王強(qiáng)，謝躍杰，李園園，魏華恒，賀稚非，李洪軍*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶,400715)2(重慶第二師范學(xué)院,脂質(zhì)資源與兒童日化品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶,400067)

脂肪酸在甘油骨架上的位置分布是影響脂類物理行為和代謝的主要原因之一[1]。通常情況下，脂肪酸只有在消化甘油三酯后以非酯化的游離脂肪酸或2-MAG的形式才能被吸收，如果將生物活性功能更高的脂肪酸接入至甘油三酯的sn-2位則有利于此類脂肪酸對(duì)健康發(fā)揮更大的作用[2]。DHA等n-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(n-3 LC-PUFA)已被廣泛用作液體和固體強(qiáng)化食品(如嬰兒配方奶粉等)中的重要功能性成分，其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)以及心血管預(yù)防等方便具有廣泛的功能作用。有研究表明[3-4]，富含n-3 LC-PUFA的2-MAG易被吸收，當(dāng)PUFA位于sn-2位置時(shí)，其吸收效果要優(yōu)于位于sn-1,3位置或隨機(jī)分布狀態(tài)。因此，如何將n-3 LC-PUFA接入甘三酯的sn-2位就成為能夠提高n-3 L-CPUFA穩(wěn)定性及腸道消化吸收的最佳方案。

現(xiàn)有化學(xué)法合成2-MAG需要較高的溫度和較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間，高溫會(huì)促使2-MAG發(fā)生?；w移并誘發(fā)n-3 LC-PUFA的氧化，所以富含DHA的2-MAG需要更溫和的反應(yīng)方式及條件。由于酶促反應(yīng)是在溫和的條件下進(jìn)行的，減少了對(duì)溫度敏感的底物和產(chǎn)品原有性能的損失[5]，因此酶法制備對(duì)2-二十二碳六烯基單甘脂(2D-MAG)具有積極作用。由于商業(yè)化的脂肪酶要么是sn-1,3特異性的，要么是非特異性的，因此只有通過對(duì)甘油三酯的特異性酶催化醇解反應(yīng)才能制備出產(chǎn)率高、副產(chǎn)物少的2-MAG[6]。

魚油和藻油均是DHA目前主要的來源途徑，由于魚油脂肪酸組成復(fù)雜，除了DHA以外其EPA的含量也較高，這增加了魚油單體PUFA組成及濃度測(cè)定的難度。相比之下，藻油中含有豐富的DHA(EPA含量較低)，且藻油在工業(yè)規(guī)模上很容易培養(yǎng)，是結(jié)構(gòu)脂理想的高度純DHA供給體。本研究以藻油為原料，擬通過乙醇分解法合成2D-MAG并用溶劑萃取法進(jìn)行純化富集，通過脂肪酶種類(Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM、Novozym 435、Lipase AK、Lipase AY 和Newlase F)、藻油與乙醇的底物摩爾比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和脂肪酶重復(fù)利用次數(shù)等影響條件研究2D-MAG酶法合成的最佳制備方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藻油，青島科源海洋生物有限公司Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM、Novozym 435、Lipase AK、Lipase AY、Newlase F，諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司;脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純，37種)、二油酸甘二脂、2-油酰甘一酯、1-油酰甘一酯,Sigma(上海)公司;正己烷、異丙醇、無水乙醇、乙腈均為色譜純，上海阿拉丁生化科技公司；其余試劑均為分析純。

7890A氣相色譜儀，安捷倫科技(上海)有限公司；S25磁力攪拌器，德國(guó)IKA；TG1650-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器公司；R-1002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長(zhǎng)城儀器有限公司；AR1140電子分析天平，美國(guó)奧豪斯貿(mào)易公司；DSY-III氮吹儀，金科精華苑科技有限公司；DHG-9202-2SA恒溫烘箱，常州一諾儀器制造有限公司；UPLC LC-30A超高效液相色譜儀，日本Shimadzu儀器有限公司；AVANCE 500MHz核磁共振譜儀，瑞士Bruker儀器有限公司

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單甘脂的酶法制備

單甘脂的制備方法按照MUNIO等[7]方法并做適當(dāng)?shù)男薷模悍Q取0.9 g海藻油和適量無水乙醇加入至50 mL具塞錐形瓶中，加入0.4 g的固定化脂肪酶(4%～16%，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù))，在轉(zhuǎn)速為200 r/min、30～55 ℃反應(yīng)條件下進(jìn)行磁力攪拌4～16 h。將反應(yīng)混合物離心后過濾除去脂肪酶。取一定量離心樣品，加入30 mL正己烷和10 mL 0.8 mol/L的KOH醇溶液(30%乙醇)，劇烈振蕩2 min后靜置5 min。下層醇-水溶液中加入15 mL正己烷進(jìn)行二次提取，劇烈振蕩2 min后靜置分層。形成兩層后收集富含2D-MAG的乙醇相，以相同體積的正己烷洗滌2次。合并2次萃取所得上清液，在40 ℃水浴溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，所得樣品稱質(zhì)量后置于-20 ℃冰箱保存用于后續(xù)分析。另外收集固定化酶，用無水乙醇/正己烷(體積比1∶1)洗滌3次后，對(duì)回收的固定化酶進(jìn)行真空處理，去除有機(jī)溶劑稱重后計(jì)算得率。用相同流程分別考察反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)摩爾比、脂肪酶負(fù)載、反應(yīng)溫度等參數(shù)下2D-MAG的得率。

1.2.3 單甘脂的TLC分析

參考TURON等[8]方法用薄層色譜 (TLC)分析反應(yīng)產(chǎn)物脂肪酸乙酯(fatty acid ethyl esters, FAEEs),甘油三酯(triacylglycerols，TAGs), 游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FAs), 甘油二酯(diacylglycerols, DAGs),甘油一酯(monoacylglycerols，MAGs)：薄層色譜硅膠板預(yù)先在105 ℃烘箱中預(yù)先活化1 h。用200 μL正己烷-二乙醚溶液(體積比84∶16)稀釋10 μL反應(yīng)樣品，用毛細(xì)管將1 μL樣品點(diǎn)在活化后的薄層板上，置于爐溫為120 ℃烘箱中5 min以揮發(fā)溶劑。將V(正己烷)∶V(二乙醚)∶V(甲酸)=84∶16∶0.04混合溶液噴涂在薄層板上展開，用碘蒸氣顯色，根據(jù)各反應(yīng)物的條帶和比移值確定油脂類型。用5%硼酸-甲醇溶液浸潤(rùn)薄層色譜板以防止2-MAG和1-MAG由于酰基遷移形成的異構(gòu)化。將目標(biāo)條帶刮下用氣相色譜法分析2D-MAG脂肪酸組成。

1.2.4 UPLC-MS/MS分析單甘脂組成

用超高效液相色譜—三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的組成進(jìn)行分析。將2 μL樣品注入至超高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)。在分析過程中，流速保持在0.4 mL/min；柱溫60 ℃；樣品室溫度4 ℃。流動(dòng)相A：V(水)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1∶1(含5 mmol/L NH4Ac)；流動(dòng)相B：V(異丙醇)∶V(乙腈)=5∶1。梯度洗脫條件： 0.5 min，20% B相；1.5 min，40% B相；3 min，60% B相；13 min，98% B相； 13.1 min，20% B相；17 min，20% B相。

質(zhì)譜條件：AB Sciex Triple TOF 6600，離子化方式：電噴霧離子化源，檢測(cè)方式正離子檢測(cè)；一級(jí)質(zhì)譜采集的質(zhì)量數(shù)范圍為m/z50～1 200，質(zhì)譜條件如下：氣簾氣壓力0.24 MPa；離子源氣體1(N2)壓力為0.34 MPa；離子源氣體2(N2)壓力為0.34 MPa；離子噴霧電壓5.5 kV；噴霧器溫度 600 ℃。

1.2.5 GC-FID法測(cè)定單甘脂脂肪酸組成

脂肪酸甲酯化采用WANG等[9]方法進(jìn)行分析：用2 mL 0.5 mol/L NaOH-CH3OH與3 g樣品在60 ℃下皂化30 min，并在60 ℃下與14%三氟化硼反應(yīng)5 min。反應(yīng)完成后，用約2 mL己烷萃取脂肪酸甲酯，然后計(jì)算所得的MAGsn-2位置上脂肪酸組成的摩爾百分比。

氣相色譜條件：色譜柱為FFAP 毛細(xì)管柱(Agilent，30 mm×0.25 mm×0.5 μm); 檢測(cè)器為FID。載氣為N2，流速設(shè)定為1.0 mL/min，進(jìn)樣口壓力為0.24 MPa，分流比設(shè)定為30∶1。初始爐溫設(shè)置為140 ℃保持1 min，然后以10 ℃/min的速度增加到230 ℃并保持8 min。檢測(cè)器的溫度保持在280 ℃。根據(jù)脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)分析，峰值時(shí)間和相對(duì)峰面積將用于脂肪酸甲酯的定量和定性分析。

1.2.6 單甘脂的純化

在ESTEBAN等[10]提出的優(yōu)化方法基礎(chǔ)上，采用溶劑萃取法對(duì)2-MAG進(jìn)行純化。將1 g無溶劑產(chǎn)物溶解于15 mL正己烷中，然后加入10 mL 85%乙醇水溶液，將混合溶液轉(zhuǎn)移到分離漏斗中靜置分層。形成兩層后，去除含有酯類和未反應(yīng)甘油三酯殘基上層，保留含2D-MAG的萃取層。將下層有機(jī)相在40 ℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干其他有機(jī)相，然后將樣品加入至V(乙醇)∶V(正己烷)=90∶10溶液中以3 500 r/min的速度離心5 min，吸取上層2D-MAG的己烷相，置于-18 ℃冰箱中用于后續(xù)的定性定量分析及酯化反應(yīng)。

1.2.7 單甘脂的定量分析[11]

加入2-油酸單甘脂作為外標(biāo)，根據(jù)其出峰面積對(duì)目標(biāo)單甘脂峰面積進(jìn)行比較，含量計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：WS，2D-MAG百分含量，Ri，外標(biāo)物峰面積：P標(biāo)，標(biāo)樣質(zhì)量濃度，mg/mL；AS，樣品中2-MAG峰面積；A標(biāo)，外標(biāo)物2-油酸單甘脂峰面積；MS，樣品質(zhì)量，mg。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有試驗(yàn)均使用現(xiàn)制備的樣品、重復(fù)進(jìn)行3次。采用SPSS 17數(shù)據(jù)處理軟件，各組數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±SD(n=3)表示，并進(jìn)行方差分析，LSD法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻油總脂肪酸及sn-2位脂肪酸組成分析

通過對(duì)藻油脂肪酸組成(表1)進(jìn)行分析可知，C22∶6(44.37%)和C16∶0(27.5%)是藻油主要的脂肪酸成分，除此以外，C22∶5、C14∶0和C18∶1含量也較多，分別達(dá)到7.42%，6.21%和5.37%。在藻油總脂肪酸中，多不飽和脂肪酸大多數(shù)是具有生理活性的n-3 PUFA，其含量約占藻油PUFA含量的85.38%。在藻油甘油三酯的sn-2位置上DHA含量最高(47.38%)，其次是C16∶0(18.85%)和C22∶5(11.34%)。PUFA在藻油sn-2位的比例高達(dá)64.29%，這表明藻油是sn-2長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)脂較為理想的制備原料。目前，已有多個(gè)商品化的DHA藻油上市，其中主要以裂壺藻和吳肯氏藻種類居多，本實(shí)驗(yàn)選用的吳肯氏藻油通常被用于DHA的供體來源，盡管不同藻類脂肪酸組成有所差異，但大多數(shù)藻油的DHA含量均較其他來源高，是僅次于魚油提供豐富DHA的理想來源[12]。

2.2 單甘脂合成脂肪酶的篩選

與化學(xué)法制備2-MAG相比，脂肪酶催化具有位置專一、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物不殘留有機(jī)溶劑等優(yōu)勢(shì)，更適宜于長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸單甘脂的制備。由于脂肪酶的來源不同，其穩(wěn)定性、催化活性和底物專一性也有較大的差異。為了篩選出最適宜催化2D-MAG的特異性脂肪酶，本研究對(duì)分別來自于南極假絲酵母(Candidaantarctica)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosa)、雪白根霉(Rhizopusniveus)、皺褶假絲酵母(Candidarugosa)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)的6種不同商業(yè)脂肪酶Novozym 435、Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM、Newlase F、Lipase AY和Lipase AK進(jìn)行篩選和測(cè)試。

表1 藻油總脂肪酸及sn-2位脂肪酸含量Table 1 The composition and positional of fatty acid of algae oil

注：NF表示未檢出

由圖1可知，在酶催化藻油的醇解反應(yīng)中，不同酶催化2D-MAG含量具有較大差異。6種脂肪酶催化生成2D-MAG的活性由高到低依次為：Lipozyme RM IM >Novozym 435 >Lipozyme TL IM >Newlase F > Lipase AK > Lipase AY。其中，Lipozyme RM IM 和Novozym 435催化形成2D-MAG的含量相對(duì)較高，分別為34.7%和28.1%，這反映出Lipozyme RM IM較其他脂肪酶的催化能力更強(qiáng)。Lipozyme TL IM及Lipase AK和Newlase F催化藻油形成2D-MAG的含量分別為13.3%, 9.6%和11.3%，顯著低于Lipozyme RM IM 和Novozym 435(P<0.05)。有研究[13]發(fā)現(xiàn)Novozym 435在過量乙醇溶液中能夠有效提高其對(duì)結(jié)構(gòu)脂的催化能力。但是對(duì)于Lipozyme RM IM而言，適當(dāng)?shù)乃軌蚓S持其催化活性，過量的乙醇反而會(huì)奪取Lipozyme RM IM活性位點(diǎn)周圍的水分子從而導(dǎo)致其催化能力下降[14]，這表明脂肪酶在不同反應(yīng)溶劑體系中的催化能力是有差異的。由于脂肪酶具有蛋白結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)在乙醇存在的環(huán)境中發(fā)生變性的閾值會(huì)受到環(huán)境因素的改變而存在差異，這或許是解釋為何同樣是特異性脂肪酶，但其催化能力在不同含水環(huán)境中有明顯不同的主要原因。

圖1 不同種類脂肪酶對(duì)藻油2D-MAG含量的影響Fig.1 The effect of different lipases on the production of 2D-MAG注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)

甘油三酯上sn-2?；恢镁哂休^大的空間位阻，sn-2位置較sn-1,3更難以?；Ｒ虼?，具有相同特異性脂肪酶的催化效果受空間位阻及脂肪酸結(jié)構(gòu)的影響較大。與脂肪酶Novozym 435和LipozymeTL IM相比，Lipozyme RM IM是具有特異性的固定化商業(yè)化脂肪酶，能區(qū)域和立體選擇性催化甘油三酯sn-1,3位發(fā)生水解、酯化和酯交換反應(yīng)，價(jià)格更低且催化2D-MAG能力較好，故本實(shí)驗(yàn)采用Lipozyme RM IM制備2D-MAG。

2.3 單甘脂的合成及純化

薄層色譜(TLC)是一種簡(jiǎn)單的反應(yīng)產(chǎn)物定性方法，它能夠利用各組分在固定相分離差異的不同簡(jiǎn)單、快速的對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定性。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)藻油、2D-MAG及純化后2D-MAG進(jìn)行了TLC分析。根據(jù)薄層色譜中斑點(diǎn)的比移值(Rf)對(duì)各組分進(jìn)行了初步判斷(圖2)，結(jié)果顯示藻油中分別含有單甘脂(Rf≈0.05)、游離脂肪酸(Rf≈0.1～0.4)、甘油二酯(Rf=0.48)和甘油三酯(Rf≈0.70)。通過酶法催化藻油與乙醇反應(yīng)得到的2D-MAG在TLC板中僅出現(xiàn)1個(gè)斑點(diǎn)(Rf≈0.06)，初步斷定實(shí)驗(yàn)制備的最終產(chǎn)物中單甘脂含量較多。由于產(chǎn)物未經(jīng)純化，因此TLC的斑點(diǎn)有拖尾現(xiàn)象。通過對(duì)2D-MAG進(jìn)一步萃取純化后，2D-MAG的斑點(diǎn)拖尾現(xiàn)象消失且斑點(diǎn)更加集中，表明本實(shí)驗(yàn)用Lipozyme RM IM催化藻油醇解形成了單甘脂，且純化方法提高了單甘脂的純度，但單甘脂的組成及類型還有待于用其他手段加以表征。

圖2 不同種類結(jié)構(gòu)脂薄層色譜圖Fig.2 The TLC of different structural lipids

2.4 單甘脂的定性定量分析

圖3顯示的是2D-MAG樣品在純化前和純化后的HPLC結(jié)果。2D-MAG分別在4.9 min和5.5 min有最大樣品峰出現(xiàn)，表明同時(shí)存在2種單甘脂或分子內(nèi)發(fā)生了?；D(zhuǎn)移現(xiàn)象。一般條件下單甘酯是1-MAG和2-MAG的混合物，這是由于分子內(nèi)?；D(zhuǎn)移的活化能比較低[15-16]。經(jīng)過純化處理后，2D-MAG僅在5.5 min處有最大樣品峰且未見4.9 min的樣品峰，這表明本研究采用的溶劑萃取法能夠在低溫條件下結(jié)晶分離得到純度為88.5%的2D-MAG，通過結(jié)構(gòu)脂的TLC和HPLC均證明了該制備方法和純化方法是可靠有效的。

圖3 純化前后樣品中2D-MAG液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of 2D-MAG in crude reaction mixture and after purification.

圖4 純化后樣品中2D-MAG的13C NMR譜圖Fig.4 13C NMR spectrum of synthetic 2D-MAG after purification.

通過對(duì)13C的譜圖(圖4)分析不難看出，NMR的結(jié)果為13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 14.4, 20.68,22.74, 25.66, 25.71, 25.76, 33.99, 34.12, 62.29, 69.15, 77.23, 77.48, 127.14, 127.76, 127.98, 128.09, 128.18, 128.35, 128.37, 128.43, 128.66, 129.58, 129.6, 132.1, 172.55，其中，飽和碳的化學(xué)位移在核磁圖譜中的高場(chǎng)區(qū)域，在14.4～77.48 ppm，其中連接羥基的碳的化學(xué)位移在77.23 ppm與77.48 ppm處。烯基碳的化學(xué)位移在127.14～132.1 ppm，羰基碳的化學(xué)位移在核磁圖譜的低場(chǎng)區(qū)，其化學(xué)位移為172.55 ppm。根據(jù)13C NMR結(jié)果可證實(shí)2D-MAG的結(jié)構(gòu)符合預(yù)期。

2.5 反應(yīng)底物摩爾比對(duì)單甘脂合成產(chǎn)物的影響

在酶法催化合成2D-MAG反應(yīng)過程中，底物物質(zhì)的摩爾比(藻油與乙醇, 摩爾比)、加酶量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度均會(huì)影響反應(yīng)進(jìn)程及產(chǎn)物得率。在脂肪酶催化甘三酯醇解反應(yīng)中，反應(yīng)達(dá)到平衡后產(chǎn)物的組成與底物物質(zhì)的摩爾比有密切關(guān)系。由圖5可知，隨著底物中藻油與乙醇摩爾比的升高，2D-MAG 的生成率顯著增加(P<0.05)，當(dāng)藻油與乙醇摩爾比為1∶80時(shí)2D-MAG的生成比例為37.2%，均高于其他實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。理論上講，生成1 mol 2D-MAG需要1 mol甘油三酯和2 mol乙醇，但實(shí)際上當(dāng)藻油與乙醇摩爾比為1∶2時(shí)2D-MAG的生成量?jī)H為4.4%。IRIMESCU等[17]和ZHANG等[18]均發(fā)現(xiàn)在較低藻油乙醇比例時(shí)，無論是1-MAG或是2-MAG得率均較低，這被推測(cè)是由于大部分甘油完全脫酰并轉(zhuǎn)化為乙酯(EEs)和甘油。隨著底物物質(zhì)摩爾比的升高，1,2-DAG的生成量顯著提高，當(dāng)藻油與乙醇摩爾比為1∶40時(shí)，1,2-DAG的生成量開始下降至12%。IRIMESCU等[17]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度或溶劑發(fā)生較大改變時(shí)，1,2-DAG、1,3-DAG與2-MAG之間存在酰基轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，且這種現(xiàn)象與不飽和脂肪酸?；忻黠@的相關(guān)性[17]。與1,2-DAG相比1,3-DAG穩(wěn)定性較差，容易受到外界條件的改變呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。由圖5可以看出，1,3-DAG含量在藻油與乙醇摩爾比為1∶2時(shí)最高(14%)，隨著底物摩爾比升高其含量快速下降，潛在的原因在于當(dāng)?shù)孜餄舛炔辉偈敲复呋钸m比例時(shí)，Lipozyme RM IM可特異性催化1,3-DAG的sn-1,3位?；鶎?dǎo)致其含量下降，TAGs比例隨底物摩爾比的變化趨勢(shì)也能夠印證這一推測(cè)。

圖5 底物比率(藻油與乙醇摩爾比)對(duì)2D-MAG合成率的影響Fig.5 Effect of substrate molar ratio of algal oil to ethanol on 2D-MAG.注：反應(yīng)條件為溫度35℃，Lipozyme RM IM酶量10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，轉(zhuǎn)速200 r/min，時(shí)間4 h

有證據(jù)表明，在乙醇分解反應(yīng)中水含量的降低會(huì)避免結(jié)構(gòu)脂發(fā)生酰基遷移[19]。ZHANG等[20]研究表明，與96%的乙醇相比無水乙醇會(huì)顯著提高對(duì)TAG的酯化程度，且生成2-MAG和FFAs的比例較高，這表明無水乙醇可以避免?；倪w移，有利于2-MAG的催化合成。在催化反應(yīng)中，Lipozyme RM IM由于乙醇溶劑相對(duì)含量的增加，反應(yīng)產(chǎn)物2D-MAG不但沒有降低，反而有所提高。這一結(jié)果也表明Lipozyme RM IM與Novozym 435一樣具有在過量乙醇存在的環(huán)境中保持對(duì)結(jié)構(gòu)脂的較高催化能力。本研究推測(cè)，當(dāng)存在有高含量的游離脂肪酸時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的羧酸基團(tuán)，此類基團(tuán)會(huì)從脂肪酶表面奪取部分必需水，從而間接提高了醇的相對(duì)含量進(jìn)而提高反應(yīng)效率[21]。然而，從經(jīng)濟(jì)效益等方面考慮，較高的底物比率不僅會(huì)增加整個(gè)反應(yīng)的生產(chǎn)成本，而且會(huì)為后續(xù)產(chǎn)物純化及副產(chǎn)物分離帶來影響。因此，選擇藻油與乙醇摩爾比為1∶40較為經(jīng)濟(jì)環(huán)保。

2.6 反應(yīng)溫度對(duì)單甘脂合成產(chǎn)物的影響

2-MAG的生成是酶催化反應(yīng)的結(jié)果，如果反應(yīng)過程溫度適中，將有利于脂肪酶發(fā)揮最大活性。一般而言，反應(yīng)溫度的升高會(huì)加快反應(yīng)速度，縮短反應(yīng)時(shí)間，但過高的溫度則會(huì)降低脂肪酶活性和反應(yīng)物的穩(wěn)定性。由圖6可知，2D-MAG的合成率變化分為2個(gè)階段，當(dāng)反應(yīng)溫度從30 ℃升高至35 ℃時(shí)，DHA-2-MAG合成率由33.5增加至35.8%，當(dāng)反應(yīng)體系繼續(xù)由35 ℃升溫至55 ℃后，合成率則出現(xiàn)下降趨勢(shì)。這表明35 ℃是Lipozyme RM IM酶催化合成2D-MAG的最適溫度，該溫度下2D-MAG的得率最高。但是，Lipozyme RM IM酶催化溫度范圍較大，2D-MAG合成率的降低并不是完全由于溫度過高而誘發(fā)蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致酶失活引起的。ZHANG等[18]研究顯示，隨著溫度的升高，反應(yīng)中2-MAG的含量降低而1-MAG的含量有所增加，說明反應(yīng)溫度升高會(huì)導(dǎo)致2-MAG發(fā)生?；w移。對(duì)照本實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)物乙酯(EEs)含量來看，當(dāng)溫度高于35 ℃后，EEs由41.5%升高至49.1%(P<0.05)，說明在此過程中形成的1-MAG發(fā)生了脫酰作用并轉(zhuǎn)化為EEs。鑒于DHA具有較多的不飽和雙鍵，極易受熱氧化，對(duì)2D-MAG的合成需要在相對(duì)較低的溫度條件下完成，因此35 ℃是合成2D-MAG較為理想的溫度水平。

圖6 反應(yīng)溫度對(duì)2D-MAG合成的影響Fig.6 Effect of reaction temperature on synthesis of 2D-MAG.

2.7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)單甘脂合成產(chǎn)物的影響

大多數(shù)酶的最適溫度不是完全固定的，它與作用時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)酶的最適溫度會(huì)向反應(yīng)所需溫度數(shù)值較低的方向移動(dòng)。由圖7可知，隨著反應(yīng)的持續(xù)TAG由最高值91.3%逐漸降低至2.5 h后的3.4%(P<0.05)，這表明酶催化反應(yīng)在0～3 h內(nèi)反應(yīng)速率較高。在此期間，2D-MAG和1,2-DAG逐漸升高，其中2D-MAG在第3 h后達(dá)到最高值41.2%(P<0.05)，表明TAG醇解反應(yīng)速度在0～3 h較快，隨著反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行2D-MAG含量開始下降，6 h后降至19%(P<0.05)。結(jié)構(gòu)脂酯化反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)，在反應(yīng)開始時(shí)反應(yīng)物濃度較高會(huì)促使正反應(yīng)速度加快，2D-MAG合成率大幅度提高。當(dāng)反應(yīng)到達(dá)一定階段(3 h)后，隨著產(chǎn)物2D-MAG濃度的增加，正反應(yīng)速度逐漸減小而逆反應(yīng)速度逐漸增大。與此同時(shí)，乙酯(EEs)的含量隨反應(yīng)時(shí)間持續(xù)不斷增加，最終在6 h后達(dá)到81.3%。有研究顯示[22]，乙酯的存在會(huì)抑制脂酶的活性從而降低水解率。過長(zhǎng)的醇解反應(yīng)時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致大量的游離脂肪酸生成，甚至sn-2位的?；D(zhuǎn)移生成1-MAG/1,3-DAG之后，被進(jìn)一步醇解生成甘油和EEs[18]。綜合反應(yīng)時(shí)間及合成產(chǎn)物積累的因素，反應(yīng)時(shí)間為3 h時(shí)酯化反應(yīng)效率最高。

圖7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)2D-MAG合成的影響Fig.7 Effect of reaction time on synthesis of 2D-MAG.

2.8 酶添加量對(duì)單甘脂合成產(chǎn)物的影響

一般情況下，酶作為合成反應(yīng)催化劑，與反應(yīng)速率及產(chǎn)物生成量呈正相關(guān)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)考察了添加4%～16% Lipozyme RM IM酶對(duì)DHA-2-MAG合成率的影響。由圖8可知，當(dāng)Lipozyme RM IM含量從4%增加至10%后，DHA-2-MAG生成量從22.4%增加至39.1%(P<0.05)，這表明加酶量對(duì)酶解效果有顯著的影響，此時(shí)酯化反應(yīng)主要表現(xiàn)為酶控制反應(yīng)。當(dāng)加酶量超過10%后，2D-MAG生成量由39.1%逐漸下降至33.5%(P<0.05)，說明酶量的增加并沒有進(jìn)一步提高產(chǎn)物的生成率，此時(shí)表現(xiàn)為底物控制反應(yīng)。酶量的增加只會(huì)加快反應(yīng)速度，而醇解反應(yīng)是復(fù)雜的可逆反應(yīng)，酯合成反應(yīng)加快的同時(shí)，油脂副水解反應(yīng)也相應(yīng)加速，由于酶隨著催化作用的增強(qiáng)，相互水解作用會(huì)逐步減少酶對(duì)底物的酶解[21]。此外，同一種脂肪酶在不同的溶劑介質(zhì)中其位置選擇性和催化活性也有較大差別，這種差別通常與溶劑的性質(zhì)有關(guān)[23]。MUNIO等[7]研究發(fā)現(xiàn)Novozym 435在過量乙醇與無乙醇條件下對(duì)TAG的sn-1,3特異性有明顯不同。當(dāng)反應(yīng)中有水存在時(shí)，水環(huán)境也會(huì)限制酶的整體構(gòu)象移動(dòng)從而抑制酶的活性[21]。鑒于酶的催化效果及經(jīng)濟(jì)成本，添加10%的Lipozyme RM IM更為有效和合理。

圖8 酶添加量對(duì)2D-MAG合成的影響Fig.8 Effect of enzyme amount on synthesis of 2D-MAG

2.9 脂肪酶重復(fù)利用率評(píng)價(jià)

酶的重復(fù)利用率是評(píng)價(jià)酶在催化反應(yīng)中的適用性及功能效價(jià)的重要指標(biāo)。為了評(píng)價(jià)Lipozyme RM IM脂肪酶在催化合成2D-MAG的效價(jià)能力，本研究在完成催化反應(yīng)后，過濾及回收Lipozyme RM IM脂肪酶并測(cè)試重復(fù)利用率。圖9可知，酶的回收率隨使用次數(shù)的增加呈總體下降趨勢(shì)，回收第10次時(shí)，Lipozyme RM IM脂肪酶回收率下降至起始值的35.6%，平均單次酶損耗率大約在3.6%，結(jié)果表明在2D-MAG合成過程中，Lipozyme RM IM有效載荷為3%～4%。由于酶在催化反應(yīng)過程中由于與底物接觸面大小有差異，因此并非全部酶參與了酶反應(yīng)，尚不清楚酶添加量促進(jìn)產(chǎn)物合成率與酶損耗率降低之間的內(nèi)在聯(lián)系。Lipozyme RM IM脂肪酶在重復(fù)第5次時(shí)，2D-MAG的含量從40.1%降至36.5%，沒有發(fā)生顯著的下降，這表明Lipozyme RM IM脂肪酶具有良好的穩(wěn)定性，但是重復(fù)使用第6次后，2D-MAG的含量下降趨勢(shì)較前5次明顯(P<0.05)，表明盡管Lipozyme RM IM脂肪酶總體催化較穩(wěn)定，但隨著反復(fù)利用次數(shù)的增加，其催化活性在后期有顯著弱化現(xiàn)象。ZHANG等[18]報(bào)道了Lipozyme 435在酶促醇解反應(yīng)中重復(fù)利用了7次后仍然能夠發(fā)揮酶的活性。但也有研究發(fā)現(xiàn)Lipozyme TL IM在乙醇介質(zhì)中進(jìn)行乙醇分解反應(yīng)可以得到14.70%的2-MAG，但其TL IM在乙醇介質(zhì)中催化期間攪拌對(duì)酶顆粒結(jié)構(gòu)具有破壞作用，致使脂肪酶無法回收。基于此，在酶促反應(yīng)中固定脂肪酶對(duì)脂肪酶的重復(fù)利用效果有積極作用。

圖9 Lipozyme RM IM酶重復(fù)利用率Fig.9 Reusability of the Lipozyme RM IM

3 結(jié)論

本研究以海藻油為原料分別對(duì)2D-MAG的酶法制備方法進(jìn)行了探索，篩選出了合適的脂肪酶，并考察了脂肪酶種類、海藻油與乙醇的底物摩爾比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和脂肪酶重復(fù)利用次數(shù)對(duì)2D-MAG合成產(chǎn)物的影響。結(jié)果表明含量為46.37%的DHA和31.5%的C16∶0是藻油主要的脂肪酸成分。藻油是合成n-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)脂2D-MAG較為理想的原料。與固定化生物催化酶Novozym 435和Lipozyme TL IM相比，Lipozyme RM IM價(jià)格更低且催化2D-MAG能力最強(qiáng)。此外，當(dāng)藻油/乙醇底物摩爾比為1∶40、酶添加量為10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，反應(yīng)時(shí)間為3 h、反應(yīng)溫度為35℃條件下利用Lipozyme RM IM催化藻油醇解更有利于2D-MAG合成產(chǎn)物的積累。