王文生，朱建儒，慕之勇，劉碧穎，王 斌，陳東風(fēng)，文良志

陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院消化科，重慶 400042

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中最常見(jiàn)(約95%)組織病理類型為胃腺癌(gastric adenocarcinoma，GAC)[1]。僅在2014年，我國(guó)就有超過(guò)40萬(wàn)新發(fā)胃癌患者，其中死亡近30萬(wàn)[2]。特別是在我國(guó)65歲以上老年人群中，胃癌發(fā)病率躍升至第二位，僅次于肺癌，嚴(yán)重威脅著人民生命健康，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成極大的負(fù)擔(dān)[3]。盡管早期胃癌的5年生存率超過(guò)90%，但大多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于進(jìn)展期，其5年生存率不足30%[4]。目前化療仍是晚期胃癌的主要治療方法，近年興起的免疫療法呈現(xiàn)出較好的治療前景[5]。盡管腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)多種機(jī)制逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的殺傷效應(yīng)[6]，但目前一些研究發(fā)現(xiàn),針對(duì)PD-1/PD-L1軸及腺苷信號(hào)傳導(dǎo)通路開(kāi)發(fā)的免疫靶向藥物可打破腫瘤免疫逃逸，為GAC治療帶來(lái)了新希望[7-8]。

腫瘤微環(huán)境與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)，如腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)[9]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑和單克隆抗體等免疫療法可通過(guò)改變腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答[10]。因此，腫瘤免疫狀態(tài)可能對(duì)患者預(yù)后產(chǎn)生重要影響。然而目前腫瘤免疫在基因表達(dá)譜上異常改變及分子機(jī)制仍不明確。

本研究旨在評(píng)估GAC免疫相關(guān)基因組學(xué)異常表達(dá)在患者預(yù)后中的價(jià)值，探討可能的調(diào)控機(jī)制及對(duì)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的影響，為未來(lái)免疫治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床信息獲取于2019年9月7日從TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載GAC患者的全基因組轉(zhuǎn)錄(RNA-seq)數(shù)據(jù)，同時(shí)獲取患者相應(yīng)的臨床信息[11]。該數(shù)據(jù)集包含了343個(gè)癌組織和30個(gè)癌旁組織的測(cè)序信息。同時(shí)，從ImmPort數(shù)據(jù)庫(kù)[12]中輸出了2 498個(gè)免疫相關(guān)基因。為探討免疫基因發(fā)揮的潛在調(diào)控作用，我們從Cistrome Cancer數(shù)據(jù)庫(kù)[13]提取了目前報(bào)道的在腫瘤生物學(xué)轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用的318個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors，TFs)，Cytoscape(版本3.7.2)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[14]。從TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取GAC患者腫瘤中免疫細(xì)胞(B細(xì)胞、CD4/CD8 T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞)的浸潤(rùn)情況[15]。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法通過(guò)R(version 3.5.2，https://www.r-project.org)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用R中“l(fā)imma”包篩選癌與癌旁組織的差異表達(dá)基因(Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，F(xiàn)DR<0.05，log2|fold change|>1)。然后將差異表達(dá)的基因與2 498個(gè)免疫相關(guān)基因取交集即為差異表達(dá)的免疫基因。進(jìn)一步采用R中“survival”包進(jìn)行Cox回歸分析與患者總生存期(overall survival，OS)相關(guān)的免疫基因。通過(guò)多因素Cox回歸(基于赤池信息準(zhǔn)則的逐步篩選法)構(gòu)建預(yù)測(cè)預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(risk score)模型，并繪制ROC曲線評(píng)價(jià)模型預(yù)測(cè)能力[16]。對(duì)預(yù)后模型貢獻(xiàn)最大的四個(gè)基因進(jìn)一步在Kaplan-Meier網(wǎng)站(https://kmplot.com/analysis/)驗(yàn)證[17]。t檢驗(yàn)分析患者模型風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分在不同臨床特征之間差異，Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)分析患者模型風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與腫瘤中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)的免疫相關(guān)基因通過(guò)“l(fā)imma”包篩選出了6 685個(gè)基因在GAC癌與癌旁組織之間存在差異表達(dá)(見(jiàn)圖1A)，其中在癌組織中表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的基因數(shù)分別為5 479、1 206(見(jiàn)圖1B)。既往報(bào)道的與免疫相關(guān)的2 498個(gè)基因中[12]，有366個(gè)存在著差異表達(dá)(見(jiàn)圖1C)，與癌旁組織相比，170個(gè)免疫基因在癌組織中表達(dá)下調(diào)，而表達(dá)上調(diào)有196個(gè)(見(jiàn)圖1D)。

2.2 預(yù)后相關(guān)的免疫基因?yàn)榱撕Y選出真正影響患者預(yù)后的免疫基因，生存分析時(shí)，我們將OS<3個(gè)月患者予以剔除。首先，通過(guò)“survival”包進(jìn)行單因素Cox回歸篩選出了33個(gè)影響患者預(yù)后的免疫基因(見(jiàn)圖2A)。將多因素結(jié)果進(jìn)一步納入多因素Cox回歸構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，共納入了12個(gè)免疫基因(見(jiàn)圖2B)，其中9個(gè)免疫基因與預(yù)后獨(dú)立相關(guān)(即P<0.05)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證TCGA-GAC隊(duì)列中生存相關(guān)的免疫基因，我們對(duì)排名靠前的2個(gè)危險(xiǎn)因素(GLP2R、RETN；HR>1)和2個(gè)保護(hù)因素(TAP1、CTSG；HR<1)進(jìn)行了外部驗(yàn)證。如圖3所示，外部驗(yàn)證結(jié)果和本研究一致，即GLP2R、RETN基因?yàn)椴涣碱A(yù)后基因(見(jiàn)圖3A～3B)，其高表達(dá)提示患者OS較差；而TAP1、CTSG高表達(dá)提示患者OS較好(見(jiàn)圖3C～3D)。

2.3 轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將從Cistrome Cancer下載的318個(gè)TFs與圖1A中差異基因取交集，得到71個(gè)差異表達(dá)TFs(見(jiàn)圖4A)，其中17個(gè)表達(dá)下調(diào)，54個(gè)表達(dá)上調(diào)(見(jiàn)圖4B)。我們進(jìn)一步對(duì)預(yù)后相關(guān)的免疫基因和差異表達(dá)的TFs之間相關(guān)性進(jìn)行了Pearson相關(guān)分析，篩選出相關(guān)系數(shù)>0.4，P<0.01的信息，應(yīng)用Cytoscape繪制潛在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖5)。如圖5所示，基因和TFs之間大多為正向調(diào)控關(guān)系，僅NCAPG與GLP2R、GHR，以及GHR與CENPA、EZH2之間為負(fù)向調(diào)控關(guān)系。

2.4 免疫基因預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型本研究隊(duì)列中每個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是根據(jù)表達(dá)數(shù)據(jù)乘以多變量Cox回歸系數(shù)計(jì)算出來(lái)的?；谥形恢祵⒒颊邽楦呶＝M(High risk)和低危組(Low risk)(見(jiàn)圖6)，采用Log-rank檢驗(yàn)對(duì)兩組進(jìn)行Kaplan-Meier分析，高危組OS預(yù)后明顯更差(見(jiàn)圖7A，P<0.05)。該風(fēng)險(xiǎn)模型預(yù)測(cè)患者1年生存率的ROC曲線下面積為0.703(見(jiàn)圖7B)，預(yù)測(cè)效能一般。

為進(jìn)一步驗(yàn)證構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型是否能獨(dú)立預(yù)測(cè)GAC的預(yù)后，我們結(jié)合臨床參數(shù)進(jìn)行Cox回歸分析。在本隊(duì)列人群中，患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、年齡和TNM分期均是OS預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(見(jiàn)圖8，P<0.05)。

此外，我們還探討了模型包含基因的臨床意義。結(jié)果如表1所示，納入的預(yù)后免疫基因與患者性別、TNM分期無(wú)關(guān)(P>0.05)。其中TAP1、CTSG、RETN、GLP2R在不同腫瘤分化程度中表達(dá)明顯不同(P<0.05)。而患者模型風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分僅與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、分化程度、TNM分期無(wú)關(guān)(P>0.05)。

注：熱圖(A)和火山圖(B)代表在胃癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)基因，其中與免疫相關(guān)的基因如熱圖(C)和火山圖(D)，紅點(diǎn)代表GAC中高表達(dá)基因，綠點(diǎn)代表低表達(dá)基因。

圖2 單因素Cox分析顯示33個(gè)免疫基因與預(yù)后相關(guān)(A)，多因素Cox回歸納入12個(gè)免疫基因(B)Fig 2 Univariate Cox analysis revealed 33 immune genes associated with prognosis (A), and multivariate Cox regression was incorporated into 12 immune genes (B)

圖3 Kaplan-Meier網(wǎng)站驗(yàn)證GLP2R(A)、RETN(B)、TAP1(C)、CTSG(D)的不同表達(dá)水平與預(yù)后關(guān)系Fig 3 Relationship of different expression levels with prognosis of GLP2R(A),RETN(B), TAP1(C), CTSG(D) by Kaplan-Meier

2.5 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞浸潤(rùn)由于腫瘤微環(huán)境與患者預(yù)后及免疫狀態(tài)存在明顯關(guān)系[9-10]，最后，我們?cè)u(píng)估了患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系(見(jiàn)圖9)。從圖9中可以看出，患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)水平相關(guān)(P<0.05)，但相關(guān)性差(r<0.4)，而與B細(xì)胞、CD4、CD8 T細(xì)胞無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。

圖4 差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子(TFs)Fig 4 Differential expression of transcription factors (TFs)

注：圓圈代表免疫基因，三角表示TFs，紅線和綠線分別為正向和負(fù)向調(diào)控。

注：A：患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分；B：患者隨訪時(shí)間及生存狀態(tài)；C：患者的免疫預(yù)后基因表達(dá)情況。

圖7 不同預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的生存曲線(A)和預(yù)測(cè)ROC曲線(B)

注：age：年齡，gender：性別，grade：組織分化，stage：TNM分期。

表1 預(yù)后相關(guān)免疫基因及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與臨床特征關(guān)系
Tab 1 Relationship of prognosis-related immune genes and risk scores with clinical characteristics

基因年齡性別組織分化TNM分期TMN≤65歲 vs >65歲男vs女G1&2 vs G3Ⅰ&Ⅱ vs Ⅲ&ⅣT1&2 vs T1&2M0 vs M1N0 vs N1&2&3TAP1-0.806(0.421)0.272(0.786)-2.258(0.025)-0.312(0.756)-0.606(0.545)2.127(0.048)0.544(0.587)CXCL6-0.477(0.634)-1.462(0.145)-0.631(0.529)0.18(0.857)-0.49(0.625)-0.785(0.446)0.296(0.768)CTSG2.304(0.022)-1.698(0.091)-3.576(4.311e-04)1.52(0.130)1.021(0.310)-0.178(0.861)0.59(0.557)CCL211.356(0.177)1.215(0.227)-0.11(0.913)-0.392(0.695)-0.629(0.530)-0.912(0.378)-0.536(0.593)RNASE20.199(0.842)1.505(0.135)-2.163(0.032)-0.35(0.727)0.147(0.883)-1.659(0.120)-0.174(0.863)IGHD2-15-0.532(0.595)-0.522(0.602)-1.153(0.250)-1.709(0.089)-2.447(0.015)3.125(0.002)-0.557(0.578)EDN21.067(0.287)-0.676(0.500)-0.859(0.391)0.682(0.496)1.645(0.104)0.571(0.572)-0.105(0.917)PLAUR-1.517(0.130)1.113(0.267)-1.286(0.200)-0.76(0.448)-0.413(0.680)-1.147(0.271)-1.096(0.275)GCG0.546(0.586)0.621(0.536)-1.065(0.288)-1.136(0.258)-0.339(0.735)2.096(0.037)-1.567(0.119)

續(xù)表1

基因年齡性別組織分化TNM分期TMN≤65歲 vs >65歲男vs女G1&2 vs G3Ⅰ&Ⅱ vsⅢ&ⅣT1&2 vs T1&2M0 vs M1N0 vs N1&2&3RETN0.667(0.506)-0.535(0.594)-2.816(0.005)0.149(0.882)-0.03(0.976)-1.121(0.283)-0.465(0.642)RLN20.696(0.487)-0.151(0.880)1.65(0.101)1.414(0.159)0.603(0.548)0.355(0.726)1.625(0.108)GLP2R2.02(0.045)0.561(0.576)-3.46(6.314e-04)-0.824(0.411)-0.689(0.492)0.449(0.660)-0.605(0.546)riskScore0.949(0.344)1.207(0.230)-1.949(0.053)-1.792(0.075)-1.822(0.070)-1.141(0.274)-1.999(0.047)

圖9 患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系Fig 9 Relationship between prognostic risk score and infiltration of tumor microenvironment immune cells

3 討論

目前TNM分期是臨床應(yīng)用最廣泛治療決策和預(yù)后判斷的參考依據(jù)[18]。但即使相同TNM分期的患者經(jīng)過(guò)相似的治療，其預(yù)后仍有較大的異質(zhì)性，可能與復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有關(guān)[19]。免疫系統(tǒng)功能障礙是癌細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視的重要機(jī)制。因此，“免疫正常化”已成為免疫治療的基本指導(dǎo)原則[20]。免疫療法涉及基因、代謝、炎癥和腫瘤微環(huán)境的改變，且機(jī)制復(fù)雜[21]。同時(shí)，考慮到細(xì)胞的異型化甚至癌變往往發(fā)生在炎性細(xì)胞密集浸潤(rùn)的微環(huán)境中[22]，因此，研究腫瘤的基因組學(xué)和組織微環(huán)境變化是當(dāng)前面臨的新挑戰(zhàn)[23]。

本研究利用差異表達(dá)的免疫基因構(gòu)建了一個(gè)衡量腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和評(píng)估可能的臨床結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)模型。預(yù)后相關(guān)的33個(gè)免疫基因中，GLP2R、GREM1、CCL14、SLC22A17、GHR、FAM19A4在轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于節(jié)點(diǎn)位置，提示可能發(fā)揮的調(diào)控作用更為關(guān)鍵。GLP2R是風(fēng)險(xiǎn)模型中納入的9個(gè)與預(yù)后獨(dú)立相關(guān)的免疫基因之一。近期，有研究對(duì)大規(guī)模人群的全基因組關(guān)聯(lián)分析指出GLP2R是與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的位點(diǎn)之一[24]。結(jié)合本研究結(jié)果，GLP2R可能通過(guò)影響腫瘤分化程度進(jìn)而使GAC進(jìn)展。

另一個(gè)與GAC預(yù)后獨(dú)立相關(guān)的免疫基因RETN，既往被認(rèn)為是一種與炎癥有關(guān)的脂肪因子，參與巨噬細(xì)胞合成和分泌促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6。RETN還參與了對(duì)胃癌細(xì)胞端粒酶基因表達(dá)及加速腫瘤生長(zhǎng)的作用，同時(shí)還是腦膠質(zhì)瘤的重要預(yù)后因子[25]。我們推測(cè)RETN的表達(dá)上調(diào)，通過(guò)促進(jìn)炎癥、誘導(dǎo)端粒酶基因表達(dá)等復(fù)雜機(jī)制導(dǎo)致了GAC的進(jìn)展及不良預(yù)后。

Ling等[26]進(jìn)行的一項(xiàng)研究證實(shí)了TAP1下調(diào)可導(dǎo)致結(jié)直腸癌的免疫逃逸和不良預(yù)后。我們同樣發(fā)現(xiàn)了TAP1的下調(diào)預(yù)示著GAC患者較差的OS，當(dāng)然其中涉及到的免疫機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。作為絲氨酸蛋白酶家族中的一員，CTSG可通過(guò)增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增強(qiáng)炎細(xì)胞的趨化性和浸潤(rùn)，與皮肌炎疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)[27]。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)CTSG與補(bǔ)體C4含量呈負(fù)相關(guān)，而補(bǔ)體C4下降與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，因此，研究者認(rèn)為CTSG具有潛在的抗腫瘤效應(yīng)[27]。既往未見(jiàn)CTSG與腫瘤的相關(guān)報(bào)道，而本研究基于生物信息學(xué)首次發(fā)現(xiàn)了CTSG是GAC預(yù)后的一個(gè)保護(hù)因子，其抗腫瘤作用機(jī)制需要深入研究論證。

基于發(fā)現(xiàn)的預(yù)后相關(guān)的免疫基因，我們構(gòu)建了一個(gè)預(yù)測(cè)GAC預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)模型，盡管預(yù)測(cè)效能一般(AUC=0.703)，但其能在一定程度上反映腫瘤微環(huán)境中樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。當(dāng)然，至于這些基因影響GAC患者預(yù)后的具體機(jī)制有待更多的體內(nèi)及體外試驗(yàn)深入論證，以期提供新的免疫治療靶點(diǎn)。