潘小慧 兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV；or Hog cholera virus，HCV）引起的一種熱性、高致死性和高度接觸性傳染疾病[1]。該病僅對豬有易感性，不同品種、年齡和性別的豬只均可感染[2]。豬瘟病毒屬于黃病毒科（Flaviridae）、瘟病毒屬（Pestivirus），是單股正鏈RNA病毒?；蚪M全長12.3 kb，編碼4種結構蛋白（衣殼蛋白C和囊膜糖蛋白Erns、E1、E2）和8種非結構 蛋 白 （Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B）。其中 E2蛋白是CSFV誘導機體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原，是研究新型基因工程疫苗和血清學檢測方法的首選靶蛋白[3-6]。隨著生物信息學的發(fā)展，有學者研究發(fā)現(xiàn)E2蛋白在113-145和338-360位氨基酸處存在兩個主要跨膜區(qū)[7]，因此，對E2全基因進行體外表達可能存在困難。同時，早期研究表明E2蛋白存在A、B、C、D四個抗原區(qū)，4個抗原區(qū)均位于E2蛋白N端氨基酸殘基第690-866位[8]，而C端氨基酸殘基第866-1007位的部分基本上不參與這些表位的形成。因此，氨基酸殘基第690-866位的部分是E2蛋白最具有抗原性的部分[9]。

本研究擴增了E2蛋白A-D抗原表位區(qū) （第690-866氨基酸位點）的基因片段（以下將其對應表達的蛋白簡稱為E2AD蛋白），克隆到pET-28a表達載體中，并對E2AD蛋白的原核高效表達方法進行研究，同時對目的蛋白純化條件進行探索，最后通過Western blot試驗證明重組蛋白E2AD具有良好的反應原性，可為豬瘟病毒ELISA抗體檢測試劑盒的研制提供抗原支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌毒種和質粒 豬瘟細胞毒株由本公司提供；大腸桿菌DH5α受體菌購于天根生化科技 （北京）有限公司；大腸桿菌Transetta（DE3）表達菌購于北京全式金生物技術有限公司；pET-28a原核表達載體由福州大學生物科學與工程學院健康工程與技術研究所保存。

1.1.2 主要試劑 tacoTMDNA/RNA Extraction Kit購自金瑞鴻捷（廈門）生物科技有限公司；AMV反轉錄 酶 、HPRI、Random primer、DL1000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、dNTPs （2.5 mmol/L）、PrimeSTAR Max Polymerase、T4 DNA Ligase、EcoRI、BamHI和HindIII限制性內(nèi)切酶、卡那霉素、IPTG和A-garose購自寶生物工程 （大連）有限公司；蛋白質Marker購自天根生化科技（北京）有限公司；質粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自Megan(美基生物)；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、無水乙醇、冰醋酸、甲醇、甘油等均購自國藥集團化學試劑有限公司；蛋白凝膠試劑盒購于博士德生物工程有限公司；His融合蛋白純化柱 （5 mL預裝柱）購于上海七海復泰生物技術有限公司；TMB顯色液購自上海碧云天生物生物技術有限公司；豬瘟病毒陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；羊抗豬IgG-HRP是KPL公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 E2AD基因引物設計 參照GenBank中公布的豬瘟E2基因序列 （登錄號：AF531433.1），利用Oligo 7.0在E2基因核酸序列的2442-2972（氨基酸位置為690-866）區(qū)域設計引物。引物序列為E2AD-F：5'-CGGGATCCCGGCTAGCCTGCAAG GAAG-3'；E2AD-R：5'-GTCAAGCTTT TATAAATCTTCATTTTCCACTGTGG-3'，預期擴增片段大小約為546 bp。引物由Invitrogen公司合成。

1.2.2 豬瘟病毒RNA提取與反轉錄 按tacoTMDNA/RNA Extraction Kit儀器說明書提取細胞液中的豬瘟病毒RNA，所得RNA參照AMV反轉錄說明書進行反轉錄獲得cDNA。

1.2.3 E2AD基因的擴增 以1.2.2中獲得的cDNA為模板，用所設計的擴增引物進行PCR擴增，PCR反 應 體 系 50 μL：PrimeSTAR Max Premix （2 × ）25 μL，上、下游引物（20 μmol/mL）各 0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 23 μL。 PCR 反應條件：98 ℃預變性2 min，98 ℃變 性 10 s，58 ℃退火 5 s，72 ℃ 延伸5 s，30個循環(huán)；72℃ 延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測分析。

1.2.4 E2AD蛋白表達載體的構建與鑒定 將PCR產(chǎn)物參照DNA凝膠回收試劑盒說明書進行回收純化。純化后的E2AD片段和pET-28a空載體分別經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切，37℃酶切2 h。酶切產(chǎn)物使用1.0%瓊脂糖凝膠跑膠分離目的片段，切膠回收載體和片段后使用T4 DNA Ligase進行16℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉化進入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞涂板，挑取單菌落進行菌落PCR驗證，驗證引物為pET-28a載體通用引物。挑取驗證為陽性的單菌落于5 mL LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）培養(yǎng)12~16 h，參照質粒提取試劑盒說明書提取陽性質粒后，使用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII進行雙酶切鑒定。將鑒定正確的質粒送至測序公司測序，測序結果正確的陽性重組質粒命名為pET-28a-E2AD。

1.2.5 誘導表達及表達產(chǎn)物鑒定 將陽性重組質粒轉化入大腸桿菌Transetta(DE3)感受態(tài)細胞涂板，挑取陽性單菌落于5 mL LB培養(yǎng)基 （含50 μg/mL卡那霉素）中37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)過夜。次日按照1%轉接量接種于新的5 mL LB培養(yǎng)基內(nèi)，37℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.4~0.6時加入終濃度 分 別 為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 的 IPTG，37℃、200 r/min下誘導，并在誘導前及誘導后2、3、4、5 h分別取樣1 mL菌液。將誘導前后的菌液以12 000 r/min離心10 min，棄上清，取沉淀利用20 μL PBS液進行重懸后加入等量的 2×Loading Buffer，混勻后在沸水中煮15 min。待冷卻后分別取10 μL樣品進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染色、脫色液脫色后檢查特異性目的蛋白條帶約為25 kDa。

1.2.6 E2AD蛋白的大量表達與純化 按照1.2.5中優(yōu)化的誘導方法對pET-28a-E2AD進行大量誘導表達，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集菌體。然后用PBS吹打清洗菌體2遍，離心收菌。在收集后的菌體中加入30 mL PBS重懸菌體，吹打均勻后收集進入50 mL離心管中，冰浴30 min后300 W超聲波裂解15 min直到菌液變澄清。取1 mL超聲液離心，取上清和沉淀分別制樣后進行SDS-PAGE電泳，確定E2AD蛋白是包涵體表達。將剩下的超聲液-20℃保存過夜。次日，冷水浴緩慢溶解超聲液后4℃、12 000 r/min離心 10 min，棄上清，取沉淀；加入2 M尿素洗滌沉淀2遍，再次離心溶液、收集沉淀，加入8 M尿素溶液溶解后離心，取上清，棄沉淀。參照His融合蛋白純化柱（5 mL預裝柱）說明書純化上清，獲得粗提純蛋白溶液，然后利用透析袋梯度純化方法進行蛋白質復性后，收集E2AD融合蛋白于-20℃保存。

1.2.7 免疫印跡法鑒定重組蛋白E2AD 將純化的重組蛋白E2AD進行SDS-PAGE電泳，使用Bio-Rad點轉儀將蛋白轉至NC膜，按分子克隆實驗指南進行免疫印跡，一抗為豬瘟病毒陽性血清，二抗為羊抗豬IgG-HRP。

1.2.8 E2AD蛋白濃度的測定 參照BCA蛋白濃度測定試劑盒操作說明書對E2AD蛋白濃度進行測定。

2 結果與分析

2.1 E2AD基因的擴增 以反轉錄的豬瘟cDNA為模板，E2AD-F和E2AD-R為引物，通過PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，結果表明擴增產(chǎn)物大小約546 bp，與預期擴增結果相符（見圖1）。

圖1 PCR擴增E2AD基因片段

2.2 pET-28a-E2AD表達載體的構建與鑒定 純化后的E2AD基因片段與pET-28a空載體雙酶切進行凝膠驗證，回收目的片段連接。連接產(chǎn)物轉化進入感受態(tài)細胞后，通過PCR驗證得到陽性克隆菌落的條帶大小約834 bp（見圖2）。對PCR鑒定為陽性的重組質粒進行單酶切、雙酶切驗證（見圖3）；驗證正確后送至測序公司測序，比對顯示，pET-28a-E2AD中E2AD基因序列正確。

圖2 pET-28a-E2AD菌落PCR擴增結果

圖3 pET-28a-E2AD酶切驗證結果

2.3 E2AD蛋白的誘導表達

2.3.1 IPTG濃度的確定 將pET-28a-E2AD表達菌搖至 OD600為 0.4～0.6時加入 IPTG誘導 4 h，SDS-PAGE電泳顯示，在25 kDa處出現(xiàn)目的蛋白條帶，且IPTG濃度為0.2 mmol/L時目的蛋白表達量最多，隨著IPTG濃度的增大，蛋白表達量逐漸降低或者沒有增加的趨勢，因此，確定IPTG最佳誘導濃度為 0.2 mmol/L（見圖 4）。

2.3.2 誘導時間的確定 將pET-28a-E2AD表達菌用濃度為0.2 mmol/L的IPTG分別誘導2 h、3 h、4 h和5 h，取誘導前后菌液制樣經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定。結果顯示，誘導4 h和5 h時蛋白表達量最多，因此，確定IPTG誘導時間為4 h即可（見圖5）。

圖4 pET-28a-E2AD的IPTG誘導濃度的確定

圖5 pET-28a-E2AD的IPTG誘導時間的確定

2.4 E2AD蛋白的純化 大量表達E2AD蛋白后使用Ni-NTA蛋白純化柱純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，前3管洗脫液中的純化效果較好（見圖6）。

圖6 E2AD蛋白純化

2.5 E2AD蛋白的免疫印跡分析 用豬瘟陽性血清為一抗、羊抗豬IgG-HRP為二抗對重組蛋白E2AD進行Western blot檢測，結果表明，在25 kDa處出現(xiàn)反應條帶（見圖7），說明蛋白具有活性。

圖7 E2AD蛋白的Western blot鑒定

2.6 蛋白濃度測定 經(jīng)檢測，純化的蛋白濃度為0.2 g/L。

3 討 論

豬瘟對養(yǎng)豬業(yè)危害嚴重，是世界糧農(nóng)組織和各國政府嚴密監(jiān)控和檢疫的主要傳染病之一。目前免疫學檢測和核酸檢測是疫病檢測的主要檢測方法，其中酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）以其操作簡便、敏感性高、適于大規(guī)模樣品檢測的優(yōu)點成為檢測抗體的主要免疫學方法，也是監(jiān)測豬群抗體水平的主要技術手段。用于ELISA的包被抗原主要是全病毒和重組蛋白，由于CSFV在體外細胞上不產(chǎn)生病變，增殖能力差，對培養(yǎng)條件要求高[10]，從而導致以病毒培養(yǎng)液作為包被抗原的ELISA結果不是十分穩(wěn)定。因此，許多研究者相繼研發(fā)出以重組蛋白E0或E2作為包被抗原的CSF抗體檢測試劑盒[11-13]。豬瘟病毒的12種蛋白中，E2蛋白是CSFV粒子表面一種包膜糖蛋白，是病毒吸附、進入宿主細胞的關鍵蛋 白[14-15]。E2糖蛋白是一種免疫優(yōu)勢蛋白，能夠誘導動物機體產(chǎn)生特異性中和抗體，一直是研究的熱點。隨著生物信息學的發(fā)展，研究學者對E2全蛋白的抗原結構的研究更加深入。研究發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒E2糖蛋白氨基端存在A、B、C、D四個抗原結構域，其中D/A區(qū)是豬瘟病毒基因組中高度保守的區(qū)域，B/C區(qū)位于決定病毒株抗原特異性的區(qū)域[16]。因此，本研究選擇E2糖蛋白的A-D抗原表位區(qū)而非E2全蛋白進行克隆表達，不僅減少了表達蛋白的分子量，便于蛋白的表達和純化，而且以E2主要抗原區(qū)為包被抗原能增加抗體檢測的特異性。

大腸桿菌表達系統(tǒng)以其周期短、效率高、操作簡便等優(yōu)點成為工業(yè)生產(chǎn)中比較理想的表達方式。影響外源基因在其中高效表達的因素主要有表達載體、宿主細胞的選擇和表達條件（誘導時間、誘導溫度和誘導劑IPTG的濃度等）[17]。本研究使用帶有His標簽的pET-28a載體表達融合蛋白，有利于目的蛋白的分離純化；同時選用經(jīng)過基因改造的大腸桿菌Transetta（DE3）作為表達宿主菌，補充了菌體中缺乏的6種稀有密碼子對應的tRNA，以期達到提高外源真核基因E2AD表達水平的目的。在表達條件的優(yōu)化上，本研究首先使用不同濃度的誘導劑IPTG進行誘導，發(fā)現(xiàn)并非IPTG的誘導濃度越高蛋白的表達量就越多，過高濃度的IPTG對菌體生長還會有抑制作用。同時對誘導時間進行梯度試驗，發(fā)現(xiàn)誘導時長4 h與5 h差異不大。所以，試驗最后確定IPTG的誘導濃度為0.2 mmol/L，誘導時間為4 h。

利用大腸桿菌表達系統(tǒng)雖然能夠高效表達重組蛋白，但是重組蛋白通常以包涵體形式存在。本研究中E2AD蛋白也是主要以包涵體形式表達的，因此包涵體的變性、純化和復性是使重組蛋白具有生物學活性的關鍵步驟。包涵體的處理一般包括菌體的破碎、包涵體的洗滌、溶解、純化以及復性。本試驗對菌體的破碎條件進行了探索，經(jīng)過多次對比發(fā)現(xiàn)，在200 W超聲5 s、停8 s條件下，超聲破碎99次后將超聲后液體放入-20℃再進行凍融裂解效果比較理想。經(jīng)破碎和凍融后的包涵體中除了目的蛋白外，還有核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白、脂質和脂多糖等雜質[18]，這些可能對目的蛋白的純化造成干擾。通常人們使用中等濃度的變性劑如TritonX-100或者尿素等緩沖液洗滌包涵體幾次來除去雜質。由于試驗中使用8 M尿素作為變性劑，為了不引入新的離子，本試驗使用2 M尿素洗滌包涵體2遍，然后再使用8 M尿素完全溶解后上柱洗脫，最終獲得了較多的目的蛋白。

4 結 論

本研究成功構建了表達E2基因主要抗原區(qū)的原核表達載體pET-28a-E2AD，并通過對表達條件和包涵體純化條件的探索，最終獲得純度高、具有活性的重組蛋白E2AD，為后續(xù)豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒的研制奠定了基礎。