楊 璐， 趙振杰， 霍麗花， 王光一， 金 蕊， 于乃彬，辛賽格， 高 翔,2， 趙萬春,2， 董 劍,2， 李曉燕,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100；2.陜西省小麥工程技術(shù)研究中心/陜西省小麥新品種培育工程研究中心， 陜西 楊凌 712100)

陜西省小麥栽培歷史悠久，是我國(guó)優(yōu)質(zhì)小麥生產(chǎn)區(qū)，1949 年以來，已經(jīng)經(jīng)歷了7 次品種更換。研究籽粒硬度基因在陜西省歷次品種更換過程中的演變，對(duì)了解Pina和Pinb等位變異類型，解析籽粒硬度形成的分子機(jī)制，推動(dòng)陜西省乃至全國(guó)的小麥品質(zhì)育種具有重要意義。本研究用NIR和SKCS方法測(cè)定陜西省歷代和當(dāng)代小麥品種(系)的籽粒硬度，分析其硬度類型與演變規(guī)律，并利用PCR方法對(duì)籽粒硬度基因Pina和Pinb的等位基因變異類型進(jìn)行檢測(cè)，揭示陜西省小麥品種更新?lián)Q代中籽粒硬度的遺傳與等位基因變異特點(diǎn)，以期為小麥品種選育和推廣中對(duì)籽粒硬度的改良提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1小麥品種(系)

陜西省歷代主要小麥品種(系)170份，包括當(dāng)代品種(系)119份，6次大規(guī)模換代代表性品種51份，主要由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥品質(zhì)遺傳改良實(shí)驗(yàn)室提供，材料詳情見表1、表2。

表1 主要代表材料基本信息

表2 歷代主要小麥品種(系)

品種(系)名稱矮豐3號(hào)西農(nóng)881武農(nóng)68西農(nóng)312長(zhǎng)安5號(hào)長(zhǎng)武C34-3陜7859西農(nóng)971陜448秦農(nóng)18小偃325西農(nóng)2208陜229螞蚱麥秦農(nóng)578武農(nóng)21西農(nóng)111陜農(nóng)138陜160碧螞1號(hào)西農(nóng)2178武農(nóng)882陜447西農(nóng)558陜354西農(nóng)269西農(nóng)245阿勃西農(nóng)20西麥2號(hào)早系陜253偃麥894西農(nóng)145西安837西農(nóng)6582011高陵陜715西農(nóng)528西農(nóng)402西農(nóng)822小偃269西農(nóng)846陜538西農(nóng)266小偃22小偃327西農(nóng)018農(nóng)大1108西農(nóng)2000農(nóng)科0901西安603西農(nóng)810西農(nóng)1013西農(nóng)508西農(nóng)9872西農(nóng)13西安1104西農(nóng)823小偃282西農(nóng)861咸168西農(nóng)975西農(nóng)102西農(nóng)9811西農(nóng)056大荔1號(hào)西安3122西農(nóng)5311西農(nóng)538-12西農(nóng)2002武農(nóng)6號(hào)臨渭227西農(nóng)928農(nóng)麥1號(hào)西農(nóng)521陜墾99陜雜二號(hào)西農(nóng)383小偃864西農(nóng)023西農(nóng)8727西農(nóng)501武豐三號(hào)武農(nóng)886武168小偃312西農(nóng)2611西農(nóng)213西農(nóng)805西抗199陜墾138西農(nóng)1018武農(nóng)132小偃216陜農(nóng)70西抗6001荔高6號(hào)陜農(nóng)56邢9160小偃504西農(nóng)185西農(nóng)837豐產(chǎn)3號(hào)西農(nóng)121西農(nóng)16小偃166陜943陜農(nóng)33秦農(nóng)161西農(nóng)294偃展4110西農(nóng)6028陜墾57武農(nóng)986陜9872西農(nóng)638西農(nóng)898西農(nóng)84G6陜墾224小偃270陜218-33武農(nóng)9號(hào)秦農(nóng)16西農(nóng)165西農(nóng)1121西安735西農(nóng)811秦農(nóng)26王老師96-106西農(nóng)7733西安366西農(nóng)2718西農(nóng)93102戶縣中麥1號(hào)西農(nóng)223西農(nóng)335西農(nóng)112西農(nóng)986陜農(nóng)981西農(nóng)529西農(nóng)1918西農(nóng)958西農(nóng)1326陜225西農(nóng)9718陜墾32陜農(nóng)51西農(nóng)1623西安979西農(nóng)246陜墾9740西農(nóng)122西農(nóng)1043西農(nóng)196西農(nóng)1829陜254陜麥536西安240秦農(nóng)29西農(nóng)1725西農(nóng)65西農(nóng)509西安2871西安141長(zhǎng)武C18-1陜農(nóng)342西安158西農(nóng)9871武農(nóng)148小揠6號(hào)

1.1.2引 物

Pina和Pinb等位基因檢測(cè)所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表3)。

表3Pina和Pinb等位基因檢測(cè)引物信息

標(biāo)記(基因)序列(5'-3')片段大小( bp)退火/℃變異類型Pina-D1b[1]AATACCACATGGTTCTAGATACTGGCAATACAAAG-GACCTCTAGATT77655Pinb-D1bPina-D1b[2]ATGAAGACCTTATTCCTCCTACTCATGCTCACAGCCGCT77655Pinb-D1bPina[3]CATCTATTCATCTCCACCTGCGTGACAGTTTATTAGCTAGTC52450Pinb[3]GAGCCTCAACCCATCTATTCA,CAAGGGTGATTTTATTCATAG59750

1.2 方 法

1.2.1硬度測(cè)定

籽粒硬度利用Perten 4100型單籽粒谷物特性測(cè)試儀與Perten DA 7250型連續(xù)光譜近紅外分析儀測(cè)定。

1.2.2基因組DNA的提取

小麥種子在培養(yǎng)皿中進(jìn)行發(fā)芽，至3葉期，用CTAB法[4]提取DNA。

1.2.3硬度基因型鑒定

PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體積25μL，含有10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)5μL，ddNTP Mixture混合物(各2.4 mmol·L-1)3.9μL，模板DNA(gDNA)2.5 ng，上游引物1(20μmol·L-1)1μL，下游引物2(20μmol·L-1)1μL，ExTaq(5 U·μL-1)0.25μL，加滅菌去離子水至25μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，然后每個(gè)循環(huán)：95 ℃變性30 s，53 ℃復(fù)性30 s(不同引物復(fù)性溫度見表3)， 72 ℃延伸1 min，共循環(huán)35次，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增完成后1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽粒硬度演變規(guī)律

170份陜西小麥品種(系)的籽粒平均硬度指數(shù)為80.27，其中51份歷代小麥品種籽粒平均硬度指數(shù)為67.71，硬度指數(shù)最高的品種是西農(nóng)2208，硬度指數(shù)最低的品種是矮豐3號(hào)；當(dāng)代品種(系)平均硬度指數(shù)為85.65，籽粒硬度指數(shù)最高的品種是西農(nóng)9718(為128)，硬度指數(shù)最低的品種是西農(nóng)246(為61)。陜西省歷代小麥品種硬度指數(shù)平均數(shù)呈先降后升趨勢(shì)，總體呈逐漸上升趨勢(shì)(表4)。

表4 陜西省小麥品種(系)籽粒硬度

類型硬度指數(shù) 品種數(shù)比例/% 歷史品種當(dāng)代品種總品種歷史品種當(dāng)代品種總品種硬質(zhì)>7020466639.2238.6638.82混合40～70317310460.7861.3461.18軟質(zhì)<40000000

170份陜西小麥品種(系)中硬質(zhì)麥66份，混合麥104份，軟質(zhì)麥0份，分別占比38.82%、61.18%，0。51份歷代小麥品種中硬質(zhì)麥20份，混合麥31份，軟質(zhì)麥0份，分別占比39.22%、60.78%、0。當(dāng)代小麥品種(系)119份，硬質(zhì)麥46份，混合麥73份，軟質(zhì)麥0份，占比分別為38.66%，61.34%，0(表4)。

2.2 籽粒硬質(zhì)基因變異

2.2.1Pina和Pinb基因檢測(cè)

Pina-D1b檢測(cè)：Ha位點(diǎn)是否存在缺失，產(chǎn)物擴(kuò)增長(zhǎng)度為776 bp即Pina-D1b類型，在非Pina-D1b等位類型中無該特異條帶擴(kuò)增。西農(nóng)2611、西農(nóng)2208、西農(nóng)84G6、西農(nóng)65、陜229等5份品種(系)擴(kuò)增出該特異條帶，陜229等21份當(dāng)代品種中擴(kuò)增出該特異條帶(圖1、圖2)。

注：1為DL 2000；2為小偃6號(hào)；3為西農(nóng)2611；4為西農(nóng)85；5為陜225；6為西農(nóng)2208；7為DL 2000；8為陜160；9為陜354；10為陜229；11為西農(nóng)196。

注：1為DL 2000；2為陜農(nóng)70；3為西農(nóng)2718；4為小偃22；5為武農(nóng)9號(hào)。

Pinb-D1b變異類型檢測(cè)：Pinb基因46位點(diǎn)甘氨酸向絲氨酸的變化，產(chǎn)物擴(kuò)增長(zhǎng)度為250 bp，在非Pinb-D1b類型則無該特異條帶擴(kuò)增。歷代品種螞蚱麥、碧螞4號(hào)、豐產(chǎn)3號(hào)等24份材料攜帶Pinb-D1b基因型，西農(nóng)822等45份當(dāng)代品種攜帶Pinb-D1b等位基因。

Pina、Pinb全長(zhǎng)基因檢測(cè)：可擴(kuò)出Pina全長(zhǎng)為524 bp的產(chǎn)物，51份歷代品種均擴(kuò)增出524 bp條帶，秦農(nóng)18等45份當(dāng)代品種擴(kuò)增出來該特異條帶。Pinb全長(zhǎng)597 bp，51份歷代品種中均擴(kuò)增出597 bp條帶，秦農(nóng)18等45份當(dāng)代品種擴(kuò)增出該特異條帶。

2.2.2Pina和Pinb等位基因變異

在170份陜西小麥品種(系)材料中，Pina-D1b變異類型26份，占比15.29%，Pinb-D1b變異類型71份，占比41.76%。在51份陜西省歷代小麥品種(系)中，硬質(zhì)麥39.22%，混合麥60.78%；硬質(zhì)麥和混合麥中Pina-D1b類型共計(jì)5份，所占比例為9.80%；Pinb-D1b變異類型共計(jì)24份所占比例47.06%；當(dāng)代材料品種(系)119份，硬質(zhì)麥38.66%，混合麥61.34%。硬質(zhì)麥和混合麥中Pina-D1b類型21份，所占比例為17.65%；Pinb-D1b變異類型47份，所占比例為39.50%；17份攜帶Pina基因，占14.29%；75份攜帶Pinb基因，占63.03%(表4)。當(dāng)代品種Pina和Pinb基因序列長(zhǎng)度具有多態(tài)性(表5)。

表5 陜西省小麥品種(系)Pina和Pinb等位基因型

年代材料/份等位基因變異Pina-D1b類型/%Pinb-D1b類型/%Pina/%Pinb/%歷代519.8047.06100.0100.00當(dāng)代11917.6539.5014.263.03總計(jì)17015.2941.7640.074.12

3 討 論

3.1 陜西歷代小麥籽粒硬度演變

本研究中，陜西省歷代小麥品種(系)材料共計(jì)51份，硬質(zhì)麥占39.22%，混合麥占60.78%。119份當(dāng)代小麥品種(系)中，硬質(zhì)麥占38.66%，混合麥占61.34%。王晶等[5]研究了262份中國(guó)小麥微核心種質(zhì)(MCC)和1 228份中國(guó)小麥主栽品種及重要親本，發(fā)現(xiàn)北方地區(qū)硬質(zhì)小麥品種較多。張晶等研究表明，陜西省當(dāng)代小麥品種(系)硬質(zhì)麥、混合麥、軟質(zhì)麥比例分別為71.6%、6.5%和21.9%[6]，而本研究未發(fā)現(xiàn)軟質(zhì)麥，可能與收集的品種大多來源于關(guān)中地區(qū)有關(guān)。本研究的51份歷代品種(系)材料平均硬度雖然經(jīng)歷了一個(gè)由降到升的過程，但總體硬度水平都偏高。

3.2 Pina和Pinb等位基因變異

20世紀(jì)90年代開始，小麥品質(zhì)和產(chǎn)量同時(shí)受到育種專家的關(guān)注，育成的品種中Pinb-D1b比例變高，如陜225、西農(nóng)2611和小偃22等都屬于Pinb-D1b類型。研究表明，90年代初期山東選育的優(yōu)質(zhì)品種中硬質(zhì)麥占多數(shù)，且同時(shí)期在全國(guó)范圍內(nèi)大面積推廣的有揚(yáng)麥158等Pinb-D1b硬質(zhì)小麥[7-9]。本研究利用分子標(biāo)記分析了籽粒硬度基因Pina和Pinb的等位變異類型及組成，發(fā)現(xiàn)陜西省歷代品種材料中硬質(zhì)麥和混合麥中硬度基因Pina-D1類型為9.80%；Pinb-D1b類型為47.06%；當(dāng)代小麥品種(系)中硬度基因Pina-D1b類型為17.65%；Pinb-D1b類型為39.50%；Pina基因所占比例為14.29%；Pinb基因所占比例為63.03%，研究結(jié)果可為陜西小麥品種選育和品種推廣提供數(shù)據(jù)支持。