，加之漢族人群多為外地來疆工作，新疆地域遼闊，自然環(huán)境復雜且與國內其他地區(qū)相差較大，因此，漢族患者咽部黏膜更易受到刺激，誘發(fā)咽喉炎癥狀。

GERD食管外表現不僅受到生活習慣、飲食結構、心理壓力等因素的影響，大量研究發(fā)現，遺傳因素與GERD的發(fā)病機制密切相關，并可能參與GERD食管外表現癥狀的發(fā)生、發(fā)展。本文對IL-1β-511位點基因多態(tài)性分析顯示，其基因型分布在是否出現食管外表現患者中存在明顯差異(χ2=26.987，P<0.001)。IL-1β是由Th1細胞分泌的重要促炎癥細胞因子，IL-1β在胃黏膜中表達水平升高，能夠提升胃體內炎癥水平，通過破壞胃壁細胞生理功能而減少胃酸分泌，從而減弱食管反流中高酸性對食管的刺激，保護食管黏膜[15]。同時IL-1β位點基因多態(tài)性與H.pylori感染GERD患者胃黏膜IL-1β表達密切關聯，提示IL-1β可能直接參與胃黏膜清除H.pylori，并抑制感染帶來的胃酸分泌[16]。最近一篇薈萃分析報道再次確認IL-1β-511基因多態(tài)性與GERD發(fā)生存在密切相關性[17]。

IL-1β-511位點堿基突變后，能夠增加IL-1β蛋白的表達。Kim等[18]研究發(fā)現，GERD患者中IL-1β-511 TT基因型患者胃黏膜中IL-1β表達明顯增加，亞組分析發(fā)現IL-1β在反流性食管炎患者中表達相較于非糜爛性胃食管反流和健康受試者中明顯較少，提示IL-1β-511基因型與不同外表現癥狀可能存在相關性。在觀察到新疆地區(qū)GERD食管外表現組患者IL-1β-511基因型分布與非癥狀組存在明顯差異后，我們進一步對等位基因和基因型與發(fā)生不同食管外表現的相關性進行深入分析?；貧w分析顯示在校正了飲食因素和民族差異后，G等位基因的突變仍是食管外表現(反流性咽喉炎、咳嗽、哮喘)發(fā)生的保護因素，顯性模型分析也證實AG與GG型GERD患者發(fā)生食管外表現癥狀危險度降低。

目前主流觀念認為GERD患者并發(fā)反流性咽喉炎、咳嗽和哮喘有相近的病理基礎，均可能與酸性物質的反流，以及反流物微粒刺激迷走神經，引起咽喉部及支氣管和肺部的相應癥狀。同時反流物對途經組織(咽喉、吸道黏膜、氣管、支氣管等)刺激誘導局部高炎癥反應，造成組織損傷進而誘發(fā)相應癥狀。而IL-1β-511位點T堿基突變后，促使IL-1β蛋白表達增加，作為胃酸的強拮抗劑，能夠直接中和胃酸過多帶來的刺激；同時IL-1β表達提高，能夠加速壁細胞破壞腺體，抑制胃酸分泌。以上兩種途徑均可減少GERD酸性反流物對外部組織的刺激，可能對食管外表現起到保護作用。幽門括約肌對胃內容物停留時間和拮抗十二指腸液反流起到關鍵作用，而以上功能受到幽門括約肌周期性收縮中的收縮壓和持續(xù)張力中的靜息壓的影響。在大鼠模型研究中發(fā)現，IL-1β蛋白可能通過cGMP、NO途徑調劑鼠幽門括約肌內鈣離子濃度，從而影響幽門括約肌的收縮振幅與頻率，從而調節(jié)幽門括約肌的生理功能[19]。我們推測IL-1β-511基因多態(tài)性可能也會影響幽門括約肌功能，通過調節(jié)反流液量及頻率而影響食管外表現癥狀的發(fā)生。

綜上所述，IL-1β-511位點基因多態(tài)性與新疆地區(qū)GERD患者食管外表現存在明顯相關性，G等位基因突變是發(fā)生食管外表現的保護因素。