李艷暉 南平市延平區(qū)飼料工作辦公室 福建南平 353000

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS）又稱豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種高度接觸性傳染性疾病。PRRSV的實(shí)驗(yàn)室診斷方法很多，最常用的是ELISA檢測技術(shù)[1]。但目前豬的疫病十分復(fù)雜，在感染了PRRSV的豬群中容易發(fā)現(xiàn)沙門氏菌、鏈球菌、副豬嗜血桿菌等的繼發(fā)感染以及與圓環(huán)病毒的共感染[2]，因此，ELISA檢測結(jié)果不能作為確診的依據(jù)，此外ELISA方法不易檢查患畜的早期感染，有時(shí)難以區(qū)分被動免疫和自然感染產(chǎn)生的抗體水平，容易漏診或誤診[3-4]。RT-PCR檢測技術(shù)在PRRSV診斷中，能夠快速準(zhǔn)確地對病原體進(jìn)行定性[5-6]，該法在發(fā)病初期即發(fā)病1周以內(nèi)處于病毒血癥期檢出率最高，并且采樣簡單，可直接采血分離血清[7]，對發(fā)病時(shí)間較長的豬則應(yīng)采取臟器，其中肺臟和淋巴結(jié)檢出率較高。因此，結(jié)合ELISA檢測技術(shù)以及RT-PCR檢測方法，在PRRS的診斷及跟蹤監(jiān)測方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 氯仿、異戊醇（24：1）、乙酸鈉、異丙醇、75%乙醇、DEPC 水、5×MMLV Buffer、MMLV， 購于Promega 公 司 ；Trizol LS Reagent、25 mg MgCl2、RNase inhibitor、dNTP mixture均購于大連寶生物工程公司；Taq酶、10×PCR Buffer，購于北京天為時(shí)代公司；上游引物：5′-TGGCCAGCCAGTCAATC-3′，下游引物：5′-GCCCTAATTGAATAGGT-3′， 預(yù)擴(kuò)增片段大小為427 bp，引物由TaKaRa公司合成；Herd-Chek豬藍(lán)耳病抗體檢測試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 ELISA檢測

1.2.1.1 樣品采集與預(yù)處理 采集南平市延平區(qū)某豬場未進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征疫苗免疫的仔豬血液樣品115份，及時(shí)送檢，將送檢樣品3 000 r/min離心5 min，取血清備用。

1.2.1.2 材料準(zhǔn)備 所有試劑使用前置室溫 （18～25℃）平衡0.5～1 h；將10×溶縮洗滌液用去離子水稀釋至1×，現(xiàn)配現(xiàn)用；將3×樣品稀釋液用去離子水稀釋至1×，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.1.3 判定標(biāo)準(zhǔn) PRRS抗體的有無 （陽性/陰性）通過計(jì)算樣品/陽性對照（S/P）的比值判定。S/P≥0.4判為陽性，表明抗體存在；S/P＜0.4判為陰性，表明無抗體存在。

1.2.2 RT-PCR檢測

1.2.2.1 樣品采集與處理 無菌采集組織病料，取可疑豬的肺、淋巴結(jié)、腎等組織，按1：3加入TE Buffer研磨成組織懸液，于-20℃反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心10 min，備用。

1.2.2.2 RNA提取 取研磨病料上清150 μL，加入Trizol 750 μL，混勻，室溫放置8 min；同時(shí)加入50 μL 乙酸鈉和 200 μL 氯仿：異戊醇（24：1），混勻2 min，室溫放置10 min后，于 4℃下 12 000 r/min離心10 min；慢慢吸取上清500 μL轉(zhuǎn)入新管中，加入等量異丙醇，-20℃放置30 min；12 000 r/min離心15 min，吸棄上清，加入70%乙醇200 μL洗滌，12 000r/min離心15 min；棄上清，于生物安全條件下干燥，用DEPC水溶解沉淀，-20℃保存。

1.2.2.3 RT-PCR反應(yīng)體系及條件 RT反應(yīng)體系見表1。反應(yīng)條件為：42 ℃、1 h，99 ℃、5 min，4℃保存。

表 1 10 μL RT 反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系見表2。反應(yīng)條件為：95℃、5 min，94 ℃、1 min，53.5～56 ℃、1 min，72 ℃、1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃、10 min后，4℃保存。

表 2 20 μL PCR反應(yīng)體系

取 RT-PCR 產(chǎn)物 6 μL、6×Loading Buffer 2 μL、熒光燃料2 μL，于2.0%瓊脂糖凝膠80 V電泳45～50 min。

1.2.3 疫情背景及現(xiàn)場調(diào)查 到場巡查公豬、母豬、哺乳仔豬、后備母豬及菜豬的健康狀況，調(diào)查仔豬成活率，對病死豬進(jìn)行剖檢、記錄。母豬群有少數(shù)已出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，表現(xiàn)食欲不振（尤以懷孕后期為重）、發(fā)燒（39～41 ℃）、腹式呼吸。 少數(shù)母豬耳部、乳頭、腹部發(fā)紺，尤其耳尖部。5%～35%妊娠后期母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)，出現(xiàn)死胎、木乃伊胎。母豬返情率增加。仔豬出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)癥狀。

剖檢患豬，病變表現(xiàn)為全身淋巴結(jié)腫脹，部分淋巴結(jié)出血，心肌心耳出血，心包及胸腔積液，肺臟水腫、間質(zhì)性肺炎。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA檢測結(jié)果 豬場藍(lán)耳病抗體檢測結(jié)果見表3。豬場免疫經(jīng)典毒株藍(lán)耳病疫苗或沒有免疫過藍(lán)耳病疫苗，在豬場穩(wěn)定的情況下，采用ELISA方法檢測藍(lán)耳病抗體，S/P值一般不會超過2.6，若出現(xiàn)S/P值過高的情況，則豬場有可能感染過藍(lán)耳病病毒或當(dāng)前豬場藍(lán)耳病狀況不穩(wěn)定，呈現(xiàn)藍(lán)耳病病毒活躍狀態(tài)。檢測結(jié)果顯示，在115份仔豬血樣中，檢出藍(lán)耳病抗體陽性數(shù)110份（S/P≥0.4），陽性率95.7%、陰性率4.3%。全部樣品藍(lán)耳病抗體S/P平均值為2.069，變異系數(shù)（離散度）51.36%，其中S/P值≥2.6的數(shù)量有35份，占檢測數(shù)量的30.4%；并且S/P值≥3.0的個(gè)體占檢測數(shù)的20.9%（24/115），比例較高。因仔豬的藍(lán)耳病母源抗體可以維持到40日齡左右，所以從檢測結(jié)果可以間接反映出該場母豬藍(lán)耳病狀況不穩(wěn)定，初步推斷該豬場已經(jīng)有藍(lán)耳病病毒流行。

2.2 RT-PCR檢測結(jié)果 電泳結(jié)果顯示，待檢樣品擴(kuò)增得到一條與陽性對照相符、大小約427 bp的特異性條帶（見圖1），說明該豬場有藍(lán)耳病毒存在。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳

2.3 防控方案 生產(chǎn)母豬、公豬及后備公母豬選用勃林格公司PRRS活疫苗1.5頭份普免，隔3周2頭份加強(qiáng)免疫1次。仔豬7～15日齡時(shí)用哈爾濱維科公司PRRS活疫苗首免，每頭接種活疫苗1頭份，30～35日齡加強(qiáng)免疫1次。觀察、記錄豬群健康和仔豬成活率。

該場加強(qiáng)藍(lán)耳病活疫苗免疫約3個(gè)月后，豬群發(fā)病率下降且仔豬存活率由48%提高到88%，母豬的生產(chǎn)性能也得到明顯改善，該場藍(lán)耳病的發(fā)病和流行得到了初步控制。

表3 延平區(qū)某豬場豬藍(lán)耳病抗體ELISA檢測數(shù)據(jù)

3 討 論

1）豬藍(lán)耳病靠傳統(tǒng)的臨床癥狀和流行病學(xué)資料已很難作出準(zhǔn)確診斷，要想準(zhǔn)確、快速地診斷PRRSV感染，必須采用實(shí)驗(yàn)室診斷。目前用于PRRSV實(shí)驗(yàn)室診斷方法有病原學(xué)檢查、血清學(xué)檢查等。血清學(xué)診斷用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，該方法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動化操作等特點(diǎn)，其檢測的結(jié)果能比較客觀地顯示豬場藍(lán)耳病抗體S/P值的整體水平。但血清學(xué)診斷方法也有些不足之處，對急性感染敏感性差，工作量大，且有時(shí)難以區(qū)分被動免疫和自然感染產(chǎn)生的抗體水平，容易漏診或誤診。隨著分子生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，分子生物學(xué)診斷技術(shù)如PCR診斷技術(shù)，以其敏感性、特異性強(qiáng)而廣泛用于實(shí)驗(yàn)室和臨床樣品中病毒的檢測。由于PCR技術(shù)具有快速、特異、敏感和易于操作等優(yōu)點(diǎn)，在PRRSV感染的臨床診斷中已得到廣泛的推廣應(yīng)用。

2）對從延平區(qū)某豬場采集的115份血清樣本用ELISA方法進(jìn)行豬藍(lán)耳病抗體檢測，結(jié)果95.7%的樣本為陽性，抗體水平高低不均勻，S/P值≥2.6的個(gè)體比例偏高，懷疑該場有豬藍(lán)耳病病毒隱性感染。再結(jié)合RT-PCR檢測方法從采集的病料組織中擴(kuò)增出PRRSV特異基因片段，確診該豬場存在豬藍(lán)耳病病毒感染。確診后采取相應(yīng)的防控方案，即注射疫苗加強(qiáng)免疫，使豬群抗體水平達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的水平，使豬場內(nèi)無易感豬存在。通過跟蹤調(diào)查，約3個(gè)月后可見豬群臨床癥狀明顯減輕或消失，仔豬存活率由48%提高到88%，該病的發(fā)病和流行得到了很好的控制，豬群整體生產(chǎn)性能得到顯著提高，證明以藍(lán)耳病活疫苗免疫為主的防控方案的可行性。