毛職醫(yī)，談新苑，曹蓉，張曉娟，付靜，徐建國,，徐國強*，張曉梅，許正宏

1(江南大學 生物工程學院,工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學,糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學 藥學院，江蘇 無錫，214122)4(無錫福祈制藥有限公司，江蘇 無錫，214100)

S-腺苷蛋氨酸(S-adenosylemthionine，SAM)廣泛存在于各種生物體內(nèi)，是一種重要的代謝中間體，參與多種類型的生化反應[1]，在細胞的甲基化、硫基化以及多胺的合成中起著重要作用[2-3]。自1953年，意大利CATINO等科學家首次發(fā)現(xiàn)后[4]，腺苷蛋氨酸被廣泛地用于臨床急、慢性肝病[5-6]、精神抑郁[7]、膽汁郁結(jié)以及骨關(guān)節(jié)炎[8]等疾病的治療，近幾年來還被用來生產(chǎn)具有延緩衰老功能的化妝品[9]。生物發(fā)酵法是目前生產(chǎn)SAM的主要方法，大腸桿菌(Escherichiacoli)、畢赤酵母(Pichiapastoris)[10]、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)[11]都能夠進行發(fā)酵生產(chǎn)，其中王杰鵬團隊通過釀酒酵母SAM0801進行高密度發(fā)酵，產(chǎn)量達14.48 g/L，是國內(nèi)目前報到的最高產(chǎn)量[12]。但由發(fā)酵生產(chǎn)得到的SAM純化分離困難，下游成本較高，因此酶促轉(zhuǎn)化法成了工業(yè)生產(chǎn)SAM的研究熱點。

酶促轉(zhuǎn)化法是腺苷蛋氨酸合酶直接催化底物L-蛋氨酸和ATP合成SAM[13]。由于該合酶在野生型菌株中活力通常較低，采用外源基因表達潛在具有工業(yè)化的方法。表達體系可以選擇大腸桿菌[14]、酵母[15]、桿狀病毒和哺乳動物細胞，其中大腸桿菌表達體系具有培養(yǎng)條件簡單、生長速率較快、發(fā)酵性能穩(wěn)定、基因操作成熟等優(yōu)點而備受關(guān)注，且來自大腸桿菌來源的腺苷蛋氨酸酶編碼基因metK是目前選擇較多基因[16-17]。由于酵母是微生物催化生產(chǎn)SAM的產(chǎn)量最高的微生物，采用酵母來源的腺苷蛋氨酸合酶可能具有更大的潛力。釀酒酵母中存在2個同源基因sam1和sam2，其中sam2所編碼的SAM合酶對底物L-蛋氨酸的耐受性較好[17]，因而本研究經(jīng)虛擬篩選，選擇sam2作為目的基因，重點研究其在大腸桿菌體系中的表達情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質(zhì)粒與菌株

菌株E.coliJM109、E.coliBL21(DE)、E.coliRosetta(DE)、表達質(zhì)粒pET-28a(+)、表達質(zhì)粒pET-3b(+)，均由實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑

質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，上海捷瑞公司；分子操作涉及的工具酶、DNA marker，Takara；葡萄糖、瓊脂粉、NaCl等培養(yǎng)基配方試劑，國藥試劑有限公司；腺苷蛋氨酸標品，索萊寶公司；L-蛋氨酸、ATP、硫酸卡那霉素，生物工程有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

SOC培養(yǎng)基需在115 ℃條件下高溫滅菌20 min，其余需在121℃條件下高溫滅菌20 min。各培養(yǎng)基配方如表1所示。

表1 各種培養(yǎng)基配方Table 1 Various media formulations

注：-表示培養(yǎng)基中不添加該物質(zhì)

1.2 實驗方法

1.2.1 腺苷蛋氨酸合酶基因的合成

以NCBI數(shù)據(jù)庫報道的來源于釀酒酵母BY4741的腺苷蛋氨酸合酶基因sam2(登錄號NC-001136.10)為模板，根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性進行密碼子優(yōu)化，由上海生物工程有限公司進行合成。

1.2.2 目的基因sam2的克隆

基因擴增引物如下：

S1-F：5′-CGGGATCCATGTCCAAGAGCAAAAC-TTTCT-3′；

S2-R：5′-GCTCTAGATTAAAATTCCAATTTCTT-TGGTTT-3′；

引物由上海金唯智公司合成。以合成的基因為模板，以S1，S2為引物進行PCR擴增，反應體系為S1、S2各1 μL，合成基因1 μL，2×PrimeStar 25 μL、ddH2O 22 μL。反應條件為預變性95 ℃，3 min；變性95 ℃，30 s；退火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，1 min，35個循環(huán)，72 ℃，5 min。PCR反應結(jié)束后，將產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，利用膠回收試劑盒進行產(chǎn)物回收純化。

1.2.3 重組菌株的構(gòu)建

將大腸表達質(zhì)粒pET-3b(+)和擴增的目的片段分別用限制性內(nèi)切酶NdeI和XbaI進行酶切處理，純化回收后利用T4 ligase于16 ℃進行過夜連接。將連接產(chǎn)物化轉(zhuǎn)E.coliJM109感受態(tài)細胞中，利用含有氨芐抗性的平板進行篩選，挑取轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR驗證，將驗證正確的進行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒送天霖生物有限公司進行測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為pET-3b(+)-sam2。pET-28a(+)-sam2重組質(zhì)粒則由上海生物工程有限公司合成。將重組質(zhì)粒pET-3b(+)-sam2和pET-28a(+)-sam2分別化轉(zhuǎn)E.coliBL21和E.coliRosetta，得到重組菌株E.coliBL21/pET-28a(+)-sam2、E.coliBL21/pET-3b(+)-sam2、E.coliRosetta/pET-28a(+)-sam2和E.coliRosetta/pET-3b(+)-sam2。

1.2.4 重組大腸桿菌的發(fā)酵及酶的誘導表達

將構(gòu)建好的重組菌E.coliBL21/pET-28a(+)-sam2、E.coliBL21/pET-3b(+)-sam2、E.coliRosetta/pET-28a(+)-sam2和E.coliRosetta/pET-3b(+)-sam2分別按1%的接種量接入10 mL帶有相應抗性的LB種子培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。之后按10%接種量轉(zhuǎn)接至50 mL含相應抗性的LB發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，重組菌株E.coliBL21/pET-28a(+)-sam2和E.coliRosetta/pET-28a(+)-sam2于37 ℃培養(yǎng)至適當菌濃(OD600約為0.8)后，加入50 μL IPTG(0.5 mol/L)使其終濃度為0.5 mmol/L， 24 ℃下低溫誘導24 h。重組菌株E.coliBL21/pET-3b(+)-sam2和E.coliRosetta/pET-3b(+)-sam2在37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h，以空載宿主作為對照。

取2 mL發(fā)酵液在4 ℃下8 000 r/min離心5 min，菌體用PBS洗滌2～3次以除去殘留發(fā)酵液，離心收集菌體進行全細胞酶活檢測。離心收集測酶活后的剩余菌體，用PBS重懸后超聲破碎細胞，離心收集上清為粗酶液，將粗酶液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gellectrophoresis，SDS-PAGE)，檢測重組蛋白是否異源表達成功。

1.2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

在LB、SB、TB、2×YT、SOB以及SOC六種培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，并在相同條件下進行誘導產(chǎn)酶，25 ℃誘導24 h后測定酶活及OD600，以確定適合于重組菌產(chǎn)酶的培養(yǎng)基。

選擇最適的IPTG誘導時間，控制IPTG濃度為0.5 mmol/L的情況下，將重組菌在25 ℃下分別誘導6、12、18、24、30、36 h后測定酶活及OD600以確定最適誘導時間。

選擇最優(yōu)的IPTG濃度，在不同濃度的IPTG(0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mmol/L)下，將菌液于25 ℃，220 r/min進行誘導，誘導24 h后，測定酶活及OD600以確定IPTG的最佳濃度。

1.2.6 腺苷蛋氨酸合酶酶活檢測

反應母液的配置：L-蛋氨酸 100 mmol/L,三磷酸腺苷100 mmol/L,還原型谷胱甘肽80 mmol/L。

酶活緩沖液：KCl 0.5 mol/L,MgCl2·6H2O 0.2 mol/L,Tris-HCl 0.5 mol/L，pH為8.0。

反應體系：200 μL 100 mmol/L三磷酸腺苷、200 μL 100 mmol/LL-蛋氨酸、100 μL酶活緩沖液、100 μL 80 mmol/L還原型谷胱甘肽、400 μL去離子水，振蕩混勻后，37 ℃條件下反應1 h后加入體積分數(shù)為20%的高氯酸溶液終止反應。37 ℃，1個酶活單位(U)為1 h、1 mL溶液中生成1 μmol SAM所需要的酶量。

1.2.7 HPLC分析腺苷蛋氨酸產(chǎn)量

色譜柱為Hypercil GOLDTMaQ C18(4.6 mm ×250 mm)，流動相為0.01 mol/L甲酸銨和體積分數(shù)為3%的甲醇水溶液(pH 3.0)，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm，進樣量為10 μL，采用外標法，根據(jù)不同濃度的SAM標準品的峰面積所作標準曲線定量樣品SAM的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組大腸桿菌的構(gòu)建與篩選

2.1.1 腺苷蛋氨酸合酶基因sam2的克隆

將來源于釀酒酵母BY4741的腺苷蛋氨酸合酶基因sam2基因進行密碼子優(yōu)化，由上海生物科技有限公司進行基因合成，得到經(jīng)優(yōu)化后的目的基因與大腸表達質(zhì)粒pET-28a(+)相連。然后以合成的目的基因為模板，以S1-R、S1-F為引物進行目的片段的擴增并利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測其大小。結(jié)果如圖1-a所示，在1 100 bp附近有明顯條帶，與目的基因sam2的大小(1 155 bp)吻合，說明成功從模板中擴增出目的基因片段。

2.1.2 重組大腸桿菌的構(gòu)建

將帶有Amp抗性的pET-3b(+)質(zhì)粒與擴增得到的目的基因片段進行連接，得到重組質(zhì)粒pET-3b(+)-sam2。將重組質(zhì)粒導入E.coliJM109中，挑取轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR驗證，驗證正確的進行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，雙酶切(NdeI和XbaI)進行鑒定。驗證結(jié)果如圖1-b所示，在泳道中出現(xiàn)明顯條帶(約1 100 bp)，與目的基因大小相符。雙酶切結(jié)果如圖1-c所示，在4 600和1 100 bp附近出現(xiàn)了條帶，其大小分別與質(zhì)粒和目的片段的大小相符。將驗證正確的質(zhì)粒進行測序，測序結(jié)果顯示基因序列正確，即重組質(zhì)粒pET-3b(+)-sam2構(gòu)建成功。

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET-3b(+)-sam2和上海生工合成的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-sam2同時轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.coliBL21和E.coliRosetta中獲得重組菌株E.coliBL21/pET-3b(+)-sam2、E.coliRosetta/pET-3b(+)-sam2、E.coliBL21/pET-28a(+)-sam2和E.coliRosetta/pET-28a(+)-sam2。

a-PCR擴增；b-轉(zhuǎn)化子菌落PCR；c-雙酶切驗證圖a中M- 10 kb marker；1,2- sam2基因PCR擴增驗證;圖b中M- 2 kb marker；3,4-轉(zhuǎn)化子菌落PCR;圖c中M- 10 kb marker；5- NdeI和XbaI雙酶切驗證pET-3b(+)-sam2圖1 目的基因的PCR擴增電泳圖和重組表達質(zhì)粒的酶切驗證圖Fig.1 Electrophoresis map of the target gene amplified by PCR and recombinant plasmid digested by restrion enzyme

2.1.3sam2基因在大腸桿菌中的重組表達

對重組菌E.coliBL21/pET-3b(+)-sam2和E.coliBL21/pET-28a(+)-sam2的粗酶液進行SDS-PAGE(以轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的宿主菌為對照)，結(jié)果如圖2所示。根據(jù)氨基酸序列預測該酶的理論分子質(zhì)量為43 kDa，在約43 kDa處，重組菌產(chǎn)物明顯多于只轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的宿主菌，推測目的基因成功實現(xiàn)了在大腸桿菌中的異源表達。

M- 蛋白質(zhì)marker； 1- E.coli BL21/pET-3b(+)粗酶液； 2- E.coli BL21/pET-28a(+)粗酶液； 3- E. coli BL21/pET-3b(+)-sam2粗酶液； 4- E.coli BL21/pET-28a(+)-sam2粗酶液圖2 重組腺苷蛋氨酸合酶SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE analysis of the recombinant adenosylmethionine synthase

2.1.4 重組大腸桿菌的篩選

利用原核表達系統(tǒng)上表達目的蛋白的過程中，構(gòu)建一個合適的原核表達體系需要綜合考慮很多的因素，包括挑選合適的表達宿主、構(gòu)建適合目的基因表達的重組質(zhì)粒以及優(yōu)化誘導條件等[20]。

本研究對構(gòu)建得到的4株重組菌株的產(chǎn)酶能力進行考察，結(jié)果如圖3所示，與其空載對照相比較，4株菌株的酶活均有明顯提高，說明均成功實現(xiàn)了腺苷蛋氨酸合酶的異源表達，其中，重組菌株BL21-pET-28a(+)-sam2的酶活在24 h達到最高值0.184 U/mL(圖3-a)，明顯高于其他3株重組菌株BL21-pET-3b(+)-sam2(圖3-b)、E.coliRosetta-pET-3b(+)-sam2(圖3-c)和Rosetta-pET-28a(+)-sam2(圖3-d)，說明與質(zhì)粒pET-3b(+)相比，質(zhì)粒pET-28a(+)更有利于目的蛋白的表達。與E.coliBL21相比，宿主E.coliRosetta的生長速率較慢，代謝周期更長，酶活表達量較低。因此，選取重組菌株BL21-pET-28a(+)-sam2作為出發(fā)菌株進行后續(xù)的優(yōu)化實驗。

2.2 發(fā)酵條件對腺苷蛋氨酸合酶生產(chǎn)的影響

2.2.1 不同培養(yǎng)基對產(chǎn)酶的影響

不同種類的培養(yǎng)基對重組菌的生長與產(chǎn)酶影響較大，因此，需要對重組菌BL21-pET-28a(+)-sam2的培養(yǎng)基進行必要的優(yōu)化。考察了6種培養(yǎng)基對體生長及酶活的影響，如圖4所示，重組菌在TB培養(yǎng)基中生長最好，OD600在生長24 h后能達到9.66，且酶活相對較高，可達0.224 U/mL，較初始培養(yǎng)基LB中的酶活提高了21.7%。因此，選擇TB培養(yǎng)基作為重組菌誘導產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)基，用于后續(xù)試驗。

2.2.2 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導時間對產(chǎn)酶的影響

異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)的誘導時間對菌體生長至關(guān)重要，誘導時間過短會導致菌體生長不徹底，產(chǎn)酶量較低；誘導時間過長則會使發(fā)酵成本增高，并且可能導致菌體自溶，降低酶活[21]。本實驗考察了IPTG的誘導時間對菌體的生長及產(chǎn)酶的影響，如圖5所示，在添加誘導劑誘導之后，重組菌的生物量隨著發(fā)酵的進行逐漸增加，在發(fā)酵24 h后上升趨勢趨于平緩，此時酶活可達到0.229 U/mL。綜合考慮菌體產(chǎn)酶量以及發(fā)酵成本，可以將誘導時間定為24 h。

2.2.3 IPTG誘導濃度對產(chǎn)酶的影響

IPTG作為強誘導劑不能被菌體所代謝，而且在培養(yǎng)過程中可以持續(xù)的發(fā)揮誘導作用，所以較少的添加量就可以起到較好的誘導作用。本實驗考察了IPTG的誘導濃度對菌體生長和產(chǎn)酶的影響，研究結(jié)果如圖6所示，在不添加誘導劑IPTG時，重組菌基本上不產(chǎn)酶，由此推測重組菌為嚴格的IPTG誘導型菌株；隨著IPTG濃度的增大，重組菌的酶活呈現(xiàn)著先增大后減小的趨勢，當加入IPTG的終濃度達到0.1 mmol/L時，重組菌的酶活達到最高(0.245 U/mL)，較初始的誘導濃度0.05 mmol/L的酶活提高了8.9%；當加入IPTG的終濃度>0.1 mmol/L時，菌體生長和酶活會顯著下降，可能的原因是重組蛋白的折疊和轉(zhuǎn)運不能與表達的速率一致，使目的蛋白在體內(nèi)聚集形成包涵體，從而降低了酶活[22]。

a-重組菌BL21-pET-28a(+)-sam2;b-重組菌BL21-pET-3b(+)-sam2;c-重組菌Rosetta-pET-3b(+)-sam2;d-重組菌Rosetta- pET-28a(+)-sam2圖3 重組菌的生長和酶活測定分析Fig.3 Analysis of growth and enzyme activity of recombinant strain

圖4 培養(yǎng)基對菌體生長及酶活的影響Fig.4 Effect of medium on bacterial growth and enzyme activity

圖5 IPTG誘導時間對菌體的生長及產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of induction time on cell growth and enzyme production

圖6 IPTG誘導濃度對菌體的生長及產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of IPTG concentration on cell growth and enzyme production

3 結(jié)論

本文成功克隆了來源于釀酒酵母酵母BY4741的sam2基因，并對其密碼子進行優(yōu)化以提高與宿主的適配性。進而構(gòu)建了4株重組菌株E.coliBL21/pET-28a(+)-sam2、E.coliBL21/pET-3b(+)-sam2、E.coliRosetta/pET-28a(+)-sam2和E.coliRosetta/pET-3b(+)-sam2，質(zhì)粒與宿主適配性篩選發(fā)現(xiàn)重組菌株E.coliBL21/pET-28a(+)-sam2中相對較高，可達0.184 U/mL。對重組菌株BL21/pET-28a(+)-sam2進行培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件優(yōu)化，結(jié)果表明，在TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加0.1 mmol/L的IPTG誘導24 h時的酶活最高，可達0.245 U/mL，較優(yōu)化前提高了34%。