張媛媛，朱 檸

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院呼吸科，上海 200040)

腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞、非腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)共同組成，對于腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、代謝及其與周圍環(huán)境的各種聯(lián)系和物質(zhì)交換均有重要作用。浸潤到腫瘤中的巨噬細(xì)胞稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，是肺癌微環(huán)境中的主要免疫活性細(xì)胞群，具有極強(qiáng)的多樣性和可塑性，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的極化與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，與腫瘤生長、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1-2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，在腫瘤微環(huán)境中，M1型和M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞均存在，早期以M1型為主，中晚期以M2型為主。因此，調(diào)控肺癌腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化已成為腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。

去泛素化酶頭帕腫瘤綜合征蛋白(cylindromatosis，CYLD)是泛素特異性蛋白酶家族的一種，通過自身去泛素化酶活性解除K63連接的泛素鏈，使其去泛素化，負(fù)調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)等多條信號通路[4-6]，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生物學(xué)功能，如腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、血管生成、炎癥反應(yīng)等。NF-κB信號通路與免疫和炎癥反應(yīng)直接相關(guān)，對誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化起到關(guān)鍵作用[7-8]。研究[9-11]發(fā)現(xiàn)，CYLD在包括肝癌、腎癌、結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中表達(dá)降低，發(fā)揮抑癌基因的作用。CYLD在肺癌中的作用及其對巨噬細(xì)胞極化的影響尚不清楚。因此，本研究旨在探討去泛素化酶CYLD對肺癌臨床預(yù)后及肺泡巨噬細(xì)胞極化的影響，并分析其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料大鼠來源的肺泡巨噬細(xì)胞NR8383(中科院上海細(xì)胞所)；CYLD抗體(美國CST公司，批號8462，工作濃度11 000)；NF-κB (美國CST公司，批號8242，工作濃度11 000)；磷酸化NF-κB(美國CST公司，批號3033，工作濃度11 000)；磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehydE-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH；美國CST公司，批號5174，工作濃度15 000)；蛋白酶抑制劑(美國CST公司，批號5870，工作濃度1100)；DRR047A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；SYBR Premix Ex Taq mix檢測試劑盒(日本TaKaRa公司)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(美國Invitrogen公司)。

1.2 臨床預(yù)后分析方法利用Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫探索CYLD mRNA與肺癌患者總體生存時間的關(guān)系。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染采用DMEM+體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清+質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素配制完全培養(yǎng)基，大鼠來源的肺泡巨噬細(xì)胞NR8383在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，3～4 d傳代1次。根據(jù)小干擾RNA(small interfere RNA，siRNA)的設(shè)計原則，設(shè)計2條CYLD的siRNA序列如下：siCYLD1: 5’-AGGAGAGGCTCAGCCTATTTA-3’；siCYLD2: 5’-TGTTACTTAGACTCAACTTTA-3’。取對數(shù)生長期的肺泡巨噬細(xì)胞NR8383稀釋至約5×105個細(xì)胞/mL,置于6孔板中，每孔加入1 mL，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明，用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染50 nmol/L CYLD siRNA轉(zhuǎn)染12 h后，離心并收集細(xì)胞，并用2 mL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，待測。

1.4 細(xì)胞分組和干預(yù)措施根據(jù)干預(yù)條件不同分為4個組：sicontrol組；sicontrol+羅氟司特組；siCYLD組；siCYLD+羅氟司特組。每組均予以10 mg/L脂多糖處理，同時予以二甲亞砜或羅氟司特10 mg/L干預(yù)24 h，分別收集mRNA和蛋白進(jìn)行后續(xù)研究。

1.5 熒光定量PCR檢測收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞懸液，用Trizol法提取mRNA,并用Nano Drop測濃度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA。本實驗采用10 μL反應(yīng)體系，用SYBR Premix Ex Taq mix檢測試劑盒，進(jìn)行PCR反應(yīng)。記錄每個孔的起峰值Ct，ΔCt=Ct基因-Ct內(nèi)參，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組，各樣品中基因mRNA的相對表達(dá)量=2-ΔΔCt。

1.6 Western blot檢測分別收集處理48 h后各組肺泡巨噬細(xì)胞NR8383,加入含磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液在冰上提取總蛋白，用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳膠電泳,待蛋白分離后切斷電源,將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上,將膜放置在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉的封閉液中室溫封阻1 h。分別予以一抗工作液、二抗工作液孵育，后用含Tween-20的磷酸鹽緩沖液漂洗后，將電化學(xué)發(fā)光法中超敏曝光液A液和B液以11 混合，均勻滴加在硝酸纖維素膜條帶上孵育1 min。置曝光裝置儀內(nèi)曝光，拍照。

炎癥因子引物序列IL-12上游引物5’-TGCCTTCACCACTCCCAAAACC-3’下游引物5’-CAATCTCTTCAGAAGTGCAAGGG-3’TNF-α上游引物5’-CTCTTCTGCCTGCTGCACTTTG-3’下游引物5’-ATGGGCTACAGGCTTGTCACTC-3’IL-8上游引物5’-GAGAGTGATTGAGAGTGGACCAC-3’下游引物5’-CACAACCCTCTGCACCCAGTTT-3’TGF-β上游引物5’-TACCTGAACCCGTGTTGCTCTC-3’下游引物5’-GTTGCTGAGGTATCGCCAGGAA-3’GAPDH上游引物5’-CCACATCGCTCAGACACCAT-3’下游引物5’-TGACCAGGCGCCCAATA-3’

2 結(jié)果

2.1 CYLD mRNA表達(dá)與肺癌總體生存時間的關(guān)系納入1 907例肺癌患者，其中鱗癌524例、腺癌719例，并根據(jù)CYLD mRNA表達(dá)的平均值，分為CYLD高表達(dá)組和CYLD低表達(dá)組。結(jié)果顯示：CYLD mRNA的表達(dá)與肺癌生存時間呈明顯正相關(guān)(HR：0.60，95%CI：0.53～0.68，P<0.05)，亞組分析顯示：CYLD mRNA的表達(dá)與肺腺癌生存時間呈明顯正相關(guān)(HR：0.46，95%CI：0.36～0.59，P<0.05)；CYLD mRNA的表達(dá)與肺鱗癌生存時間無明顯相關(guān)性(HR：0.89，95%CI：0.7～1.12，P>0.05)。提示去泛素化酶CYLD在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因的作用。見圖1。

圖1 CYLD mRNA與肺癌總體生存時間的關(guān)系

2.2 siRNA技術(shù)敲低肺泡巨噬細(xì)胞CYLD后其蛋白表達(dá)情況采用siRNA技術(shù)敲低肺泡巨噬細(xì)胞中CYLD的表達(dá)，行Western blot檢測，同時用Image J進(jìn)行灰度掃描。結(jié)果顯示：相較于sicontrol組，siCYLD1、siCYLD2序列均可有效敲除CYLD的表達(dá)(F=48.370，P<0.05)。這證實本研究的siCYLD可以進(jìn)行后續(xù)研究。見圖2。

2.3 敲低CYLD對肺泡巨噬細(xì)胞中IL-12、TNF-α、IL-8、TGF-β mRNA水平的影響相較于sicontrol組，敲低CYLD后，M1相關(guān)炎癥因子IL-12(F=5.527，P<0.05)、TNF-α mRNA(F=7.376，P<0.05)的表達(dá)水平顯著增高，M2相關(guān)炎癥因子IL-8(F=12.990，P<0.05)、TGF-β mRNA(F=10.730，P<0.05)的表達(dá)水平顯著降低，而羅福司特則可部分逆轉(zhuǎn)此改變。見圖3。

2.4 敲低CYLD對肺泡巨噬細(xì)胞中NF-κB的磷酸化水平的影響相較于sicontrol組，敲低CYLD后，NF-κB的磷酸化水平顯著增加，而羅氟司特處理能夠降低NF-κB的磷酸化水平(F=5.477，P<0.05)。結(jié)果提示：CYLD可抑制NF-κB的磷酸化水平，而羅福司特能夠部分逆轉(zhuǎn)此過程。見圖4。

圖2 siRNA技術(shù)敲低肺泡巨噬細(xì)胞CYLD后其蛋白表達(dá)情況

圖3 敲低CYLD對肺泡巨噬細(xì)胞中IL-12、TNF-α、IL-8、TGF-β mRNA水平的影響

圖4 敲低CYLD對肺泡巨噬細(xì)胞中NF-κB的磷酸化水平的影響

3 討論

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞起源于循環(huán)系統(tǒng)中的單核細(xì)胞，具有極強(qiáng)的多樣性和可塑性，在不同的微環(huán)境中獲得不同的表型特征，可被干擾素γ、Toll樣受體配體、IL-4、IL-13誘導(dǎo)分化為M1型或M2型2個具有不同功能的亞群[12]。干擾素γ或干擾素γ聯(lián)合Toll樣受體配體可通過活化干擾素調(diào)節(jié)因子3/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子1信號通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M0型分化為M1型，即經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞，分泌大量的前炎癥因子、炎癥因子(IL-1、IL-6、IL-12和TNF-α等)、趨化因子(CCL2、CCL3、CXCL9、CXCL10)、蛋白酶、活性氧中間體和活性氮介質(zhì)，其表面表達(dá)主要組織相容復(fù)合物Ⅱ、B7分子、調(diào)理素受體，吞噬殺傷微生物和腫瘤細(xì)胞，遞呈抗原，誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，發(fā)揮殺傷病毒、細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞作用。M2型巨噬細(xì)胞，即替代活化的巨噬細(xì)胞，在不同炎癥因子作用下，可分化為M2a、M2b、M2c 3種亞型。IL-4、IL-13使M2型巨噬細(xì)胞分化為M2a，其可激活Th2型細(xì)胞，誘發(fā)Ⅱ型變態(tài)反應(yīng)；免疫復(fù)合物/Toll樣受體/IL-IR配體使M2型巨噬細(xì)胞分化為M2b，刺激Th2細(xì)胞激活,調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)；糖皮質(zhì)激素、IL-10則可使M2型巨噬細(xì)胞分化為M2c，M2c主要參與基質(zhì)降解和組織重構(gòu)。M2型巨噬細(xì)胞高分泌TGF-β、IL-10，高表達(dá)甘露糖受體、清道夫受體、精氨酸酶-1，誘導(dǎo)Ⅱ型免疫應(yīng)答，發(fā)揮抑制炎癥、免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)與重建的作用[13-14]。

巨噬細(xì)胞的浸潤與極化受到腫瘤細(xì)胞及腫瘤微環(huán)境中多重信號的調(diào)控。腫瘤微環(huán)境中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可釋放大量的細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白酶等，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞及免疫細(xì)胞的功能發(fā)生變化[15]。CYLD是一種關(guān)鍵的誘導(dǎo)性負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，在肺癌、肝癌、口腔癌等多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮抑癌基因的作用[9, 16-17]。CYLD除了調(diào)節(jié)NF-κB依賴性表達(dá)外，還通過靶向腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子、絲裂原活化蛋白激酶、JNK、p38、蛋白激酶B信號通路，在細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4, 18]。羅氟司特是第1個用于臨床的磷酸二酯酶4選擇性抑制劑，其可通過增加環(huán)磷酸腺苷濃度,進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)[19]。Komatsu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，PDE4B抑制劑羅氟司特可增加CYLD的表達(dá)，來發(fā)揮抑制炎癥因子IL-1、TNF-α等表達(dá)的作用。

本研究通過肺癌生存分析發(fā)現(xiàn)：CYLD mRNA的表達(dá)與肺癌患者的總體生存時間呈明顯正相關(guān)，亞組分析顯示，肺腺癌患者CYLD mRNA表達(dá)越高，總體生存時間越長，而肺鱗癌患者CYLD mRNA表達(dá)與總體生存時間無關(guān)。進(jìn)一步體外研究發(fā)現(xiàn)：敲低CYLD表達(dá)后，M1型相關(guān)炎癥因子IL-12、TNF-α表達(dá)顯著增高，M2型相關(guān)炎癥因子IL-8、TGF-β表達(dá)明顯降低。提示敲低CYLD可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步Western blot研究發(fā)現(xiàn)：CYLD可能是通過抑制NF-κB磷酸化水平，進(jìn)而調(diào)控巨噬細(xì)胞極化，抑制炎癥因子合成，而羅氟司特可部分逆轉(zhuǎn)此變化?？傊?，CYLD可通過抑制NF-κB信號通路的活性，抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，同時降低腫瘤微環(huán)境中炎癥因子的表達(dá)水平。但CYLD調(diào)控NF-κB磷酸化的具體分子機(jī)制尚不清楚，有待深入研究進(jìn)一步明確。

綜上所述，巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中重要的免疫活性細(xì)胞群，調(diào)控巨噬細(xì)胞極化已成為腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。CYLD在肺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，其表達(dá)與肺癌總體生存時間明顯相關(guān)，尤其腺癌患者獲益更明顯。CYLD可通過間接抑制NF-κB磷酸化水平，抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化，誘導(dǎo)其向M2型轉(zhuǎn)化，抑制肺泡微環(huán)境的炎癥水平，為調(diào)控巨噬細(xì)胞極化提供了依據(jù)。