李 明， 譚詩云， 柴 紅

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科 消化系統(tǒng)疾病湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430060

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，其死亡率高居腫瘤相關(guān)死亡的第三位。特別是在發(fā)展中國家，胃癌患者的數(shù)量占全球胃癌患者的70%以上[1]。我國每年約21 000例胃癌患者死亡，占世界胃癌死亡總?cè)藬?shù)的一半[2]。雖然近年來在腫瘤診治方面有了巨大進步，但胃癌患者預(yù)后仍然很差，5年生存率低于20%[3]。隨著生物學(xué)的迅速發(fā)展，闡明胃癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制是實現(xiàn)胃癌靶向治療的關(guān)鍵。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)為長度超過200個核苷酸的RNA分子。其本身不具備編碼蛋白的能力，但可在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達和調(diào)節(jié)真核細(xì)胞的各種生理過程[4]。大量研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在腫瘤中異常表達，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用[5-9]。lncRNA HEIH在大腸癌組織和細(xì)胞中均表達上調(diào)，且與腫瘤大小、浸潤深度、不良預(yù)后呈正相關(guān)[10]。如lncRNA LUCAT1與卵巢癌轉(zhuǎn)移及臨床分期呈正相關(guān)，且可通過調(diào)控miR-612/HOXA13通路促進卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。因此，進一步了解腫瘤相關(guān)lncRNA的機制，將有助于開發(fā)預(yù)后評估標(biāo)志物，并為腫瘤靶向治療提供新的思路。LOXL1-AS1是一種lncRNA，編碼在賴氨酰氧化酶樣1(LOXL1)基因的相反鏈上[12]。它在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中起著重要作用，并與剝脫綜合征的發(fā)展相關(guān)[13]。有研究報道，LOXL1-AS1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的間充質(zhì)亞型(MES)中高表達，并通過NF-κB途徑促進MES特征的表達[14]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，LOXL1-AS1通過激活PI3K/AKT途徑調(diào)節(jié)成神經(jīng)管細(xì)胞瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[15]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，LOXL1-AS1在胃癌中的表達水平顯著高于癌旁組織，且LOXL1-AS1在胃癌中的高表達與腫瘤直徑大小、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期和患者預(yù)后密切相關(guān)。LOXL1-AS1在胃癌中的作用尚不明確，本研究旨在從細(xì)胞水平探討LOXL1-AS1調(diào)控胃癌增殖、凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料胃癌細(xì)胞株(AGS、BGC823、NCI-N87、MGC803和SGC7901)和正常胃黏膜細(xì)胞株GES1購自上海君瑞生物技術(shù)有限公司；胎牛血清、RPMI 1640購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自上海同仁化學(xué)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)皿及6孔培養(yǎng)板購自Corning公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Sigma公司；RNAiso Plus試劑盒、cDNA合成試劑盒及PCR試劑盒購自Takara(大連)有限公司；lncRNA LOXL1-AS1 mRNA靶向shRNA(序列5′-GTGGACAAATCATAACTGAAT-3′)和scramble shRNA (即對照組)(序列5′-GCGTGAAAGTCAACTAATTAA-3′)及其載體由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計并構(gòu)建。PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax及β-actin抗體購自英國Abcam公司。蛋白濃度測定試劑盒、HRP-羊抗兔、HRP-羊抗鼠購自湖北百奧斯生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：胃癌細(xì)胞和胃黏膜細(xì)胞復(fù)蘇后用含質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2飽和濕度條件的恒溫箱中培養(yǎng)。實驗均選用處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進行。

1.2.2 細(xì)胞構(gòu)建：通過轉(zhuǎn)染LOXL1-AS1 mRNA靶向shRNA構(gòu)建LOXL1-AS1敲低的胃癌細(xì)胞模型。取對數(shù)生長期的胃癌BGC823細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞融合度為50%左右時轉(zhuǎn)染。根據(jù)制造商的說明書，使用Lipofectamine 2000將插入有scramble shRNA和LOXL1-AS1靶向shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到在6孔板中培養(yǎng)的胃癌BGC823細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h后，更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，收集細(xì)胞并加工用于后續(xù)實驗，實驗分組：轉(zhuǎn)染scramble shRNA組即sh-NC組，轉(zhuǎn)染LOXL1-AS1靶向shRNA組即sh-LOXL1-AS1組。

1.2.3 qRT-PCR實驗：使用RNAiso Plus試劑提取胃癌細(xì)胞株總RNA。根據(jù)試劑盒使用說明書，使用cDNA合成試劑盒合成第一鏈cDNA，采用ABI Prism 7500實時熒光定量PCR儀進行實時PCR檢測LOXL1-AS1表達水平，以GAPDH為內(nèi)參。每20 μl反應(yīng)體系內(nèi)加入400 ng cDNA、10 μl TB Green series、正反鏈引物各0.6 μl及6.88 μl RNase-free ddH2O。qRT-PCR實驗條件為95 ℃ 15 min預(yù)變性，95 ℃ 10 s、56 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s重復(fù)40個循環(huán)。引物及探針序列如下：LOXL1-AS1引物Forward：5′-GATATGTTGGATGATGGA-3′，Reverse：5′-GATATGTTGGATGGATGA-3′；GAPDH引物Forward：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，Reverse：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。使用比較循環(huán)閾值(Ct)計算基因的相對表達(2-△△Ct)，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞增殖實驗：將對數(shù)生長的兩組細(xì)胞消化收集重懸，以每孔5 000個/100 μl接種于96孔板中孵育，到達預(yù)先設(shè)定的實驗時間后加入10 μl CCK-8試劑，將細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，然后用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測量吸光度。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：消化收集2組細(xì)胞，根據(jù)凋亡試劑盒說明書，分別加入PI及Annexin V染色，再加入結(jié)合緩沖液后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 Western blotting實驗：收集上述2組細(xì)胞，加入200 μl預(yù)冷的含PMSF的蛋白裂解液，用移液器反復(fù)抽吸后震蕩1 min，4 ℃條件下裂解30 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，將上清液小心移至經(jīng)高壓消毒的EP管內(nèi)，根據(jù)蛋白測定試劑盒說明書檢測蛋白質(zhì)濃度，計算蛋白質(zhì)含量；采用免疫印跡法檢測蛋白質(zhì)表達情況，取40 μg各組樣品行SDS-PAGE電泳，再轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5% BSA封閉1 h，根據(jù)蛋白分子量切割條帶，分別加入一抗及內(nèi)參β-actin抗體，室溫下孵育2 h，再次TBST洗膜，ECL顯色及曝光，顯影、定影、拍照并分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用Graphpad Prism統(tǒng)計學(xué)處理軟件。計量資料兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LOXL1-AS1在胃癌細(xì)胞株中的表達我們前期研究發(fā)現(xiàn)[16]，LOXL1-AS1在胃癌中的表達水平顯著高于癌旁組織，且LOXL1-AS1在胃癌中的高表達與腫瘤直徑大小、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期和患者預(yù)后密切相關(guān)。因此，我們進一步檢測胃癌細(xì)胞株(AGS、BGC823、NCI-N87、MGC803和SGC7901)和正常胃黏膜細(xì)胞株GES-1中LOXL1-AS1表達情況，結(jié)果如圖1所示，與正常胃黏膜細(xì)胞株GES-1相比，上述胃癌細(xì)胞株中LOXL1-AS1表達水平均顯著升高(P<0.05)。

2.2 下調(diào)LOXL1-AS1表達對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響基于在5種胃癌細(xì)胞株中LOXL1-AS1的表達水平，我們選擇胃癌細(xì)胞系BGC823細(xì)胞轉(zhuǎn)染LOXL1-AS1靶向shRNA構(gòu)建LOXL1-AS1敲低模型，通過qRT-

PCR驗證轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染LOXL1-AS1靶向shRNA后，BGC823細(xì)胞中LOXL1-AS1被顯著抑制(見圖2A)；CCK-8實驗結(jié)果顯示，敲低LOXL1-AS1表達后的胃癌BGC823細(xì)胞增殖率顯著降低(見圖2B)；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染LOXL1-AS1靶向shRNA后細(xì)胞凋亡率顯著升高(見圖2C)。

注：與正常胃黏膜細(xì)胞株GES-1比較，#P<0.05。

注：A：敲低LOXL1-AS1表達后BGC823細(xì)胞LOXL1-AS1表達量顯著降低；B：敲低LOXL1-AS1表達后BGC823細(xì)胞增殖率顯著降低；C：敲低LOXL1-AS1表達后BGC823細(xì)胞凋亡率顯著升高。與sh-NC組相比，#P<0.05。

2.3 敲低LOXL1-AS1表達對胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Western blotting檢測LOXL1-AS1靶向shRNA轉(zhuǎn)染后對BGC823細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達的影響，結(jié)果顯示，敲低LOXL1-AS1表達后，BGC823細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào)，同時促凋亡蛋白Bax表達上調(diào)(見圖3)。

注：A：免疫印跡圖；B：灰度值分析。與sh-NC組相比，#P<0.05。

2.4 敲低LOXL1-AS1表達對胃癌細(xì)胞PI3K/Akt通路的影響PI3K/Akt通路與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)，我們進一步檢測了LOXL1-AS1靶向shRNA轉(zhuǎn)染后對BGC823細(xì)胞PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達的情況，免疫印跡結(jié)果顯示，敲低LOXL1-AS1后，BGC823細(xì)胞p-PI3K和p-Akt表達顯著降低，提示敲低LOXL1-AS1表達可抑制PI3K/Akt信號通路(見圖4)。

注：A：免疫印跡圖；B：灰度值分析。與sh-NC組相比，#P<0.05。

3 討論

lncRNA研究已經(jīng)成為腫瘤基因領(lǐng)域研究的熱點，大量研究證實，lncRNA的異常表達與腫瘤的發(fā)病機制、復(fù)發(fā)、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥及預(yù)后等密切相關(guān)[17-19]。LOXL1-AS1在多種腫瘤中高表達并影響腫瘤進展，例如，LOXL1-AS1可促進骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[20]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，LOXL1-AS1在胃癌中的表達水平顯著高于癌旁組織，且LOXL1-AS1在胃癌中的高表達與腫瘤直徑大小、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期和患者預(yù)后密切相關(guān)，提示LOXL1-AS1可促進胃癌發(fā)生、發(fā)展。我們進一步檢測了不同胃癌細(xì)胞株(AGS、BGC823、NCI-N87、MGC803和SGC7901)和正常胃黏膜細(xì)胞株GES-1中LOXL1-AS1表達情況，結(jié)果顯示，與正常胃黏膜細(xì)胞株GES-1相比，上述胃癌細(xì)胞株中LOXL1-AS1表達水平均顯著升高。

為了進一步探討LOXL1-AS1在胃癌增殖、凋亡中的作用，我們選取胃癌細(xì)胞株中LOXL1-AS1表達最高的胃癌BGC823細(xì)胞，轉(zhuǎn)染LOXL1-AS1靶向shRNA敲低LOXL1-AS1表達，qRT-PCR檢測驗證轉(zhuǎn)染后BGC823細(xì)胞LOXL1-AS1表達顯著下調(diào)。我們進一步觀察了下調(diào)LOXL1-AS1表達前后胃癌BGC823細(xì)胞增殖和凋亡的影響。CCK-8檢測結(jié)果顯示，敲低LOXL1-AS1表達后BGC823細(xì)胞增殖顯著降低；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，敲低LOXL1-AS1表達后BGC823細(xì)胞凋亡率顯著升高。上述結(jié)果表明，LOXL1-AS1在胃癌發(fā)生、發(fā)展中起促進作用，而敲低LOXL1-AS1表達可能在胃癌中具有一定的治療意義。

我們進一步探討了敲低LOXL1-AS1表達抑制胃癌增殖并促進細(xì)胞凋亡的機制。PI3K/Akt信號通路廣泛參與機體的病理和生理過程的調(diào)控，并在腫瘤中異常激活，與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)[21-22]。本實驗發(fā)現(xiàn)，敲低LOXL1-AS1表達后胃癌BGC823細(xì)胞p-PI3K和p-Akt表達顯著降低，同時抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào)，促凋亡蛋白Bax表達上調(diào)，提示敲低LOXL1-AS1表達可抑制PI3K/Akt信號通路，繼而上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達，并下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達，最終抑制細(xì)胞增殖并促進細(xì)胞凋亡。

綜上所述，lncRNA LOXL1-AS1在胃癌發(fā)生、發(fā)展中起促進作用，敲低LOXL1-AS1表達可抑制胃癌細(xì)胞增殖并促進細(xì)胞凋亡，其機制可能是通過抑制PI3K/Akt信號通路，繼而調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達。