周琦，易鑫，歐陽祝，李貴節(jié),2，朱霞建，范佳瑩，李則靈，談安群，黃林華，王華*

1(西南大學柑桔研究所，中國農業(yè)科學院柑桔研究所，重慶，400712) 2(重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶第二師范學院，重慶，400067)

柑橘是我國種植面積和產量均居第一的水果，其產量高達4 138.14萬t(2018年)，按種類可主要分為寬皮柑橘、橙、柚、檸檬及其他柑橘五大類。寬皮柑橘是一類果皮寬松，易剝皮、汁多肉粒飽滿的柑橘品種。2017年我國寬皮柑橘產量達1818.77萬t，占當年總柑橘產量的47.7%，屬產量最高的柑橘品種。寬皮柑橘在我國品種多樣，資源豐富，主要栽培品種有溫州蜜柑、椪柑和南豐蜜桔，其產量分別占我國柑橘總產量(2017年)的23.4%、10.3%及6%[1]。

溫州蜜柑又名無核蜜橘、溫州柑等，主產于日本、韓國、浙江、廣西、湖南、湖北等區(qū)域，果實9月中下旬成熟，具有高糖低酸、無核、皮薄等許多優(yōu)良特點，產量占寬皮柑橘總產量的70%左右[2]。我國溫州蜜柑品系諸多，大多從日本引進，少數(shù)為自己選育而成。成傳香等[3]通過研究3種中國主栽寬皮柑橘制汁品質，結果表明，相比于南豐蜜桔與椪柑溫州蜜柑不論是色澤、總酚含量還是香氣物質總量均表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，是我國最適合制汁用的主栽寬皮柑橘品種；金潤楠等[4]則通過對浙江、湖南和湖北3個產區(qū)的宮川和尾張溫州蜜柑的香氣成分進行分析，結果顯示，不同產區(qū)的相同品種具有其產區(qū)特有味道，且甜香味為宮川品種的特殊成分。香氣是影響柑橘加工制品品質最重要的因素之一[5-6]，且受不同因素的影響，已有研究雖表明不同品種的寬皮柑橘汁的香氣成分是存在差異性[7]，但對溫州蜜柑香氣成分與其品種的研究較少，且有關溫州蜜柑品種的數(shù)量的研究也較少。

溫州蜜柑雖然是我國產量最大的寬皮柑橘品種，但主要以鮮銷為主，深加工以桔瓣罐頭為主，制汁占比較小[8]，遠低于其他汁用柑橘品種。本研究以18種的主栽溫州蜜柑為對象，模擬工業(yè)中橙汁的生產對溫州蜜柑進行制汁，利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法結合主成分分析探究其香氣成分的差異性，從而進一步對溫州蜜柑汁用提供數(shù)據(jù)支撐以提高我國寬皮柑橘利用率，解決鮮果滯銷難題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

成熟的溫州蜜柑果實均采自中國農業(yè)科學院/西南大學柑桔研究所國家果樹種植柑橘資源圃(東經 106°43′、北緯29°83′)，樣品信息見表1。

表1 柑橘樣品信息Table 1 The information of citrus samples

1.1.2 試劑與耗材

環(huán)己酮(>99.5%,色譜純)，aladdin公司；甲醇、C5～C25正構烷烴均為色譜純，美國Honeywell公司。

1.2 儀器與設備

氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(Agilent 7890 GC-5977 MSD，配備30 m×0.25 mm，0.25 μm的DB-5MS石英毛細管色譜柱)，美國Agilent公司； H-100-DWBWIA01原汁機，惠人新生活文化傳媒有限公司；固相微萃取裝置(85 μm，CAR/PDMS)，美國Supelco公司; 50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭(DVB/CAR/PDMS)，美國Supelco公司；SQP十萬分之一天平，賽多利斯科學儀器有限公司； FiveEasy Plus pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；PAL-1型手持糖度計，日本ATAGO公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料處理及樣品制備

NFC果汁制備：采摘新鮮成熟的果實，去皮榨汁，經過100目紗網精濾，裝瓶備用。

樣品的前處理：取5 mL搖勻后的果汁于 20 mL螺口萃取瓶中，加入配制好的內標物3 μL(環(huán)己酮采用甲醇稀釋40倍)，充氮20 s，40 ℃平衡 20 min后插入SPME萃取頭于萃取瓶中，并置于40 ℃萃取30 min，樣品在平衡和萃取過程中用磁力攪拌器以240 r/min輕輕渦旋，于250 ℃上機解析 5 min。

柑橘汁模擬汁配制：參考DREHER的方法[9]并做修改：配制100.0 g糖溶液，含6.0 g蔗糖、3.0 g果糖和3.0 g葡萄糖，檸檬酸1.0 g，其余用水補足；再加入VC使其質量濃度為500.0 mg/L，得到模擬柑橘汁[pH 3.5、(11±0.5)°Brix]。

1.3.2 實驗條件

GC-MS升溫程序：起始溫度35 ℃，保持0 min；再以7 ℃/min 升至98 ℃；接著以3 ℃/min升至161 ℃，最后以10 ℃/min升至241 ℃；進樣口溫度230 ℃，不分流進樣；載氣(He)流速1.2 mL/min。

EI離子源；電子能量70 eV; 傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；質量掃描范圍m/z為40～350。

1.3.3 樣品揮發(fā)性有機物的定性與定量分析

定性分析：各揮發(fā)性成分采用安捷倫系統(tǒng)圖譜庫(W10N14.L)匹配、保留指數(shù)及利用模擬柑橘汁配備部分標準品三者相結合進行準確定性。

保留指數(shù)線性升溫公式如公式(1)所示[10]：

(1)

式中：t0為待測物質的保留時間；tn+1和tn分別表示碳原子數(shù)為n+1和n的正構烷烴的保留時間，且式中tn+1>t0>tn

定量分析： 參考SHUI等[11]定量方法稍作修改，以環(huán)己酮為內標物，采用內標法半定量。

各樣品揮發(fā)性有機物含量計算如公式(2)所示[12]：

(2)

式中：C待,待測物質的質量濃度，μg/mL；S待,待測物質的峰面積；ρ,環(huán)己酮的密度,即0.95 mg/μL；V1,樣品中加入環(huán)己酮的體積；S1,環(huán)己酮的峰面積；V待,樣品的體積。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

數(shù)據(jù)分析軟件采用The Unscrambler X 10.4和Qualitative Workflows B.08.00；數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 365；圖片處理采用Origin 2018；所有樣品平行實驗3次，結果以平均數(shù)±標準差顯示。

PCA分析步驟：以揮發(fā)性有機物(volatile organic compound，VOCs)種類為行，待測樣品種類為列，插入數(shù)據(jù)；通過analyze- Principal Component Analysis，選取Maximum components為4，進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 溫州蜜柑汁氣相色譜圖流出特性

本實驗采取HS-SPME-GC-MS測定了18種不同成熟期溫州蜜柑汁中香氣成分的種類及含量，定性方式采用保留指數(shù)[13]結合質譜，部分色譜峰結合標準品定性；其中保留指數(shù)值相差均在千分之五以內，質譜庫匹配度均高于91%，確保了結果的準確性。樣品溫州蜜柑汁共測出60種VOCs，以2003-4和寧紅73-19溫州蜜柑為例，典型的溫州蜜柑汁VOCs的總離子流圖如圖1所示。由圖1可知，溫州蜜柑色譜圖的物質流出除去0～6 min和30～38 min(此時間段只有極少物質流出且濃度極低)，大致可以分為以下幾個階段(圖中已標注)：階段1(RT：8.2～11.5，RI：927～1 062)主要是單萜類化合物以及少量低碳醇醛流出，包含了幾乎占自身總離子響應80%以上的D-檸檬烯；階段2(RT：11.6～18.4，RI：1 069～1 277)主要是醇類、醛酮類及少量單萜類化合物流出；階段3(RT：19.5～22.1，RI：1308～1376)主要是酯類物質的流出；階段4(RT：22.6～29.1，RI：1 390～1 562)主要是倍半萜類物質和其他碳原子數(shù)較大的化合物的流出。

圖1 典型溫州蜜柑汁的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of typical satsuma juice

2.2 不同品種溫州蜜柑汁香氣物質種類及含量的比較

柑橘汁的香氣是由單萜類、倍半萜類、醛類、酮類、醇類、酯類等多種VOCs混合后的綜合表現(xiàn)，且不同種類的香氣成分貢獻的作用不同[14]。18種溫州蜜柑經SPME富集后進行測定，其中單萜類化合物12種(包含D-檸檬烯)，倍半萜類化合物19種，醛類化合物8種，醇類化合物10種，酮類和酯類化合物種類最少，均為4種；此外，還有3種其他化合物被檢出，合計60種。

由表2可知，在所有的溫州蜜柑樣品中，單萜類和倍半萜類化合物無論是數(shù)量還是含量在所有的香氣成分中均是最高的，這與馮桂蓉[15]的研究結果相類似；除去D-檸檬烯后，單萜類化合物占總體香氣成分的比例可以達到58%～88%，總萜類化合物可以占80%以上。2003-4溫州蜜柑(Ⅱ)的單萜和倍半萜類化合物的含量遠高于其他品種，分別達655.7 μg/mL和90.45 μg/mL，但是萜類化合物的檢出數(shù)量與其他樣品幾乎相同，原因是巴倫西亞橘烯、β-月桂烯和γ-松油烯的含量較高，分別為69.71、164.60和367.58 μg/mL；此外，醇類和酯類化合物的種類和含量在所有樣品中也是最高的，分別達45.93 μg/mL(9種)和31.18 μg/mL(4種)，這也導致了其揮發(fā)性有機物的種類也是所有樣品中數(shù)量最多的，為42種。寧紅73-19(XVI)、大分1號(Ⅰ)和壽太郎(XVII)的醛類化合物在所有樣品中含量較高，分別達57.94、32.30 和30.16 μg/mL，原因是寧紅73-19(XVI)中的壬醛(29.73 μg/mL)、大分1號(Ⅰ)和壽太郎(XVII)中的正己醛(分別為17.97 μg/mL和17.98 μg/mL)含量較高，但是這3種溫州蜜柑的醛類化合物數(shù)量與其余品種相差無異，均為5種。所有樣品中酮類化合物和其他成分化合物總體含量和數(shù)量上相近。

對比18種溫州蜜柑香氣成分種類及含量，發(fā)現(xiàn)溫州蜜柑汁中醛類香氣物質主要是正己醛、正辛醛、壬醛和癸醛；醇類香氣物質主要是葉醇、芳樟醇、4-萜烯醇和α-松油醇；酮類香氣物質主要是甲基庚烯酮和香葉基丙酮；1,3,8-p-薄荷三烯、對傘花烴和百里酚只在少數(shù)幾個溫州蜜柑樣品中檢出。此外，酯類化合物作為主要的1類香氣貢獻成分，在所有溫州蜜柑樣品中檢出量僅為4種，且絕大多數(shù)溫州蜜柑僅含有一種(橙花乙酸酯)或不含有，這也導致了溫州蜜柑汁的香氣成分普遍低于甜橙汁，此結果與已有研究相類似[16]。

2.3 不同品種溫州蜜柑汁特征香氣成分的比較

柑橘汁中含量高的香氣物質其香氣強度不一定高，對總體香氣的貢獻也并不高，如幾乎在所有柑橘品種中均存在的物質D-檸檬烯；通常將分析得到的香氣物質的含量與其香氣閾值相比，比值被稱為香氣活力值(odor activity value, OAV)。一般OVA值>1則該香氣被認為對總體香氣有貢獻，被稱為特征香氣成分或主體香氣成分，且OAV值越高，該香氣物質的強度就越大，對總體香氣的貢獻也就越大[17]。通過HS-SPME-GC-MS對樣品香氣物質的定量結果并結合查閱文獻[5,18-22]及書籍[23]找到的各物質香氣閾值，計算出各香氣的OVA值，表3即為18種溫州蜜柑汁中OAV值>1的香氣物質及其香氣活度值。

表2 18個品種溫州蜜柑汁揮發(fā)性有機物分類匯總表Table 2 Classification summary table of volatile organic compounds in 18 kinds of satsuma juice

注：a：樣品編號對應表1中的樣品名稱；表中數(shù)據(jù)未包括D-檸檬烯；括號里的數(shù)字表示香氣物質的數(shù)量；實驗重復3次，結果采用平均數(shù)表示，保留小數(shù)點后兩位數(shù)，單位為μg/mL；ND表示未檢出

由表3可以看出，18種溫州蜜柑汁中特征香氣成分總共29種，其中單萜類9種、倍半萜類2種、醛類7種、醇類5種、酯類1種、酮類3種、其他成分2種。在所有特征香氣物質中，α-蒎烯、β-月桂烯、α-萜品烯、β-順式羅勒烯、γ-松油烯、α-萜品油烯、正己醛、壬醛、芳樟醇的OAV值較高，且在所有柑橘汁樣品中均能檢出，其中大多數(shù)柑橘汁樣品的γ-松油烯、正己醛、壬醛和芳樟醇的OAV值>100，可認為這些香氣成分對溫州蜜柑汁總體香氣起一定的調節(jié)作用，這也與FENG等[24]的研究結果相對應。

此外，別羅勒烯只在2003-4溫州蜜柑(Ⅱ)中檢出；2-已烯醛和L-香芹酮只在大分1號溫州蜜柑(Ⅰ)和壽太郎溫州蜜柑(XVII)中檢出；十二醛只在寧紅73-19溫州蜜柑(XVI)中檢出；紫蘇醛和香茅醇只在大分1號溫州蜜柑(Ⅰ)中檢出；百里酚只在壽太郎溫州蜜柑(XVII)中檢出，可認為這些香氣物質是某幾種溫州蜜柑特有的成分；而巴倫西亞橘烯和4-萜烯醇雖在所有溫州蜜柑汁樣品中檢出，但是只有在2003-4溫州蜜柑(Ⅱ)中OAV值較高，可認為其他品種的溫州蜜柑中巴倫西亞橘烯和4-萜烯醇的含量要低于2003-4溫州蜜柑(Ⅱ)，同時2003-4溫州蜜柑(Ⅱ)中橙花乙酸酯的OAV也明顯高于檢出品種。

表3 18種溫州蜜柑汁的特征香氣物質及香氣活度值Table 3 characteristic aromatic substances and odor activity value of 18 kinds of satsuma juice

注：表中第一行的羅馬數(shù)字對應表1中的樣品編號；b表示該香氣物質在油中的閾值，未標注則是在水中的閾值；該表中剔除了D-檸檬烯；結果采用平均數(shù)表示，保留小數(shù)點后一位數(shù)；ND表示未檢出

2.4 主成分分析

為進一步從整體上反應不同品種溫州蜜柑香氣成分構的差異，剔除了大部分樣品未檢出的特征香氣(如別羅勒烯、2-已烯醛和紫蘇醛等)，以18種溫州蜜柑樣品為分析對象，采用主成分分析對21種主體香氣成分進行分析，結果如圖2和圖3所示。由二維分值圖(圖2-A)可見溫州蜜柑汁樣品點分別匯聚，4個集合間差異明顯，其中2003-4溫州蜜柑(Ⅱ)和寧紅73-19溫州蜜柑(XVI)自成一個集合，與其余樣品間距明顯，另外2個集合中各成熟期的樣品均包含在內；由相關性載荷圖(圖2-B)可知，葵醛、α-松油醇、4-萜烯醇、橙花乙酸酯、巴倫西亞橘烯、α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、水芹烯、α-萜品烯、β-順式羅勒烯、γ-松油烯、α-萜品油烯在在PC-1上的相關度分量達到了0.8～1.0，而α-金合歡烯、壬醛、正辛醛在PC-2上的相關性分量達到了0.6～0.8，即這2組VOCs分別在X+和Y-方向上有較大貢獻，且在X+上作較大貢獻的多為單萜類物質；酮類物質雖在PC-2上的相關性分量僅達到0.5～0.6，但其只對Y-方向作貢獻；此外，對X+和Y-方向上起著共同較大貢獻的物質是醇類物質(芳樟醇和葉醇)，對X+和Y-方向起一定貢獻的是橙花乙酸酯和巴倫西亞橘烯，這也與圖2-A中溫州蜜柑汁樣品點的分布相吻合。由上述結果可知，特征香氣成分在不同種類的溫州蜜柑中分布具有特征性，可利用主成分分析進行放大區(qū)分，且溫州蜜柑的成熟期并不直接影響其特征香氣成分。由圖3可知，Hotelling’s T2檢驗僅有1個離群點，遠小于樣品數(shù)，且均未在較大誤差區(qū)(HotT2>15.96，F(xiàn)Res>1.76)出現(xiàn)；同時4組主成分對解釋方差和驗證方差的貢獻度分別達到了99.8%和97.3%，解釋方差與驗證方差基本接近；上述結果表明模型能夠很好地反映原始樣本的特征。

A-樣品分值圖；B-香氣成分的相關載荷圖圖2 溫州蜜柑汁主成分分值圖Fig.2 Score plotting of principal components analysis in satsuma juice注：圖1-A中圓形代表特早熟品種、正方形代表早熟品種、菱形代表中熟品種、三角形代表晚熟品種，圖中羅馬數(shù)字與表1中樣品編號相對應;圖1-B中不同種類的香氣物質采用不同的形狀標注，中文名與之對應

A-檢驗結果；B-主成分累計可釋方差圖3 溫州蜜柑汁樣品Hotelling’s T2檢驗結果及主成分累積可釋方差Fig.3 Hotelling's T test results and cumulative interpretable variance of the principal components of satsuma juice samples

3 結論

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法對18種溫州蜜柑汁進行測定，共檢測出58種香氣成分，其中有29種為特征香氣(OAV>1)，別羅勒烯、2-已烯醛、L-香芹酮、十二醛、紫蘇醛、茅醇和百里酚為品種特征性成分；此外，溫州蜜柑樣品在主成分分值圖空間分布上具有特征性，分布特征性受品種影響而與成熟期無直接關系，可利用主成分分析進行放大區(qū)分。同時，2003-4溫州蜜柑和寧紅73-19溫州蜜柑香氣種類量與含量較其他品種更佳。

綜上，本研究通過HS-SPME-GC-MS結合主成分分析比較了不同品種溫州蜜柑汁的香氣成分含量、特征香氣的差異，初步明確了各特征香氣對溫州蜜柑汁總體香氣品質的貢獻程度，選出了2種香氣品質較佳的品種；基于此，后續(xù)的研究可利用GC-O/MS結合感官評定設計香氣重組及缺失實驗對特征香氣成分進行驗證，并進一步分析各品種溫州蜜柑的特征香氣物質的差異對總體香氣的影響。