許蕊，張昕怡，潘悅，張瑜，李迅，王飛

（南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點實驗室，南京 210037）

脂肪酶（EC 3.1.1.3），又稱三?；视王ニ饷?，其廣泛存在于動植物和微生物中，可以用于催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)［1-2］。由于其具有高反應(yīng)活性、較強的底物特異性等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、日化、洗滌劑等行業(yè)［3-4］。嗜熱耐堿的脂肪酶能夠在高溫和堿性條件下進(jìn)行催化反應(yīng)，擴(kuò)大了脂肪酶的應(yīng)用范圍。目前，來源于厭氧嗜熱耐堿菌脂肪酶的報道不多，因此對嗜熱耐堿脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)研究也相對匱乏。解酯嗜熱菌（Thermosyntropha lipolytica）來源于肯尼亞堿性溫泉，是一種厭氧、嗜熱、耐堿的細(xì)菌［5］。從該細(xì)菌中分離得到的脂肪酶在極端高溫和堿性條件下，仍能夠保持較高的穩(wěn)定性和催化活性［6］，具有極大的應(yīng)用前景。

油酸乙酯是高級脂肪酸醇酯，主要用作潤滑劑、表面活性劑、軟膏基質(zhì)、抗水劑、食品添加劑、柴油添加劑等，已被廣泛應(yīng)用于紡織、醫(yī)藥、日化、食品等行業(yè)中［7-8］。目前工業(yè)化生產(chǎn)油酸乙酯主要是以十二烷基苯磺酸或濃硫酸為催化劑，在高溫高壓下催化油酸和乙醇酯化［9］。該法需在高溫、高壓、強酸等條件下進(jìn)行，對設(shè)備腐蝕嚴(yán)重，且副反應(yīng)多，后處理步驟繁瑣，生產(chǎn)成本較高［10］。然而，采用酶法制備油酸乙酯能夠彌補化學(xué)法的不足，尤其是嗜熱耐堿脂肪酶，其具有較好的熱穩(wěn)定性及較寬的pH 適用范圍，能夠在高溫下制備油酸乙酯，且酶轉(zhuǎn)化的專一性強，極大地提高了催化效率。筆者以全基因合成的方法獲得來源于解酯嗜熱菌的脂肪酶（TlLip2）基因，將其克隆至大腸桿菌表達(dá)載體pET28a 中，并成功在大腸桿菌BL21（DE3）中高效表達(dá)，測定了重組脂肪酶TlLip2 的酶學(xué)性質(zhì)，并將其應(yīng)用于油酸乙酯的合成研究中。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌Top 10F’和BL21（DE3）菌株由江蘇省物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點實驗室保存。大腸桿菌表達(dá)載體pET28a 購自德國Novagen 公司。全基因合成和基因測序由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

1.1.2 試劑

胰蛋白胨（Tryptone） 和酵母提取物（yeast extract）購自英國Oxoid 公司；常用生化試劑三羥甲基氨基甲烷（Tris）、卡那霉素（Kan）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）等購自德國Biofroxx 公司；對硝基苯乙酸酯（p-nitrophenyl acetate，C2）、對硝基苯己酸酯（p-nitrophenyl caproate，C6）、對硝基苯辛酸酯（p-nitrophenyl octanoate，C8）、對硝基苯月桂酸酯（p-nitrophenyl dodecanoate，C12）、對硝基苯肉豆蒄酸酯（p-nitrophenyl myristate，C14）和對硝基苯棕櫚酸酯（p-nitrophenyl palmitate，C16）等購自美國Sigma 公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自英國Axygen 公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）購自美國Aladdin 公司；其他生化試劑及藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基、固體LB 培養(yǎng)基、SOC（super optimal broth with catabolite repression）培養(yǎng)基等配方同參考文獻(xiàn)［11］。

1.2 試驗方法

1.2.1TlLip2 的克隆

根據(jù)密碼子使用頻率數(shù)據(jù)庫信息（codon usage database），對來源于解酯嗜熱菌脂肪酶的氨基酸序列（Genbank： SHG41589.1）按大腸桿菌優(yōu)勢密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，通過全基因合成獲得其基因片段。采用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和EcoRⅠ分別對TlLip2 的基因片段tll2 和載體pET28a 進(jìn)行雙酶切后連接，42 ℃下熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top 10F’。經(jīng)核酸電泳驗證后，獲得正確的重組質(zhì)粒pET28a-TLL2。

1.2.2TlLip2 的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-TLL2 熱擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），挑取單菌落接入含卡那霉素（30 mg／L）的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到使OD600為0.6～0.8，加入終濃度為0.5 mmol／L 的IPTG，25 ℃誘導(dǎo)表達(dá)24 h。離心收集菌體，用5 mmol／L 咪唑緩沖液（pH 為7.9）重懸。

1.2.3TlLip2 的分離純化

超聲破碎重懸的大腸桿菌細(xì)胞，離心收集上清液即為粗酶液。粗酶液在50 ℃水浴鍋內(nèi)熱處理15 min，去除非耐熱雜蛋白，離心收集上清液即為熱處理后的酶液。將熱處理后的酶液通過Ni2+親和柱純化，用不同梯度的咪唑洗脫緩沖液（pH 為7.9）進(jìn)行洗脫，純蛋白主要存在于250 mmol／L 咪唑緩沖液中。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的分離膠SDSPAGE 分析重組蛋白的表達(dá)及純化效果。

1.2.4TlLip2 的酶活力測定方法

參考文獻(xiàn)［12］的方法，以10 μL 20 mmol／L 對硝基苯棕櫚酸酯（p-NP-C16）為底物，加入180 μL 50 mmol／L Tris-HCl 緩沖液（pH 為8.0），在60 ℃下保溫5 min 后，加入10 μL 熱處理后的酶液，準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，加入600 μL 終濃度為1 mol／L 的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，將反應(yīng)液在室溫下離心后，取上清，在400 nm 處測定吸光值，以釋放的對硝基苯酚的量計算酶活。一個酶活單位（U）定義為：在pH 8.0，60 ℃條件下，1 min 內(nèi)釋放1 μmol 對硝基苯酚所需的酶量。蛋白濃度采用Bradford 法測定［13］。

1.2.5TlLip2 的酶學(xué)性質(zhì)測定

在pH 8.0 下，測定25～95 ℃下的酶活，最高反應(yīng)酶活力所處溫度即為酶的最適反應(yīng)溫度。在最適溫度下，分別測定pH 3.0～9.0 下的酶活，最高反應(yīng)酶活力所處的pH 為酶的最適反應(yīng)pH。在最適pH下，將酶置于55，60，62，70 ℃下分別保溫0，30，60，90，120 min，測定TlLip2 的溫度穩(wěn)定性，以未保溫的酶活力為100%計算相對酶活力。將TlLip2 置于pH 4.0～11.0 的緩沖液中，于25 ℃保存60 min，測定TlLip2 的pH 穩(wěn)定性，以未經(jīng)緩沖液保溫處理的TlLip2 的酶活力為100%計算相對酶活力。

測定金屬離子及化學(xué)試劑對酶活力的影響時，在酶活測定體系中分別加入終濃度為1 mmol／L 的K+、Na+、Fe3+等金屬離子和SDS、EDTA、PMSF 等化學(xué)試劑，以不加金屬離子和化學(xué)試劑的TlLip2 的酶活力為100%計算相對酶活力。

測定底物特異性時，在酶活測定體系中分別加入終濃度為1 mmol／L 對硝基苯乙酸酯（p-NPC2）、對硝基苯己酸酯（p-NP-C6）、對硝基苯辛酸酯（p-NP-C8）、對硝基苯月桂酸酯（p-NP-C12）、對硝基苯肉豆蒄酸酯（p-NP-C14）和對硝基苯棕櫚酸酯（p-NP-C16）作為底物，以測定的最高酶活力為100%計算相對酶活。

測定有機(jī)試劑耐受性時，將100 μL 稀釋一定倍數(shù)的TlLip2 置于100 μL 正己烷、正庚烷、正辛烷、異辛烷、丙酮、異丙醇、叔丁醇、叔戊醇、二甲亞砜、四氫呋喃中，于25 ℃保存6 h，以未經(jīng)過有機(jī)溶劑保溫處理的TlLip2 的酶活力為100%計算相對酶活力。

測定動力學(xué)參數(shù)時，在酶活測定體系中加入終濃度為0.25～1.5 mmol／Lp-NP-C16，采用Sigma-Plot 軟件的動力學(xué)模塊擬合米式方程曲線并計算動力學(xué)參數(shù)Km，Vmax和kcat。以上實驗均在最適溫度和最適pH 下測定酶活力。

1.2.6 油酸乙酯的制備及檢測方法

于具塞茄形瓶中加入一定摩爾比的油酸和乙醇、100 mg 活化的4 ? 分子篩、50 μLTlLip2 酶液（100 U／g 油酸），通入N2作保護(hù)氣，在60 ℃沙浴中，180 r／min 磁力攪拌反應(yīng)12 h 后，以乙醇停止反應(yīng)，用氣相色譜檢測產(chǎn)物并計算產(chǎn)率。

氣相色譜檢測條件［14］：采用蘭州化學(xué)物理研究所PEG20-M 柱，30 m×250 μm×0.25 μm （長×內(nèi)徑×膜厚度），氫火焰離子化檢測器，N2作載氣，H2作燃?xì)?，以空氣助燃。柱箱溫度?80 ℃，保持2 min，3 ℃／min 程序升溫，升至240 ℃，保持10 min，檢測溫度為260 ℃，載氣流速為25 mL／min，進(jìn)樣量為1 μL，分流比［（分流流速+柱體積流速）／柱體積流速］為10 ∶1，以十七烷酸甲酯作內(nèi)標(biāo)物檢測油酸乙酯產(chǎn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 TlLip2 的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-TLL2 熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），篩選獲得表達(dá)TlLip2 的重組菌TLL2。重組菌TLL2 經(jīng)過24 h 的誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌體，菌體重懸后經(jīng)超聲波破碎、熱處理以及鎳柱親和層析后得到純酶TlLip2，SDS-PAGE 分析如圖1 所示。

圖1 TlLip2 的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE analyses of TlLip2

SDS-PAGE 分析結(jié)果表明，誘導(dǎo)的重組菌中具有明顯的目的蛋白條帶，重組蛋白主要在上清液中，說明目的蛋白以可溶性表達(dá)為主。經(jīng)60 ℃熱處理后，一部分非耐熱雜蛋白被去除。對TlLip2熱處理酶液進(jìn)行鎳柱親和層析，目的蛋白存在于250 mmol／L 咪唑洗脫液中，亞基分子質(zhì)量大小約為57 kDa，與目的蛋白的分子質(zhì)量大小符合。通過熱處理和Ni2+親和柱層析，重組蛋白純化倍數(shù)為12.3，測得純化后的TlLip2 的比酶活為31 U／mg。

2.2 TlLip2 的酶學(xué)性質(zhì)的測定

2.2.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

在25～95 ℃下測定TlLip2 的最適溫度，結(jié)果如圖2a 所示，TlLip2 的最適溫度為60 ℃，隨著溫度的升高，酶活呈明顯下降趨勢。在45～70 ℃范圍內(nèi)，TlLip2 的相對酶活均維持在50%以上。溫度穩(wěn)定性結(jié)果如圖2b 所示，在60 ℃保溫2 h 后，相對酶活保持在50%左右，說明TlLip2 在60 ℃以下的溫度穩(wěn)定性較好。Salameh 等［6］從T.lipolytica中分離得到的嗜熱耐堿脂肪酶LipB，其最適溫度為96 ℃，在100 ℃下保溫2 h 后，相對酶活力保持在50%，其最適溫度和溫度穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于本研究中的TlLip2，性質(zhì)差別較大，因此可以說明這兩種酶屬于不同性質(zhì)的同工酶。Gumerov 等［15］報道了來源于T.lipolytica的脂肪酶編碼基因，并通過大腸桿菌重組表達(dá)脂肪酶TSLip1，該酶的最適溫度為70 ℃，在80 ℃下保溫0～120 min 時，相對酶活先急劇下降隨后下降趨勢變緩，TSLip1 的最適溫度和溫度穩(wěn)定性與TlLip2 相近。

圖2 TlLip2 的最適溫度及溫度穩(wěn)定性Fig.2 The optimum temperature and temperature stability of TlLip2

2.2.2 最適pH 和pH 穩(wěn)定性

分別測定pH 3.0～9.0 下的酶活，最適反應(yīng)pH結(jié)果如圖3a 所示，結(jié)果表明TlLip2 的最適pH 為8.0，且在pH 7.0～11.0 范圍內(nèi)都具有較高活力。pH 穩(wěn)定性結(jié)果如圖3b 所示，在pH 4.0～5.0 條件下，酶活喪失較為明顯，在pH 6.0～11.0 范圍內(nèi)，TlLip2 的相對酶活均高于60%，說明該酶在堿性條件下具有較好的穩(wěn)定性。重組脂肪酶TSLip1 的最適pH 和TlLip2 相同，但TSLip1 在pH 4.0～7.0 范圍內(nèi)，相對酶活僅有20%左右［15］，說明TlLip2 的pH 適用范圍比TSLip1 更寬。

2.2.3 金屬離子及化學(xué)試劑對酶活力的影響

在酶活測定體系中分別加入終濃度為1 mmol／L 的金屬離子及化學(xué)試劑，在最適條件下測定酶活，結(jié)果如表1 所示。K+、Na+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、Ni2+對TlLip2 的酶活力有促進(jìn)作用，但促進(jìn)作用并不十分明顯。EDTA 對該重組酶有明顯的抑制作用，說明該重組酶TlLip2 可能是金屬酶。其他金屬離子及化學(xué)試劑對TlLip2 的酶活力均有不同程度的抑制作用，其中Co2+、Zn2+、SDS 和Tween 80 對酶活力抑制作用明顯。此外，測定多種類型的表面活性劑對酶活力的影響，但表面活性劑均對酶活力有抑制作用。而從T.lipolytica中分離得到的LipB 是金屬酶，在Mn2+的激活作用下酶活力能夠提高3 倍［6］。該結(jié)果進(jìn)一步說明LipB 和TlLip2 的酶學(xué)性質(zhì)完全不一樣，是不同的脂肪酶。

圖3 TlLip2 的最適pH 及pH 穩(wěn)定性Fig.3 Optimum pH and pH stability of TlLip2

表1 金屬離子和化學(xué)試劑對酶活的影響Table 1 Effects of cations and chemical reagents on lipase activity

2.2.4 底物特異性

在最適酶活測定條件下，分別加入終濃度為1 mmol／L 不同脂肪酸鏈長度的對硝基苯酯作為底物，測定結(jié)果如圖4 所示。TlLip2 對于對硝基苯己酸酯（C6）顯示出最大的活力，對于對硝基苯辛酸酯（C8）也顯示出較高活性，對于對硝基苯乙酸酯（C2）、對硝基苯月桂酸酯（C12）、對硝基苯肉豆蒄酸酯（C14） 和對硝基苯棕櫚酸酯（C16）顯示的活力較低。結(jié)果表明相比于其他底物，TlLip2 對中等長度的脂肪酸鏈的底物顯示出更高的活性。直接從T.lipolytica中分離得到的LipB 對長鏈不飽和脂肪酸酯（C18）有較高的活性［6］，重組脂肪酶TSLip1對短鏈脂肪酸酯（C4、C5）有較高的活性［15］。

圖4 TlLip2 的底物特異性Fig.4 Activitiy of TlLip2 toward substrates with different acyl chain lengths

2.2.5 有機(jī)溶劑耐受性

TlLip2 的有機(jī)溶劑耐受性結(jié)果如圖5 所示。在正己烷、正庚烷、正辛烷、異辛烷中，TlLip2 的殘余酶活力均大于100%。在異丙醇、叔丁醇、二甲亞砜中，TlLip2 的殘余酶活力保持在80%左右，在叔戊醇中的殘余酶活力為60%，在丙酮中的殘余酶活力為40%，在四氫呋喃中殘余酶活力僅為9%，幾乎失活。由此可以說明，TlLip2 的失活程度可能與有機(jī)溶劑的極性有關(guān)，在異丙醇等中等極性的有機(jī)溶劑中，TlLip2 的殘余酶活力保持在60%以上，而在丙酮等極性較大的有機(jī)溶劑中，酶活受到較大程度的抑制。結(jié)果表明，TlLip2 在極性較小的有機(jī)溶劑中，耐受性較好，說明其在有機(jī)相反應(yīng)體系中具有較好的應(yīng)用前景。

圖5 TlLip2 的溶劑耐受性Fig.5 Stability of TlLip2 in organic solvent

2.2.6 動力學(xué)參數(shù)

在酶活測定體系中分別加入終濃度為0.25，0.50，0.75，1.00，1.25 和1.50 mmol／L 的p-NP-C16，在最適條件下測定酶活力，采用Sigma-Plot 軟件中的動力學(xué)模塊擬合米式方程曲線并計算動力學(xué)參數(shù)。TlLip2 的Km為0.29 mmol／L，Vmax為2.28 mmol／（L·min-1），kcat為6.19 s-1。Guo 等［16］通過畢赤酵母表達(dá)了2 種嗜熱重組脂肪酶Aaeol 1 和Aaeol 2，以p-NP-C4 為底物，測定其動力學(xué)參數(shù)，Km分別為5.11 和0.79 mmol／L，kcat分別為16.12 和3.59 s-1。Cai 等［17］克隆表達(dá)了來源于解淀粉芽孢桿菌的嗜熱耐堿脂肪酶LipBA 基因，以p-NP-C16為底物，脂肪酶LipBA 的動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax分別為1.04 mmol／L 和119.05 mmol／（L·min-1）。與其他幾種嗜熱耐堿脂肪酶相比，TlLip2 具有較好的底物親和性。

2.3 TlLip2 催化制備油酸乙酯

2.3.1 無溶劑體系中制備油酸乙酯

分別以摩爾比1 ∶1，1 ∶2，1 ∶5加入油酸和乙醇，當(dāng)酸醇摩爾比為1 ∶2時，油酸乙酯的得率為15.3%，是酸醇摩爾比為1 ∶1時的2 倍，是1 ∶5時的4 倍。這可能是由于酸醇摩爾比為1 ∶1的反應(yīng)體系中，反應(yīng)產(chǎn)生的水促進(jìn)了逆反應(yīng)，而酸醇摩爾比為1 ∶2時，稍過量的乙醇促進(jìn)了反應(yīng)向酯化的方向進(jìn)行。當(dāng)酸醇摩爾比達(dá)到1 ∶5時，過量的乙醇使TlLip2 失活，導(dǎo)致反應(yīng)的酯化率過低。邵平等［18］在無溶劑體系中用殼聚糖微球固定化Candida rugosa來源的脂肪酶催化制備油酸乙酯，當(dāng)酸醇摩爾比為1 ∶2、含水率為8%時，在40 ℃、200 r／min 振蕩反應(yīng)8 h后，油酸乙酯的得率為61.9%，且該脂肪酶經(jīng)固定化后，催化效果明顯提高，在后續(xù)工作中，可以考慮對TlLip2 進(jìn)行固定化，以提高其穩(wěn)定性和重復(fù)使用性。

2.3.2 異辛烷溶劑體系中制備油酸乙酯

無溶劑體系中的酯化率較低，可能是因為底物乙醇和TlLip2 接觸幾率大，導(dǎo)致酶變性，同時反應(yīng)產(chǎn)生的水使酯化反應(yīng)朝著逆反應(yīng)水解反應(yīng)進(jìn)行。TlLip2 的溶劑耐受性較好，在異辛烷中的催化活性幾乎不受影響，因此采用異辛烷作溶劑。以摩爾比1 ∶1和1 ∶2 加入油酸和乙醇，酸醇摩爾比為1 ∶2 時，油酸乙酯的得率為62.1%，是酸醇摩爾比為1 ∶1 時的2 倍，酯化率遠(yuǎn)高于無溶劑體系。分析原因可能是異辛烷溶劑體系使TlLip2 在油水界面被激活，并且在一定程度上緩解了乙醇對酶的抑制作用。高靜等［10］以異辛烷為溶劑、CTAB 為表面活性劑、正己醇為助溶劑構(gòu)建逆膠束體系，用質(zhì)量濃度為0.1 g／L 的脂肪酶Lipex 催化制備油酸乙酯，當(dāng)酸醇摩爾比為1 ∶4、水含量（以CTAB 和水的摩爾比表示）為10 時，在25 ℃、150 r／min 振蕩反應(yīng)12 h后，得率為67.4%；反應(yīng)72 h 后，得率為81.0%。此外，該研究指出在12 h 內(nèi)，油酸乙酯的得率隨時間呈線性增長，當(dāng)反應(yīng)12 h 時，該研究中的油酸乙酯得率與本研究相近，但延長時間后得率明顯提高，因此，在后續(xù)工作中應(yīng)當(dāng)探討油酸乙酯得率與反應(yīng)時間的關(guān)系。

3 結(jié)論

1）將全基因合成的來源于解酯嗜熱菌T.lipolytica的脂肪酶基因（TlLip2）克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET28a 中，獲得重組質(zhì)粒pET28a-TLL2，將pET28a-TLL2 轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）宿主菌中進(jìn)行高效表達(dá)。經(jīng)過熱處理和鎳柱親和層析對重組酶進(jìn)行純化，由SDS-PAGE 分析可知純化后的重組酶TlLip2 的亞基分子量為57 ku，純化倍數(shù)為12.3，TlLip2 的比酶活達(dá)到31 U／mg。

2）對該重組酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)測定，結(jié)果表明TlLip2 的最適溫度為60 ℃，最適pH 為8.0，在60 ℃以下、pH 6.0～11.0 條件下穩(wěn)定性較好。K+、Na+對TlLip2 有較大激活作用，相對酶活提高30%左右，Co2+、Zn2+、SDS 和Tween 80 對酶活力抑制作用明顯，相對酶活降低超過70%。TlLip2 對中等碳鏈長度的脂肪酸顯示出更高的活性，尤其是對硝基苯己酯。在大部分有機(jī)溶劑中有較好的耐受性，尤其是極性較低的有機(jī)溶劑，如正己烷、正庚烷、正辛烷、異辛烷等。以對硝基苯棕櫚酸酯為底物時，該酶的動力學(xué)常數(shù)Km為0.29 mmol／L，Vmax為2.28 mmol／（L·min-1），kcat為6.19 s-1。

3）TlLip2 催化制備油酸乙酯的反應(yīng)體系中，油酸和乙醇的摩爾比為1 ∶2，加酶量為100 U／g （油酸），在60 ℃、180 r／min 下反應(yīng)12 h，油酸乙酯的最高得率為62.1%，表明TlLip2 催化制備脂肪酸酯的效果較好，對長鏈脂肪酸酯的制備具有較好的應(yīng)用前景。