許哲瑋，陳坤，胡長鷹,2*

1(暨南大學(xué) 包裝工程學(xué)院，廣東 珠海，519070)2(暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510632) 3(華南理工大學(xué) 軟物質(zhì)科學(xué)與技術(shù)高等研究院，廣東 廣州，510640)

目前因食品在生產(chǎn)、運(yùn)輸以及銷售過程中受污染造成的食物中毒及傳染病造成了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[1-2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，世界上每年有6億人因食用受污染的食物患病，其中42萬人因此而喪命[3]。其中細(xì)菌總數(shù)是反映食品安全的指標(biāo)之一，實(shí)現(xiàn)一類食品微生物的快速檢測對食品安全有重要意義。目前，平板計(jì)數(shù)法是細(xì)菌檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法勞動(dòng)密集且依賴于操作者的經(jīng)驗(yàn)[4]。基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的細(xì)菌DNA檢測同樣因假陽性以及檢測廣譜性問題而受到限制[5-6]。近年來，通過適配體[7-10]、抗生素[11-13]以及抗體[14-16]等對細(xì)菌或細(xì)菌代謝產(chǎn)物的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌的快速靈敏檢測，其中部分方法對操作者經(jīng)驗(yàn)依賴性較小且能避免假陽性。

溶菌酶(lysozyme, LZM)是一種含有129個(gè)氨基酸殘基的堿性蛋白質(zhì)[17-18]，其在食品保藏中有一定的應(yīng)用[19-21]。通過對細(xì)胞壁中N-乙?；谒崤cN-乙?；咸前分g的β-1,4糖苷鍵水解[22-23]，LZM可以使不溶性肽聚糖轉(zhuǎn)化為可溶性糖肽，從而起到殺菌作用[24]。LZM蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中大量的游離氨基使其帶有大量的正電荷，LZM與帶檸檬酸配體金納米粒子(gold nanoparticles, GNPs)之間的靜電作用可以使GNPs聚集從而發(fā)生比色變化。另一方面，革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁與LZM的特異性結(jié)合可以屏蔽這一靜電作用。LZM對GNPs與目標(biāo)微生物之間的競爭結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的定量檢測。

比色法通過GNPs粒徑變化產(chǎn)生的顏色變化實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的定量[25]，但是目標(biāo)物質(zhì)與識(shí)別分子之間的結(jié)合常數(shù)過小將可能會(huì)導(dǎo)致GNPs的尺寸變化不夠明顯，檢測的靈敏度也將受到限制。激光光散射儀可通過粒子布朗運(yùn)動(dòng)引起的光強(qiáng)波動(dòng)檢測粒子尺寸信息，目標(biāo)物質(zhì)濃度可通過與GNPs的流體力學(xué)半徑(Rh)之間的線性關(guān)系實(shí)現(xiàn)定量。本研究通過激光光散射儀以及紫外光譜建立了革蘭氏陽性菌的廣譜檢測方法，并且激光光散射儀法的檢測靈敏度相比紫外光譜法實(shí)現(xiàn)了一個(gè)數(shù)量級(jí)的提高。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

四氯金酸水合物、無水檸檬酸鈉、溶菌酶(來源于雞蛋白)、牛血清蛋白，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；營養(yǎng)肉湯，北京索萊寶科技有限公司，實(shí)驗(yàn)用水，實(shí)驗(yàn)室自制一級(jí)水；塑料托盤，當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌種及培養(yǎng)基

大腸桿菌(ATCC8739)、金黃葡萄球菌(ATCC 6538)、單增李斯特菌(ATCC 19115)、枯草芽孢桿菌(ATCC 6633)試管斜面菌種，上海魯微技術(shù)有限公司；所用培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯。

1.1.3 儀器與設(shè)備

UV-1800 紫外光譜，日本島津公司；BI-200SM 激光光散射儀，美國布魯克海文儀器公司；TEM 1400透射電子顯微鏡，日本JOEL公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GNPs合成

GNPs根據(jù)BASTUS等報(bào)道的方法合成[26]。將100 mL 5.94 mmol/L檸檬酸鈉水溶液加入燒瓶中，加熱并強(qiáng)力攪拌至溶液沸騰后，向溶液中加入 38 μL 2.94 mol/L四氯金酸水溶液，溶液顏色由無色變?yōu)樗{(lán)色繼而變?yōu)樽霞t色最終呈現(xiàn)紅色。繼續(xù)加熱反應(yīng)15分鐘后停止加熱，待溶液冷卻后儲(chǔ)存于4 ℃冰箱。

制得的GNPs通過紫外-可見光(ultraviolet-visible，UV-Vis)光譜、激光光散射儀(dynamic light scattering，DLS)以及透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)進(jìn)行表征。

1.2.2 檢測條件優(yōu)化

1.2.2.1 孵育時(shí)間

將500 μL制得的GNPs與50 μL 0.14 mg/mL的LZM水溶液混合，并用純水補(bǔ)充溶液體積至2 mL，并用UV-Vis光譜記錄523、600 nm處吸光值的變化。

1.2.2.2 孵育pH

基于1.2中所優(yōu)化的檢測條件，將500 μL制得的GNPs與50 μL 0.14 mg/mL的LZM水溶液混合，分別用pH為5.0、6.0、7.0、8.0的10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)補(bǔ)充體積至2 mL，孵育15 min后測試樣品400～800 nm的UV-Vis光譜。

1.2.2.3 孵育溫度

基于1.2中所優(yōu)化的檢測條件，將500 μL制得的GNPs與50 μL 0.14 mg/mL的LZM水溶液混合，用pH為8.0的10 mmol/L PBS補(bǔ)充體積至2 mL。將溶液分別放置于30、35、40、45、50 ℃條件下孵育15 min后，測試樣品400～800 nm的UV-Vis光譜，信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：A600，A523分別代表樣品在600、523nm處的吸光值。

1.2.2.4LZM添加量

基于1.2中所優(yōu)化的檢測條件，將500μL制得的GNPs分別與0～70μL0.14mg/mL的LZM水溶液混合，并用pH為8.0的10mmol/LPBS補(bǔ)充體積至2mL。溶液常溫下孵育15min后分別通過UV-Vis光譜以及DLS測試各樣品400～800nm的UV-Vis光譜和Rh。

1.2.3 檢測體系選擇性

大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,B.subtilis)以及單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes,L.monocytogene)在37 ℃下用營養(yǎng)肉湯孵育17 h。所得菌液在3 000×g離心15 min后，除去上清液并重懸于pH為8.0的10 mmol/L PBS中，重復(fù)3次并最終控制菌液在波長為600 nm處的吸光值為1 (109CFU/mL)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步稀釋以達(dá)到所需濃度。

基于文中所優(yōu)化的檢測條件，取1 mL濃度為108CFU/mLE.coli、S.aureus、B.subtilis、L.monocytogene、0.05 mg/mL的牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)，并以1 mL pH為8.0的PBS作為空白對照，依次加入40 μL 0.14 mg/mL的LZM溶液以及500 μL GNPs，并用pH為8.0的10 mmol/L PBS補(bǔ)充體積至2 mL。樣品常溫下孵育15 min后測試各樣品400～800 nm的UV-Vis光譜，測試結(jié)果通過公式(1)轉(zhuǎn)化為信號(hào)強(qiáng)度。對于通過DLS檢測的樣品Rh(信號(hào)強(qiáng)度)，除了LZM溶液添加量為20 μL以及樣品在測試前以0.22 μL醋酸纖維素濾膜過濾外，其余操作相同。所得信號(hào)強(qiáng)度通過公式(2)歸一化：

(2)

式中：In為歸一化后的信號(hào)強(qiáng)度；IB為測試樣品的信號(hào)強(qiáng)度；ICK為空白對照組的信號(hào)強(qiáng)度；IH為上述5組中信號(hào)強(qiáng)度的最大值。

1.2.4 線性關(guān)系建立

分別取1 mL細(xì)菌濃度在105～ 108CFU/mL的S.aureus，根據(jù)1.2.3所述的2種方法進(jìn)行檢測。各細(xì)菌濃度重復(fù)3個(gè)平行樣。

1.2.5 真實(shí)體系檢測

為確定該體系在真實(shí)樣品檢測中的可行性及靈敏度，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。分別取1 mL濃度為107CFU/mL及108CFU/mL的S.aureus涂抹于塑料托盤表面5 cm×5 cm的矩形內(nèi)，待菌液在常溫下干燥后，通過棉拭子取樣。用浸泡在pH為8.0的無菌10 mmol/L PBS中的棉拭子在接種有細(xì)菌的矩形范圍內(nèi)來回涂抹10次，去除棉拭子木柄后將棉拭子放入含有10 mL pH為8.0的無菌PBS中。將液體搖勻后通過1.2.3所述的2種方法進(jìn)行檢測，各細(xì)菌濃度重復(fù)3個(gè)平行樣并計(jì)算平均濃度、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GNPs表征

如圖1所示，通過檸檬酸鈉還原法制得了直徑約為12 nm且單分散的GNPs。由于表面等離子體效應(yīng)，GNPs的UV-Vis光譜在523 nm處有一吸收峰，這為后續(xù)生物傳感器的構(gòu)建提供了良好的基礎(chǔ)。

A-GNPs TEM圖；B-GNPs粒徑分布；C-GNPs UV-Vis光譜圖1 GNPs表征Fig.1 Characterization of GNPs

2.2 GNPs-LZM競爭結(jié)合檢測體系可行性

LZM是一種堿性蛋白質(zhì)，通過靜電作用可以使得帶有負(fù)電的GNPs發(fā)生聚集。由圖2可知，隨著LZM的添加，GNPs半徑逐漸增大，吸收峰由523 nm紅移到570 nm處；而單獨(dú)添加S.aureus并不能引起紫外吸收峰的紅移。當(dāng)體系同時(shí)存在LZM和S.aureus時(shí)，由于細(xì)菌對LZM的電荷的屏蔽，GNPs的吸收峰無明顯紅移。這一結(jié)果證明該競爭結(jié)合體系可用于革蘭氏陽性細(xì)菌檢測。

A-GNPs UV-Vis吸收光譜；B-不同LZM添加量下GNPs粒徑圖2 檢測體系可行性Fig.2 Feasibility of detection system

2.3 檢測條件優(yōu)化

對孵育時(shí)間、孵育pH、孵育溫度以及LZM添加量4個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。吸光度在前3 min內(nèi)快速變化并逐漸趨于平緩(圖3-A)，紫外吸收峰變化在pH為8.0的條件下最顯著(圖3-B)，孵育溫度對信號(hào)強(qiáng)度無明顯影響(圖3-C)。因此后續(xù)檢測條件設(shè)定為孵育時(shí)間15 min，體系pH=8.0，孵育溫度為常溫。

由于細(xì)菌所能結(jié)合的LZM數(shù)量有限，過多的LZM會(huì)導(dǎo)致體系檢測限過高。由圖3-D可知，LZM添加量為40 μL時(shí)吸收峰變化明顯且LZM添加量適中，因此后續(xù)UV-Vis光譜檢測中LZM的添加量設(shè)定為40 μL。DLS對GNPs的Rh變化表現(xiàn)出了更高的靈敏度，這一特點(diǎn)可以在產(chǎn)生足夠信號(hào)強(qiáng)度的同時(shí)減少LZM的添加量，因此DLS檢測中LZM的添加量設(shè)定為20 μL。

2.4 檢測體系選擇性

在真實(shí)環(huán)境中，革蘭氏陰性與陽性細(xì)菌可能同時(shí)存在，因此檢測體系需要在對目標(biāo)細(xì)菌有明顯響應(yīng)的同時(shí)實(shí)現(xiàn)對非目標(biāo)細(xì)菌盡可能小的響應(yīng)以實(shí)現(xiàn)選擇性檢測。2種檢測方式對革蘭氏陰性以及陽性細(xì)菌檢測的歸一化信號(hào)強(qiáng)度如圖4所示。相比于革蘭氏陰性菌，2種檢測方式均體現(xiàn)出對革蘭氏陽性菌良好的選擇性響應(yīng)，并且能抵抗體系中存在的蛋白質(zhì)干擾，實(shí)現(xiàn)革蘭氏陽性菌的廣譜檢測。

A-孵育時(shí)間;B-孵育pH;C-孵育溫度;D-不同LZM添加量下GNPs UV-Vis光譜;E-不同LZM添加量下GNPs Rh圖3 檢測條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of detect condition

2.5 GNPs-LZM競爭結(jié)合檢測體系標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

選取S.aureus用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過UV-Vis光譜進(jìn)行檢測的回歸方程為Y=0.69X-3.70，相關(guān)系數(shù)R2=0.993，定量限為1.26×107CFU/mL。通過DLS進(jìn)行檢測的回歸方程為Y=-2.28X+30.08，相關(guān)系數(shù)R2=0.954，定量限為6.87×105CFU/mL。

A-UV-Vis光譜檢測法選擇性，B-DLS檢測法選擇性圖4 兩種檢測方法的選擇性Fig.4 Selectivity of the two detections system

2.6 GNPs-LZM競爭結(jié)合檢測體系在真實(shí)樣品中的檢測

為評(píng)估該體系檢測真實(shí)樣品的可行性及靈敏度，選取S.aureus作為代表，通過1.2.3所述的檢測條件進(jìn)行檢測，即進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。其中1、3樣品的加標(biāo)細(xì)菌濃度為108CFU/mL，2、4樣品的加標(biāo)細(xì)菌濃度為107CFU/mL，1、2樣品通過DLS進(jìn)行檢測，3、4通過UV-Vis光譜檢測，檢測結(jié)果如表1所示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，2種檢測方法均能實(shí)現(xiàn)真實(shí)樣品中細(xì)菌的檢測，且DLS法體現(xiàn)出了更高的靈敏度。這一結(jié)果也證明了通過DLS進(jìn)行定量對實(shí)現(xiàn)更靈敏的檢測存在價(jià)值。相比于平板計(jì)數(shù)法24 h及以上的培養(yǎng)時(shí)間，該方法僅需15 min孵育時(shí)間，且單個(gè)樣品檢測可在30 min內(nèi)完成，能夠?qū)崿F(xiàn)革蘭氏陽性菌總數(shù)的快速檢測。

表1 GNPs-LZM競爭結(jié)合檢測體系在真實(shí)樣品中對S. aureus的檢測Table 1 S. aureus detection in real sample

注：-表示通過該方法未檢出

3 結(jié)論

本研究通過LZM對革蘭氏陽性菌和GNPs的競爭結(jié)合建立了革蘭氏陽性菌的廣譜檢測方法。通過UV-Vis光譜優(yōu)化了孵育時(shí)間、孵育pH以及孵育溫度，并分別通過UV-Vis光譜以及DLS兩種方法實(shí)現(xiàn)革蘭氏陽性菌的定量檢測。相比紫外光譜檢測的定量限(1.26×107CFU/mL)，DLS體現(xiàn)出對GNPs尺寸變化更高的敏感性，并實(shí)現(xiàn)定量限一個(gè)數(shù)量級(jí)的降低(6.87×105CFU/mL)。與革蘭氏陰性菌相比，2種檢測方式對革蘭氏陽性菌均體現(xiàn)出良好的選擇性響應(yīng)，并能用于真實(shí)體系的檢測。相比于紫外光譜，DLS對粒子尺寸變化體現(xiàn)出了更高的敏感性，這一策略有助于提高比色法檢測的靈敏度。此外，細(xì)菌總數(shù)是反映食品新鮮程度的指標(biāo)之一，該方法可實(shí)現(xiàn)革蘭氏陽性菌的定量檢測，對食品安全有一定意義。