易至，丁潔瓊，王鴻超，陸文偉,2，趙建新,2，陳衛(wèi),2，張灝,2*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)2(國(guó)家功能食品工程技術(shù)研究中心，江蘇 無(wú)錫，214122)

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)是健康人類(lèi)和動(dòng)物腸道菌群的重要組成部分，其分布廣泛，由于能形成芽孢而具有較好的耐酸耐膽鹽等特性，可長(zhǎng)期滯留于環(huán)境中。一般認(rèn)為丁酸梭菌是非致病菌，它可以維持腸道菌群平衡，此外還具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗癌等功能[1-2]。丁酸梭菌現(xiàn)已廣泛用于動(dòng)物養(yǎng)殖、水產(chǎn)和臨床醫(yī)藥等領(lǐng)域[3-5]，一些菌株已被成功開(kāi)發(fā)微生態(tài)制劑，用作人類(lèi)和動(dòng)物的益生菌[6-9]。鑒于丁酸梭菌眾多的益生特性，丁酸梭菌的遺傳多樣性及其變化規(guī)律逐漸成為研究熱點(diǎn)。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)和基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，采用比較基因組學(xué)等手段探究物種的遺傳多樣性逐漸成為研究重點(diǎn)。MO等[10]采用比較基因組學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌菌株DKU-01可代謝多種碳水化合物。BENAMAR等[11]使用全基因組測(cè)序和多間隔序列分型的方法分析了15株分離菌株和17株參考菌株，發(fā)現(xiàn)菌株之間存在高度變異性。此外，研究表示丁酸梭菌的許多益生作用歸因于其代謝產(chǎn)物，最重要代謝產(chǎn)物便是丁酸，對(duì)人類(lèi)腸道健康發(fā)揮著重要作用[12]。丁酸梭菌還能代謝淀粉酶和果膠酶等酶類(lèi)，這些酶可以產(chǎn)生促進(jìn)有益菌增殖的因子，有助于宿主對(duì)碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和消化[13-14]。因此丁酸梭菌的益生作用與其糖代謝能力有密切關(guān)系。PRUDEN等[15]提出抗生素抗性基因是一種新型環(huán)境污染物，存在耐藥基因轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，若通過(guò)轉(zhuǎn)移使致病菌獲得耐藥基因?qū)?lái)更大的危害。并且在實(shí)際應(yīng)用中，抗生素的大量使用已經(jīng)導(dǎo)致一些耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)，所以用于開(kāi)發(fā)微生態(tài)制劑的益生菌株的抗生素耐受性需要重視。此外，微生態(tài)制劑是否發(fā)揮作用關(guān)鍵在于是否能在人體內(nèi)定植，而定植的必要條件是益生菌必須要有較高的胃液腸液耐受性，才能有效發(fā)揮其益生作用[16]。大量研究表明，丁酸梭菌菌株因可以形成芽孢而具有良好的胃腸道耐受性[17-18]。

本研究從150份健康人糞便樣品中分離出9株丁酸梭菌，采用比較基因組學(xué)的手段對(duì)其基因組進(jìn)行分析，并測(cè)定其生物學(xué)特性，包括同源基因和特有基因、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、碳源利用能力、抗生素耐受性和耐酸耐膽鹽能力。并通過(guò)基因?qū)用娼Y(jié)合表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合評(píng)估了丁酸梭菌的遺傳多樣性及生理特性多樣性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和培養(yǎng)基

9株丁酸梭菌，分離于6份來(lái)自6個(gè)地區(qū)(黑龍江、新疆、四川、浙江、寧夏和上海)的健康人糞便，保藏于江南大學(xué)菌種保藏中心。

梭菌增殖培養(yǎng)基(reinforced clostridial medium，RCM)：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉3 g，葡萄糖5 g，可溶性淀粉1 g，NaCl 5 g，無(wú)水乙酸鈉3 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，刃天青4 mL(體積分?jǐn)?shù)0.025%)，去離子水定容至1 L，pH值為6.8±0.1，115 ℃滅菌20 min。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

菊粉、赤蘚糖醇、甘露糖、纖維二糖、鼠李糖，上海生工公司；低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖，上海源葉生物科技有限公司；阿莫西林、紅霉素、環(huán)丙沙星、甲氧芐氨嘧啶、卡那霉素、克林霉素、利福平、鏈霉素、氯霉素、氨芐青霉素、慶大霉素、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、新霉素、胃蛋白酶，生工生物工程(上海)股份有限公司；胰蛋白酶，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；膽鹽，英國(guó)Oxoid公司。所有試劑均為分析純。

模擬胃液：稱(chēng)取定量胃蛋白酶溶于無(wú)菌生理鹽水，調(diào)pH值為3，用0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾后，使終質(zhì)量濃度達(dá)到3 g/L；模擬腸液：稱(chēng)取定量胰蛋白酶和膽鹽溶于無(wú)菌生理鹽水，調(diào)pH值為8，用0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾，使終質(zhì)量濃度分別達(dá)到1和3 g/L。模擬胃腸液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.3 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)，江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司；Whitley DG25厭氧工作站，英國(guó)Don Whitley Scientific公司； pH計(jì)，奧豪斯儀器(常州)有限公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher SCIENTIFIC公司；UV1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)和DNA提取

9株丁酸梭菌在補(bǔ)充有0.5 g/LL-半胱氨酸鹽酸鹽的RCM培養(yǎng)基中，于厭氧條件下37 ℃培養(yǎng)菌株24～48 h，8 000 r/min離心5 min收集菌體。根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用TIANamp Bacteria DNA試劑盒提取基因組DNA。分別采用NanoDrop2000、picogreen和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法對(duì)提取好的基因組DNA純度、濃度和完整性進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，達(dá)到測(cè)序要求后上機(jī)測(cè)序。

1.2.2 基因組測(cè)序及比較基因組分析

采用二代測(cè)序Illumina HiSeq×10平臺(tái)，對(duì)質(zhì)檢合格的DNA樣品構(gòu)建插入約400 bp的片段，進(jìn)行PE150(pair-end)測(cè)序，測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。利用短序列組裝軟件SOAPdenovo v2.0進(jìn)行組裝[19]，局部?jī)?nèi)間隙用GapCloser軟件進(jìn)行填充。使用Glimmer v3.02 預(yù)測(cè)基因組中的蛋白編碼序列[20]。利用Orthomcl v2.0.9軟件基于蛋白序列進(jìn)行BLAST比對(duì)(保持50%一致性；截點(diǎn)參數(shù) E-value<1e-4)，再用 Markov 聚類(lèi)算法進(jìn)行聚類(lèi)[21]。利用MAFFT v7.3軟件比對(duì)直系同源基因，提取聚類(lèi)結(jié)果，利用鄰接法并使用phyML v3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[22]。使用HMMER v3.1軟件對(duì)菌株進(jìn)行注釋?zhuān)@得碳水化合物活性酶基因注釋結(jié)果并將其與碳水化合物活性酶(CAZy, http://www.cazy.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較[23]。與綜合抗生素研究數(shù)據(jù)庫(kù)(CARD 1.0.6, http://arpcard.Mcmaster.ca)進(jìn)行比對(duì)分析，以獲得基因組中預(yù)測(cè)的抗生素抗性基因信息[24]，若抗性基因的序列匹配度達(dá)到30%(E-value <1e-5)，則認(rèn)為該抗性基因存在。使用HemI v1.0.0軟件基于預(yù)測(cè)的基因繪制熱圖。

1.2.3 碳水利用能力測(cè)定

低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉、赤蘚糖醇、甘露糖、纖維二糖和鼠李糖過(guò)濾除菌后，添加到不含糖的RCM液體培養(yǎng)基中，使其終質(zhì)量濃度為10 g/L。將待測(cè)試的菌株接種于含不同碳源的培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，酶標(biāo)儀測(cè)定OD600，判定丁酸梭菌的碳源利用情況，若OD600值>0.3，則認(rèn)為菌株可利用該碳源。以正常RCM培養(yǎng)基和不含糖的RCM培養(yǎng)基分別作為陽(yáng)性和空白對(duì)照。

1.2.4 抗生素耐受能力測(cè)定

參照ISO標(biāo)準(zhǔn)ISO10932-2010，測(cè)定14種抗生素對(duì)丁酸梭菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，抗生素包括阿莫西林、紅霉素、環(huán)丙沙星、甲氧芐氨嘧啶、卡那霉素、克林霉素、利福平、鏈霉素、氯霉素、氨芐青霉素、慶大霉素、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素和新霉素。

使用二倍稀釋法按標(biāo)準(zhǔn)稀釋抗生素。將倍比稀釋后不同濃度的抗生素溶液分別加入無(wú)菌的96孔板中，第1孔為空白對(duì)照，加入無(wú)菌水和RCM培養(yǎng)基各100 μL；第2～11孔中按照濃度由低到高加抗生素稀釋液各100 μL；第12孔為菌株生長(zhǎng)陽(yáng)性對(duì)照。將菌株活化后稀釋至105～106CFU/mL，取100 μL菌懸液加入96孔板中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定OD625來(lái)判定菌株對(duì)抗生素的MIC值。菌株不出現(xiàn)生長(zhǎng)的抗生素濃度即為該抗生素對(duì)菌株的MIC值。

1.2.5 產(chǎn)孢能力測(cè)定

將活化的菌株以2%的接種量接種于RCM培養(yǎng)基中，于40 ℃、210 r/min搖晃厭氧培養(yǎng)24～48 h以激發(fā)芽孢萌發(fā)。將菌懸液在85 ℃下水浴加熱15 min，滅活營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，得到芽孢懸液。熱處理前后的懸液分別梯度稀釋并傾注計(jì)數(shù)，根據(jù)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞+芽孢總數(shù)、芽孢數(shù)量計(jì)算產(chǎn)孢率，如公式(1)所示。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次平行。

(1)

1.2.6 耐酸耐膽鹽能力測(cè)定

按照1.2.5的方法得到芽孢懸液，用無(wú)菌生理鹽水洗滌2～3次后離心收集芽孢體，再重懸于無(wú)菌生理鹽水。取1 mL芽孢懸液8 000 r/min離心10 min后棄上清，重懸于1 mL模擬胃液，置于37 ℃厭氧孵育2 h后計(jì)數(shù)。同樣取1 mL芽孢懸液離心后，重懸于1 mL模擬腸液，置于37 ℃厭氧孵育4 h后計(jì)數(shù)。計(jì)算菌株存活率。實(shí)驗(yàn)設(shè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞對(duì)照，并設(shè)3次平行。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

所有測(cè)定指標(biāo)均進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)用SPSS v20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)用于分析組間顯著性差異，P<0.05被認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸梭菌基因組概況及系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究從150份健康人糞便樣品中分離得到9株丁酸梭菌。分別來(lái)源于6個(gè)地區(qū)，如表1所示，其中從FHLJZD47樣品中篩得4株丁酸梭菌。分離菌株的基因組大小在4.46～4.65 Mb，基因組大小變異度較?。圾B(niǎo)嘌呤和胞嘧啶含量(guanine & cytosine，GC)在28.49%～28.54%。分離自同一樣本的菌株基因組大小在4.48～4.65 Mb，GC含量在28.49%～28.54%。

表1 九株丁酸梭菌的來(lái)源信息及基因組概況Table 1 Source information and genomes of 9 Clostridium butyricum

基于全基因組序列比較分析丁酸梭菌的遺傳多樣性，包括9株實(shí)驗(yàn)室分離得到的菌株與25株NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的丁酸梭菌菌株(附表1，http://doi/org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.023385)。如圖1所示，同源性分析結(jié)果顯示，34株丁酸梭菌共有346個(gè)同源基因，包括用于次生代謝產(chǎn)物的生物合成、氨基酸和碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝等基因，以及大量未知功能的基因。每個(gè)菌株的特有基因個(gè)數(shù)為4～1 501個(gè)，特有基因個(gè)數(shù)占該菌株的總基因數(shù)為6%～29%，表明菌株之間存在明顯差異。其中來(lái)自NCBI庫(kù)中的菌株INCQS635、NEC8和DORA_1特有基因數(shù)量與其他菌株差別較大。本實(shí)驗(yàn)分離得到的9株丁酸梭菌的特有基因個(gè)數(shù)為24～109。其中FHLJZD47樣品分離得到4株菌的總基因數(shù)在4 006～4 203，特有基因數(shù)在23～68，即同一樣本分離的不同菌株基因組存在差異。

圖1 丁酸梭菌的特有和同源基因Fig.1 Venn diagram displaying the unique and orthologues gene of Clostridium butyricum

基于單拷貝直系同源基因，對(duì)34株丁酸梭菌菌株和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中8株同屬不同種的相似模式菌株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，如圖2所示。34株丁酸梭菌菌株成一亞簇，確定本研究所篩選菌株為丁酸梭菌。34株丁酸梭菌的進(jìn)化與宿主來(lái)源沒(méi)有明顯相關(guān)性。根據(jù)本研究分離得到的9株菌的進(jìn)化結(jié)果，可知菌株進(jìn)化與地理來(lái)源之間也無(wú)明顯相關(guān)性；該9株菌系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系遠(yuǎn)近不同，表明菌株基因存在豐富的多樣性。根據(jù)FHLJZD47T2、FHLJZD47T4、FHLJZD47T8和FHLJZD47T9這4株菌的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果，發(fā)現(xiàn)4株菌分成2個(gè)小分支，可知來(lái)自同一個(gè)樣品里的菌株同源性高，但是也存在差異。BENAMAR等[11]通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析，提出丁酸梭菌是一個(gè)在遺傳上具有多樣性的物種，這與本文研究結(jié)果一致。綜上，根據(jù)丁酸梭菌菌株基因組大小、GC含量、特有基因以及系統(tǒng)進(jìn)化等方面，表明丁酸梭菌存在菌株水平上的基因組多樣性。

圖2 丁酸梭菌基于同源基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on homologous genes of Clostridium butyricum注：藍(lán)底：篩選菌株；紅底：NCBI丁酸梭菌菌株；灰底：NCBI相似種菌株；紫圈：人類(lèi)糞便；黃圈：動(dòng)物糞便；綠圈：牛瘤胃；橙圈：窖泥、污泥、廢水

2.2 丁酸梭菌碳源利用的特性

為了評(píng)估丁酸梭菌不同碳源利用能力，選取了8種不同碳源進(jìn)行體外特性測(cè)定。結(jié)果如圖3所示，所有測(cè)試菌株都能夠利用甘露糖和纖維二糖，這結(jié)果與伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)[25]的結(jié)論一致。除菌株FHLJZD47T6外，其他菌株均能利用低聚果糖;除菌株FZJHZD6M2外，其他菌株均不能利用菊粉、赤蘚糖醇以及鼠李糖，可能是由于菌株的特異性。低聚木糖和低聚半乳糖的利用能力在所測(cè)試菌株中是可變的。同時(shí)該結(jié)果表明FHLJZD47樣品中的菌株碳源利用能力存在差異，這與系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果一致。根據(jù)其他研究結(jié)果可知[13]，丁酸梭菌對(duì)甘露糖、纖維二糖能利用，對(duì)鼠李糖不能利用，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相符。

圖3 丁酸梭菌對(duì)不同碳源的利用情況Fig.3 Utilization of different carbohydrates of Clostridium butyricum

為進(jìn)一步驗(yàn)證丁酸梭菌碳源利用能力，我們基于碳水化合物活性酶庫(kù)(carbohydrate-active enzyme,CAZY)對(duì)丁酸梭菌的碳水化合物活性酶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖4)，結(jié)果顯示其碳水化合物活性酶基因包括39個(gè)糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GH)、13個(gè)糖苷轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase,GT)、9個(gè)碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases,CE)、8個(gè)碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydrate-binding module,CBM)和2個(gè)多糖裂解酶(polysaccharide lyase,PL)家族，它們與甘露糖和纖維二糖等糖原利用相關(guān)?？梢?jiàn)GH家族基因最多，其中GH13家族的基因最為豐富，基因個(gè)數(shù)在17～20個(gè)。GH13家族是淀粉酶等多糖利用相關(guān)基因。GH5家族可編碼β-甘露聚糖酶基因，GH94家族可編碼纖維二糖磷酸化酶基因，它們分別可以參與甘露糖和纖維二糖利用過(guò)程，與表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。除FZJHZD-6M2外，其他8株菌株均存在木糖苷酶基因，但是FXJWS2T9、FSHCM43T2和FNXYCHL33卻不能利用低聚木糖。所有菌株均預(yù)測(cè)到β-半乳糖苷酶基因，而半乳糖是β-半乳糖苷酶代謝的底物之一，可是也存在3株菌不能利用。以上研究結(jié)果表明,個(gè)別菌株在基因?qū)用婧捅硇蜕洗嬖诓町?，推測(cè)是因?yàn)榫幋a木糖苷酶的基因不能轉(zhuǎn)錄表達(dá)。其次，未預(yù)測(cè)到與菊粉、赤蘚糖醇和鼠李糖利用相關(guān)酶編碼基因，這與表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致性較高。

圖4 丁酸梭菌GH家族基因的預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of GH family genes of Clostridium butyricum

2.3 丁酸梭菌對(duì)抗生素的耐受性

本研究測(cè)試了9株丁酸梭菌對(duì)14種抗生素的MIC值，并根據(jù)EFSA[26]對(duì)芽孢桿菌屬抗生素耐受閾值的規(guī)定，將菌株劃分為耐受(R)和不耐受(S)，結(jié)果如圖5所示。這9株丁酸梭菌菌株普遍對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素(新霉素、卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素)耐受，半數(shù)菌株不耐受甲氧芐氨嘧啶，而絕大部分菌株都對(duì)阿莫西林、氨芐青霉素和四環(huán)素敏感，所有菌株對(duì)氯霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、萬(wàn)古霉素、克林霉素和利福平敏感。ISA等[27]研究發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌MIYAIRI 588和ATCC 19398T對(duì)卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素等氨基糖苷類(lèi)抗生素具有抗性，而對(duì)其他常用抗生素都特別敏感，這與本研究結(jié)果一致。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)FHLJZD47樣品中的菌株對(duì)甲氧芐氨嘧啶的耐受性存在差異，證明同一樣品中存在株水平的遺傳多樣性。

圖5 丁酸梭菌對(duì)不同抗生素的耐受性Fig.5 Resistance of Clostridium butyricum to different antibiotics注：上端抗生素斜體表示EFSA還未制定該抗生素芽孢桿菌屬耐受閾值

基于CARD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)菌株基因組進(jìn)行注釋?zhuān)M(jìn)一步探究丁酸梭菌抗生素基因型與表型的關(guān)系。如圖6所示，如圖6所示，9株丁酸梭菌菌株共預(yù)測(cè)到109種抗性基因，其中共有的抗性基因共63種，包括糖肽類(lèi)抗性基因(vanWI，vanRI，vanRG，vanRF)、四環(huán)素抗性基因(tet35)、氟喹諾酮耐受基因(gyrA，mfd)、氨基糖苷類(lèi)抗性基因(rpsL)、利福平耐受基因(rpoB、rpoC)、甲氧芐氨嘧啶抗性基因(dfrK)、林可酰胺類(lèi)抗性基因(lmrC，lmrD)、β-內(nèi)酰胺抗性基因(blaI，mecC，PBP1a)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗性基因(macB)、氯霉素抗性基因(catB8)?？梢?jiàn)在抗生素抗性基因?qū)用妫∷崴缶目剐曰虿町惒淮蟆?/p>

其中macB基因數(shù)量最多，它編碼一種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是一種抗生素外排泵，用于輸出大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)物質(zhì)，與紅霉素耐受相關(guān)。但是丁酸梭菌抗生素表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丁酸梭菌對(duì)紅霉素并不耐受，推測(cè)該抗性基因在丁酸梭菌中沉默，需后期進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，亦或是由于macB基因與CARD數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì)相似度不高(均<40%)。對(duì)于氨基糖苷類(lèi)抗性基因rpsL基因在所有菌株中比對(duì)相似度均達(dá)到70%以上，該抗性基因可以使氨基糖苷類(lèi)抗生素失活，由此證實(shí)了所測(cè)菌株對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素的普遍抗性。在FSHCM43T2菌株中blaI基因數(shù)大于其他菌株，表現(xiàn)出對(duì)氨芐青霉素和阿莫西林的抗性。研究表明[28]四環(huán)素耐藥的重要機(jī)制是tet基因編碼的活性藥物外排的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)在菌株FNXYCHL33和FSHCM43T2中tet抗性基因與CARD數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì)結(jié)果的相似度可以達(dá)到97.0%，抗生素表型實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)這2株菌對(duì)四環(huán)素具有抗性。

但對(duì)于其他抗生素也存在菌株基因型與表型并不對(duì)應(yīng)的情況，例如在菌株FNXYCHL33中注釋到糖肽類(lèi)抗性基因并且數(shù)量多，相似度最高達(dá)到52.6%，但表型顯示出對(duì)萬(wàn)古霉素敏感，推測(cè)是由于基因、移動(dòng)元件及其細(xì)菌宿主之間發(fā)生了復(fù)雜的相互作用[29]，阻礙了基因的表達(dá)。

圖6 丁酸梭菌抗性基因的預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of Clostridium butyricum resistance genes

2.4 芽孢形成顯著提高丁酸梭菌的耐酸和耐膽鹽能力

為探究丁酸梭菌耐酸耐膽鹽的能力，分別測(cè)定其營(yíng)養(yǎng)體和芽孢體在模擬胃液和模擬腸液下的存活率。如表2、表3所示，9株丁酸梭菌的產(chǎn)孢率在34.72%～60.26%，但未能成功得到FSCDJY9T6、FSHCM43T2和FNXYCHL33這3株菌的芽孢體。通過(guò)比較營(yíng)養(yǎng)體和芽孢體耐酸耐膽鹽特性，結(jié)果表明，丁酸梭菌芽孢體模擬胃腸液的耐受性相較于營(yíng)養(yǎng)體得到顯著提升(P<0.05)，如菌株FXJWS2T9模擬胃液存活率從0.21%提升至9.04%，模擬腸液耐受性從1.18%提升至36.35%。丁酸梭菌芽孢體表現(xiàn)出對(duì)模擬胃液耐受性不強(qiáng)，但對(duì)模擬腸液的耐受性?xún)?yōu)于周非帆等[30]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。菌株產(chǎn)孢率與存活率相比較發(fā)現(xiàn)，芽孢不是菌株耐酸耐膽鹽能力的絕對(duì)影響因素。推測(cè)還與細(xì)胞表層蛋白、胞外多糖產(chǎn)量以及分泌的膽鹽水解酶相關(guān)[31]。

表2 丁酸梭菌營(yíng)養(yǎng)體在模擬胃液和模擬腸液下的存活率 單位：%

3 結(jié)論

本研究從6份健康人糞便樣品中分離出9株丁酸梭菌并完成了基因組測(cè)序，通過(guò)比較基因組學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)菌株在基因組大小、GC含量、特有基因數(shù)以及系統(tǒng)進(jìn)化方面存在差異，表明丁酸梭菌在菌株水平存在基因組多樣性；宿主來(lái)源和地理來(lái)源與系統(tǒng)進(jìn)化沒(méi)有顯著相關(guān)性；菌株的碳水化合物酶活性基因數(shù)和抗生素抗性基因數(shù)呈現(xiàn)菌株特異性。

表3 丁酸梭菌芽孢體在模擬胃液和模擬腸液下的存活率 單位：%

注：-表示無(wú)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

根據(jù)體外生物學(xué)特性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)9株丁酸梭菌菌株普遍能利用甘露糖、纖維二糖和低聚果糖，但不能利用菊粉、赤蘚糖醇和鼠李糖；菌株對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素耐受性高，對(duì)其他抗生素氯霉素、克林霉素和萬(wàn)古霉素等普遍不耐受，菌株FNXYCHL33和FSHCM43T2呈現(xiàn)出對(duì)四環(huán)素的抗性，可能與菌株攜帶tet抗性基因相關(guān)；所有菌株芽孢體耐酸性不強(qiáng)但耐膽鹽能力較強(qiáng)，芽孢形成顯著提高丁酸梭菌的耐酸和耐膽鹽能力。與此同時(shí)，同一樣品中的不同菌株生物學(xué)特性表型結(jié)果存在差異，驗(yàn)證了基因水平存在多樣性的現(xiàn)象。此外，通過(guò)比較基因組學(xué)分析丁酸梭菌基因型，并結(jié)合生物學(xué)特性表型實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)菌株基因型和表型之間具有較高一致性，但存在部分菌株基因型與表型不匹配的情況。

附表1 NCBI丁酸梭菌和相似種的來(lái)源信息及基因組概況

注：“/”表示無(wú)樣本信息