侯欽,林潔純,吳靈飛,汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 廣東省汕頭市 515041

0 引言

近年,環(huán)狀RNAs(circular RNAs,circRNAs)在消化系惡性腫瘤中的作用受到廣泛關(guān)注.有證據(jù)顯示,circRNAs參與了細(xì)胞多種生命活動,并與腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展密切相關(guān),本文結(jié)合國內(nèi)外最新報道,對circRNAs在消化系惡性腫瘤中的表達(dá)及作用作一綜述.

1 circRNAs的產(chǎn)生

1976年,Sanger等[1]利用電子顯微鏡、超速離心、熱變性等方法,首先在植物感染的病毒顆粒中觀察到了共價閉合環(huán)狀RNA分子,并將其命名為環(huán)狀RNA.它是一類新型的非編碼長鏈RNA,由前體mRNA剪切而成,既無5’端帽子又無3’端poly A尾巴的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu),廣泛存在于多種真核生物體內(nèi),主要位于細(xì)胞質(zhì)或儲存于外泌體中,不受RNA外切酶影響,表達(dá)穩(wěn)定且不易降解.大多數(shù)circRNAs是由外顯子環(huán)化而成,也有部分circRNAs是由內(nèi)含子環(huán)化而成的套索結(jié)構(gòu).Chen等[2]提出circRNAs是由真核生物中數(shù)千種基因的前體mRNA反向剪接產(chǎn)生的.根據(jù)其前體mRNA的不同,circRNAs可大致分為四類：全外顯子型的ecRNA (exonic circRNA)[3]、套索內(nèi)含子從前體mRNA切除形成的ciRNA(intronic circRNA)[4]、內(nèi)含子保留的轉(zhuǎn)錄本反向剪切后形成的EIciRNA(exon-intron circRNA)[5]以及由病毒RNA基因組、tRNA、rRNA、snRNA等環(huán)化產(chǎn)生或人工合成的circRNAs.其中,ecRNA數(shù)量最多.2013年Jeck等[6]提出了兩種被學(xué)術(shù)界廣泛接受的circRNA環(huán)化模型.第一種是套索驅(qū)動的環(huán)化模型,它是由一個外顯子3’端的剪接供體和另一個外顯子的5’端剪接受體共價結(jié)合,形成含外顯子的套索結(jié)構(gòu),再切除內(nèi)含子而形成circRNA[7].如果保留了外顯子之間的內(nèi)含子,則更可能形成EIciRNA.第二種是內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化模型,它認(rèn)為其合成是通過環(huán)化外顯子相鄰的兩側(cè)內(nèi)含子的反向互補(bǔ)序列進(jìn)行堿基配對而形成環(huán)狀結(jié)構(gòu),再剪掉內(nèi)含子,最終形成circRNA.而ciRNA由內(nèi)含子獨立環(huán)化而來,其結(jié)構(gòu)的形成依賴于靠近5’剪接位點的富含7個核苷酸GU的元件和靠近分支點的富含11個核苷酸C的元件[4].在反向剪接過程中,富含GU的元件和富含C的元件首先結(jié)合在一起形成環(huán)形結(jié)構(gòu),然后通過剪接體將該區(qū)域的外顯子和內(nèi)含子切除.

由于circRNAs是由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄,由剪接體產(chǎn)生,并且與經(jīng)典剪接競爭,因此通過調(diào)節(jié)順式剪接因子或改變RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄動力學(xué)可以改變剪接效率[8].下調(diào)剪接調(diào)節(jié)因子(如SR蛋白SF2)或核心剪接體元件(如snRNP-U1-70K、snRNP-U1-C、Prp8、Slu7、CDC40),可將產(chǎn)物從線性變成circRNAs[9,10].CircRNAs沒有自由末端,因此并不是通用經(jīng)典的RNA降解途徑.理論上,circRNAs降解可能由核酸內(nèi)切酶啟動,隨后聯(lián)合外切和內(nèi)切.MiRNA介導(dǎo)的circRNAs降解是目前研究較為充分的circRNAs降解途徑.如miR-671與Cdr1as上有一段序列互補(bǔ),可觸發(fā)miRNA介導(dǎo)的Ago2剪切,將環(huán)狀Cdr1as變?yōu)榫€性RNA,導(dǎo)致其穩(wěn)定性降低而降解[11].最近的一項研究指出,m6A 修飾亦可促進(jìn)核酸內(nèi)切酶的募集并參與circRNAs的降解[12].除此之外,胞吐作用亦可促進(jìn)circRNAs從細(xì)胞中清除[13].鑒于越來越多的證據(jù)表明circRNAs是功能分子,它的降解、胞外運(yùn)輸機(jī)制勢必成為未來研究的重點.

2 circRNAs的結(jié)構(gòu)和功能

circRNAs的結(jié)構(gòu)為環(huán)狀,它比線性結(jié)構(gòu)的RNA更耐受核酸外切酶降解,且在胞內(nèi)的半衰期超過48 h,因此能在復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中穩(wěn)定存在.研究發(fā)現(xiàn),許多circRNAs可穩(wěn)定存在于唾液和血清外泌體中,這為臨床檢測提供了方便[14].circRNAs數(shù)量繁多,分布廣泛,其總數(shù)可達(dá)線性mRNA的10倍,其中大部分circRNAs在細(xì)胞進(jìn)化過程中表現(xiàn)出很強(qiáng)的保守性.同時circRNAs還具有組織、時序特異性和疾病特異性等特點[6,15],使其有可能成為新的臨床診斷和預(yù)后判斷的分子靶標(biāo),為疾病的研究提供理論依據(jù).

目前,circRNAs的作用機(jī)制包括充當(dāng)miRNA海綿[16]、與RNA結(jié)合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)相互作用[17]、翻譯蛋白質(zhì)[18]、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或剪接[2,19]以及表觀遺傳學(xué)改變[20]等.目前研究最多的是circRNAs作為miRNAs功能的調(diào)節(jié)因子.研究表明某些circRNAs含有許多miRNAs結(jié)合位點,可通過選擇性吸附而調(diào)節(jié)miRNAs水平和/或活性[21].另外,由于circRNAs能長時間存在且與RBPs結(jié)合,可充當(dāng)這些因子的誘餌或轉(zhuǎn)運(yùn)子.在某些情況下,circRNAs和宿主基因蛋白還可直接或間接地進(jìn)行交互作用[22].此外,還有circRNAs可被翻譯的研究報道[23-25].有趣的是,可翻譯的circRNAs趨向于使用與宿主基因同樣的起始密碼子,并有一個進(jìn)化保守的終止密碼子,這是環(huán)形開放閱讀框架所獨有的.Pamudurti等[24]還發(fā)現(xiàn)某些可翻譯的circRNAs具有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點,能夠在體內(nèi)和體外以不依賴帽的方式翻譯.據(jù)報道,一些circRNAs可通過與RNA聚合酶II復(fù)合體結(jié)合并翻譯相關(guān)蛋白來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[2],也參與選擇性剪接的調(diào)控[19].近年研究還發(fā)現(xiàn),circRNAs不僅在多種組織生理過程中發(fā)揮作用,如影響胰島素分泌[26]及組織發(fā)育[27]等；而且在疾病病理過程中亦發(fā)揮重要作用,如在神經(jīng)系統(tǒng)疾病[28],心血管疾病[29],退化性疾病[30]和腫瘤[31]等均出現(xiàn)多種circRNAs的表達(dá)異常.

3 circRNAs在消化系惡性腫瘤中的作用

隨著對circRNAs結(jié)構(gòu)和功能研究的深入,circRNAs在消化系惡性腫瘤中的作用越來越受到重視,下表總結(jié)了近年在消化系惡性腫瘤中一些新發(fā)現(xiàn)的circRNAs及其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制(表1).

3.1 肝癌 肝癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率都較高[32].肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常見的肝臟惡性腫瘤類型,占原發(fā)性肝癌的 90%.中國HCC患病率高,具有惡性程度高、易發(fā)生血道轉(zhuǎn)移、早期診斷率低等特點.越來越多的證據(jù)表明,circRNAs在HCC發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用.

3.1.1 高表達(dá)的circRNAs：Hu等[33]研究證實,circASAP1與肝癌切除術(shù)后肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān),它可通過競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)機(jī)制競爭性結(jié)合miR-326和miR-532-5p,一方面上調(diào)MAPK1的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的增殖和侵襲,另一方面又通過調(diào)節(jié)CSF-1的表達(dá)促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤,改變腫瘤生長、侵襲的微環(huán)境.Wei等[34]發(fā)現(xiàn)在HCC的早期階段circ-CDYL明顯上調(diào),并證實circ-CDYL可分別充當(dāng)miR-892a和miR-328-3p的分子海綿,通過ceRNA競爭性機(jī)制活化miR-892a/HDGF/PI3K/AKT途徑及miR-328-3p/HIF1AN/NOTCH2通路抑制腫瘤的干性及增殖.此外,他們通過受試者工作特性(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析發(fā)現(xiàn),相比于單因素評估,將circ-CDYL、HDGF和HIF1AN聯(lián)合應(yīng)用時,曲線下面積(area under the curve,AUC)提高到0.73,其敏感性和特異性分別為75.36%、66.67%,對肝癌的早期診斷效率優(yōu)于AFP (AUC=0.59).Xiao等[35]研究發(fā)現(xiàn),雌激素受體α (estrogen receptor α,ERα)在HCC組織中表達(dá)下調(diào),其表達(dá)與circ-SMG1.72呈負(fù)相關(guān),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),ERα可與宿主基因SMG的啟動子直接結(jié)合,通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控來抑制circ-SMG1.72的表達(dá).高表達(dá)的circ-SMG1.72通過競爭性結(jié)合miR-141-3p來上調(diào)GSN,從而促進(jìn)HCC細(xì)胞侵襲.因此,靶向ERα可以通過改變ERα/circRNA-SMG1.72/miR-141-3p/GSN信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制HCC侵襲轉(zhuǎn)移.

另有報道,一些circRNAs可通過與特定蛋白質(zhì)相互作用而影響腫瘤生長.circRHOT1主要定位于細(xì)胞核,在HCC組織中高表達(dá),可通過激活Tip60上調(diào)NR2F6表達(dá)而促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,并與HCC預(yù)后不良相關(guān),因而circRHOT1可能成為評估HCC患者預(yù)后的潛在指標(biāo).值得注意的是,在HCC患者中抑制circRHOT1較為困難,作者認(rèn)為藥理學(xué)上將抑制NR2F6作為治療靶點可能更有前景[36].雖然大多數(shù)circRNAs被歸類為非編碼RNA,但有些仍具有編碼能力.Liang等[37]篩選出源自β-catenin基因位點的circ-0004194 (稱為circβ-catenin)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)它在大多數(shù)肝癌細(xì)胞系中高表達(dá),它可翻譯出新型β-catenin異構(gòu)體,該異構(gòu)體通過拮抗GSK3β而誘導(dǎo)β-catenin磷酸化和降解,導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號通路激活,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移.

3.1.2 低表達(dá)的circRNAs：Yu等[38]對5對肝癌組織以及相應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行RNA測序,發(fā)現(xiàn)HCC組織中cSMARCA5的表達(dá)明顯下調(diào),其低表達(dá)預(yù)示著侵襲性臨床病理特征和預(yù)后不良.cSMARCA5的表達(dá)受DHX9的調(diào)控,它可通過海綿樣吸附miR-17-3p和miR-181b-5p來調(diào)節(jié)TIMP3的表達(dá),從而抑制HCC的生長和轉(zhuǎn)移.Zhang等[39]研究發(fā)現(xiàn)circTRIM33-12在肝癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)明顯下調(diào),其低表達(dá)與患者不良預(yù)后呈負(fù)相關(guān).circTRIM33-12可通過ceRNA機(jī)制競爭性結(jié)合miR-191來調(diào)控TET1誘導(dǎo)的DNA去甲基化,從而抑制HCC細(xì)胞的增殖、侵襲和免疫逃逸.因此,circTRIM33-12/miR-191/TET1聯(lián)合檢測作為HCC潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物可能具有實用價值.Xu等[40]通過微陣列分析及qRTPCR檢測發(fā)現(xiàn)circSETD3是HCC的抑制因子,它通過靶向作用miR-421/MAPK14信號通路抑制HCC細(xì)胞的增

殖、侵襲及遷移,并可作為HCC根治性肝切除術(shù)后判斷預(yù)后的“Biomarker”.也有一些研究報道了circRNAs通過與RBPs相互作用來發(fā)揮作用.Zhu等[41]通過HCC組織微陣列分析發(fā)現(xiàn)circZKSCAN1在HCC中表達(dá)下調(diào),其表達(dá)受QKI5的調(diào)控.作者還揭示了circZKSCAN1在HCC腫瘤干細(xì)胞中的作用機(jī)制.他們利用生物信息學(xué)分析預(yù)測出可能與其結(jié)合的10個RBPs,進(jìn)一步實驗證實circZKSCAN1可競爭性結(jié)合其中的FMRP,通過阻斷FMRP與靶基因CCAR1的結(jié)合,使Wnt/β-catenin信號通路失活,進(jìn)而抑制HCC腫瘤干細(xì)胞的惡性特征.有趣的是,Li等[42]研究發(fā)現(xiàn),肝癌中circRNAs的下調(diào)與RNA剪接因子NUDT21的下調(diào)有關(guān),NUDT21的缺失阻止了含有UGUA序列的circRNAs環(huán)化,使circRNAs無法競爭性結(jié)合miRNAs,從而下調(diào)了抑癌基因的表達(dá),導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖失控.

表1 circRNAs在消化系惡性腫瘤中的表達(dá)水平及可能的調(diào)節(jié)機(jī)制

3.2 胃癌 胃癌(gastric cancer,GC)在全球的發(fā)病率居高不下,盡管在診斷方法和治療方面已取得了許多進(jìn)步,但在大多數(shù)國家進(jìn)展期GC的5年總生存率仍不到30%[43].而早期GC治療后5年生存率可超過90%,甚至達(dá)到治愈效果.目前我國早期GC的診治率低于10%,遠(yuǎn)低于日本(70%)和韓國(50%).因此,在自然人群中推行早期GC篩查措施和高危人群進(jìn)行內(nèi)鏡精查策略,是改變我國目前GC診治嚴(yán)峻現(xiàn)狀的有效途徑.

3.2.1 高表達(dá)的circRNAs：Lu等[44]發(fā)現(xiàn)在GC組織中circ-RanGAP1表達(dá)顯著上調(diào),過表達(dá)的circ-RanGAP1可促進(jìn)體外GC細(xì)胞的侵襲、遷移和體內(nèi)腫瘤的生長,且與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存率密切相關(guān).作者進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)circ-RanGAP1可通過充當(dāng)miR-877-3p的海綿來上調(diào)VEGFA的表達(dá),從而促進(jìn)GC細(xì)胞的侵襲和遷移.此外,他們還發(fā)現(xiàn)術(shù)前GC患者血漿外泌體中circ-RanGAP1表達(dá)上調(diào),這些外泌體中的circ-RanGAP1可增強(qiáng)GC細(xì)胞的遷移和侵襲能力.Zhang等[45]研究發(fā)現(xiàn),在GC組織中circNRIP1的表達(dá)明顯上調(diào),其表達(dá)受到RNA結(jié)合蛋白QKI的調(diào)控.他們通過實驗證實敲低circNRIP1可抑制GC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和AKT1的表達(dá)水平.circNRIP1可競爭性吸附miR-149-5p,活化下游的AKT1/mTOR通路而促進(jìn)GC的進(jìn)展.circNRIP1還可通過GC細(xì)胞之間的外泌體進(jìn)行信號傳播,并在體內(nèi)促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)及腫瘤轉(zhuǎn)移.Ding等[46]發(fā)現(xiàn)circ-Donson在GC組織及細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào),其高表達(dá)與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān).進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),circ-Donson位于細(xì)胞核,可通過與NURF復(fù)合體的SNF2L亞基直接作用,將NURF復(fù)合體募集到SOX4啟動子并啟動其轉(zhuǎn)錄,最終促進(jìn)GC細(xì)胞生長.新近一些報道指出,circRNAs還參與了GC化療耐藥的調(diào)控,Huang等[47]發(fā)現(xiàn)在順鉑耐藥的GC組織和細(xì)胞中,circAKT3的表達(dá)均高于順鉑敏感組.在基于順鉑的標(biāo)準(zhǔn)方案治療的GC患者中,circAKT3的上調(diào)與腫瘤大小、組織學(xué)分級、臨床TNM分期和順鉑耐藥呈正相關(guān),并且是無病生存期(disease-free survival,DFS)的獨立危險因素.在體及離體實驗均證實circAKT3通過ceRNA機(jī)制海綿樣吸附miR-198來促進(jìn)PIK3R1表達(dá),激活GC細(xì)胞中的PI3K/AKT信號通路,從而促進(jìn)DNA損傷修復(fù)并抑制GC細(xì)胞的凋亡,表明circAKT3可能成為順鉑耐藥GC患者的潛在治療靶標(biāo).

3.2.2 低表達(dá)的circRNAs：Liu等[48]通過qRT-PCR檢測17例GC組織和相應(yīng)的癌旁正常組織中circYAP1表達(dá)水平,結(jié)果表明circYAP1在GC組織中表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)circYAP1可與miR-367-5p結(jié)合,拮抗miR-367-5p對p27Kip1的下調(diào),從而抑制GC細(xì)胞的增殖和侵襲.此外,他們還發(fā)現(xiàn)circYAP1高表達(dá)的GC患者生存期更長且對化療更敏感,表明circYAP1亦可作為GC的“Biomarker”來判斷患者的預(yù)后.Rong等[49]通過基因芯片技術(shù)對10例GC患者的血漿樣品進(jìn)行了circRNA微陣列分析,發(fā)現(xiàn)circPSMC3在GC患者血漿中顯著下調(diào)且與不良預(yù)后相關(guān).同時他們通過生物信息學(xué)分析及熒光素酶報告實驗證實circPSMC3通過ceRNA機(jī)制吸附miR-296-5p來上調(diào)PTEN的表達(dá),從而抑制GC的增殖和侵襲,裸鼠實驗亦證實circ-PSMC3可抑制GC的生長和轉(zhuǎn)移.Yang等[50]發(fā)現(xiàn)circ-HuR在GC組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào).過表達(dá)circ-HuR在體外和體內(nèi)均抑制GC細(xì)胞的生長.作者觀察到circ-HuR可與CNBP相互作用,抑制其與HUR啟動子結(jié)合,下調(diào)HUR的表達(dá)并抑制GC細(xì)胞生長和侵襲.有趣的是,不僅天然存在的circRNAs影響腫瘤的生長,某些人工合成的circRNAs也被證明可參與腫瘤生長的調(diào)控.miR-21是一種抗凋亡因子,在多種腫瘤中高表達(dá),可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制凋亡.Liu等[51]在體外巧妙設(shè)計出一種包含多個凸起miR-21結(jié)合位點的合成circRNA,通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灥确椒?證實這種合成的circRNA同樣可以海綿樣方式吸附miR-21并抑制其活性,阻止癌蛋白DAXX表達(dá)從而達(dá)到抑制GC細(xì)胞增殖的目的,這種采用人工合成或載體表達(dá)的外源性“miRNA海綿”的治療策略為circRNAs的臨床應(yīng)用開辟了一條新途徑.

3.3 結(jié)直腸癌 結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,近年來,盡管內(nèi)鏡診療技術(shù)有所進(jìn)步,但我國結(jié)直腸癌發(fā)病率仍呈上升趨勢,特別是伴有轉(zhuǎn)移的中晚期患者,預(yù)后仍差[52].

3.3.1 高表達(dá)的circRNAs：Zhou等[53]研究發(fā)現(xiàn),在CRC組織中circCAMSAP1的表達(dá)顯著上調(diào),并且與患者的生存率呈負(fù)相關(guān).circCAMSAP1可作為競爭性內(nèi)源RNA,與miR-328-5p結(jié)合,上調(diào)E2F1的表達(dá),從而促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移.在CRC患者術(shù)前血清中亦檢測到circCAMSAP1表達(dá)水平升高,提示CRC細(xì)胞很有可能通過外泌體將其轉(zhuǎn)運(yùn)至血清中,參與腫瘤的進(jìn)展.據(jù)報道,circPPP1R12A是第一個在結(jié)腸癌(colon cancer,CC)中發(fā)現(xiàn)的編碼小蛋白質(zhì)的真核生物circRNA[54].circPPP1R12A在CC組織中的表達(dá)明顯上調(diào),在促進(jìn)CC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用.circPPP1R12A帶有一個開放閱讀框,可編碼一種功能蛋白circPPP1R12A-73aa,該蛋白通過激活Hippo-YAP信號通路在體內(nèi)外均能促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移.Yang等[55]通過使用circRNA微陣列分析證實circPTK2在CRC組織中高表達(dá),并與CRC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移呈正相關(guān).進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),circPTK2通過與波形蛋白磷酸化位點Ser38、Ser55和Ser82物理結(jié)合,促進(jìn)波形蛋白表達(dá),從而介導(dǎo)EMT,促進(jìn)CRC進(jìn)展和轉(zhuǎn)移.因此,circPTK2可作為CRC轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點及判斷腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在生物標(biāo)志物.Han等[56]觀察到circLONP2 (hsa_circ_0008558)在轉(zhuǎn)移性的原發(fā)CRC組織中以及沿轉(zhuǎn)移部位的浸潤邊緣呈異常高表達(dá),并且與患者不良預(yù)后相關(guān).研究表明,circLONP2可增強(qiáng)體外CRC細(xì)胞的侵襲性,而靶向circLONP2的反義寡核苷酸則可降低其體內(nèi)移植瘤的侵襲.circLONP2定位于細(xì)胞核,其表達(dá)受原癌基因FUS的正性調(diào)控,以DDX1依賴性的方式募集DGCR8和Drosha復(fù)合物,與pri-miR-17直接相互作用并促進(jìn)其加工生產(chǎn),成熟的miR-17-5p組裝到外泌體中被鄰近腫瘤細(xì)胞攝取而增強(qiáng)其侵襲性.作者認(rèn)為,circLONP2通過調(diào)節(jié)miR-17的細(xì)胞內(nèi)成熟和細(xì)胞間轉(zhuǎn)移,在CRC發(fā)展過程中充當(dāng)了關(guān)鍵的轉(zhuǎn)移起始分子,在腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用.CircLONP2可作為CRC治療的有效預(yù)后指標(biāo)或新型抗轉(zhuǎn)移治療靶標(biāo).

CircRNAs不僅影響CRC的生長及進(jìn)展,在調(diào)控化療耐藥方面也發(fā)揮重要作用.Jian等[57]研究發(fā)現(xiàn),has_circ_001680可通過ceRNA機(jī)制競爭性結(jié)合miR-340,上調(diào)BMI1的表達(dá),從而促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)伊立替康耐藥.另一項研究報道,hsa_circ_0005963 (亦稱ciRS-122)在奧沙利鉑耐藥細(xì)胞的外泌體中明顯上調(diào)[58].外泌體將ciRS-122傳遞至周邊敏感細(xì)胞,通過競爭性結(jié)合miR-122而促進(jìn)PKM2表達(dá),加速糖酵解并誘發(fā)奧沙利鉑耐藥.這種通過外泌體進(jìn)行細(xì)胞間分子信號傳遞的機(jī)制為研究腫瘤耐藥提供了新思路.Lin等[59]研究發(fā)現(xiàn),在奧沙利鉑耐藥的CRC細(xì)胞中circCCDC66表達(dá)上調(diào),其機(jī)制與奧沙利鉑通過PI3KK介導(dǎo)的DHX9磷酸化有關(guān).上調(diào)的circCCDC66可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制凋亡,從而增強(qiáng)化療耐藥.

3.3.2 低表達(dá)的circRNAs：Li等[60]發(fā)現(xiàn)circITGA7及其線性宿主基因ITGA7在CRC組織和細(xì)胞系中均顯著下調(diào).作者證實敲除circITGA7或ITGA7可促進(jìn)CRC細(xì)胞在體外的增殖和遷移,并促進(jìn)腫瘤在體內(nèi)的生長.他們發(fā)現(xiàn)circITGA7可與miR-370-3p通過競爭性結(jié)合,使neurofibromin 1的表達(dá)上調(diào),通過抑制Ras信號通路和促進(jìn)ITGA7的轉(zhuǎn)錄來發(fā)揮抑癌作用.Li等[61]通過高通量測序技術(shù)和qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)circDDX17在CRC組織中表達(dá)明顯下調(diào),其低表達(dá)與淋巴血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān).生物信息學(xué)分析表明它可能通過與miR-21-5p結(jié)合來發(fā)揮抑癌作用.Geng等[62]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0009361在CRC組織和細(xì)胞中顯著下調(diào),其低表達(dá)可促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲,并誘導(dǎo)EMT.同時研究還發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0009361可通過與miR-582競爭性結(jié)合促進(jìn)APC2表達(dá),阻滯Wnt/β-catenin信號通路并最終抑制CRC的惡性表型.有趣的是,Pan等[63]研究發(fā)現(xiàn),circFNDC3B在結(jié)腸癌腫瘤組織中表達(dá)下調(diào),它可編碼一種新型蛋白質(zhì)circFNDC3B-218aa,該蛋白可通過下調(diào)Snail1而促進(jìn)FBP1的表達(dá),進(jìn)而抑制EMT,阻止腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和生長.

3.4 食管癌 食管癌是全世界癌癥死亡的第六大主要原因,包括食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌二大類,其中ESCC是我國最常見的食管癌類型,占全球食管癌病例的70%[64].食管癌發(fā)病率具有明顯的地理分布差異,在東亞、東非、南非以及南歐等地區(qū)的發(fā)病率較高.大部分食管癌早期臨床癥狀不明顯,就診時多已進(jìn)展為中晚期.目前臨床上治療以手術(shù)、放化療為主,但效果不盡人意,進(jìn)展期食管癌5年生存率不足30%.研究報道circRNAs在ESCC中扮演著十分重要的角色.

3.4.1 高表達(dá)的circRNAs：ciRS-7作為一種經(jīng)典的circRNA,在多種腫瘤中均發(fā)揮重要作用.Li等[65]發(fā)現(xiàn)在ESCC組織和細(xì)胞系中ciRS-7均明顯上調(diào),其高表達(dá)與ESCC患者的TNM分期呈正相關(guān).Kaplan-Meier分析表明高表達(dá)ciRS-7的ESCC患者的總生存期(overall survival,OS)和DFS更短.作者通過實驗證明ciRS-7的過表達(dá)可減弱miR-7的腫瘤抑制作用,促進(jìn)ESCC惡性進(jìn)程,進(jìn)一步研究揭示了ciRS-7/miR-7/HOXB13/NF-κB軸在ESCC中的關(guān)鍵作用.有趣的是,在另一項研究中,Sang等[66]發(fā)現(xiàn)ciRS-7具有19個miR-876-5p結(jié)合位點,ciRS-7通過海綿樣吸附miR-876-5p,來上調(diào)MAGE-A家族表達(dá),以促進(jìn)ESCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲.Hu等[67]對50例ESCC組織及其鄰近的正常組織進(jìn)qRT-PCR測定,發(fā)現(xiàn)circGSK3β在ESCC的各階段均表達(dá)上調(diào).circGSK3β通過與GSK3β直接作用,保護(hù)β-catenin免受GSK3β磷酸化,從而激活β-catenin,并促進(jìn)ESCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲.有趣的是,作者研究證實：與CEA相比,circGSK3β的特異性雖低,但敏感性更高,而二者的聯(lián)合檢測在ESCC早期可大大提高診斷的靈敏性.Pan等[68]通過circRNA微陣列分析,發(fā)現(xiàn)在ESCC組織和細(xì)胞中hsa_circ_0006948表達(dá)上調(diào),其過表達(dá)在體內(nèi)外均可誘導(dǎo)腫瘤生長,同時還與淋巴轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后呈正相關(guān).進(jìn)一步研究表明,hsa_circ_0006948可通過海綿樣吸附miR-490-3p,增強(qiáng)靶基因HMGA2的表達(dá)并誘導(dǎo)EMT.Shi等[69]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0006168在ESCC組織及細(xì)胞系中均顯著增加,其高表達(dá)與ESCC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期正相關(guān).機(jī)制研究表明,hsa_circ_0006168可作為誘餌吸附miR-100導(dǎo)致mTOR表達(dá)上調(diào),從而促進(jìn)ESCC增殖、遷移和侵襲.

研究表明circRNAs的異常表達(dá)還與腫瘤的放射敏感性相關(guān).Su等[70]通過circRNA芯片技術(shù)在不同的食管癌細(xì)胞系中選擇了74種差異表達(dá)的circRNAs并進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)具有放射抗性的KYSE-150/KYSE-150R細(xì)胞中circRNA_100367表達(dá)上調(diào)幅度最大.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)circRNA_100367可通過ceRNA 機(jī)制與miR-217競爭結(jié)合以上調(diào)Wnt3的表達(dá),并激活Wnt/β-catenin通路,從而降低了食管癌KYSE-150R細(xì)胞的放射敏感性.

3.4.2 低表達(dá)的circRNAs：Li等[71]通過qRT-PCR對684例ESCC組織及其對應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)circ-ITCH在癌組織中表達(dá)顯著低于癌旁組織.進(jìn)一步研究表明,circ-ITCH可競爭性吸附miR-7、miR-214、miR-17致使ITCH基因表達(dá)上調(diào),促進(jìn)Dv12蛋白的泛素化與降解,調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路而抑制ESCC的發(fā)生、發(fā)展.Xing等[72]發(fā)現(xiàn)circ-Foxo3在ESCC組織和細(xì)胞系中均呈低表達(dá),過表達(dá)circ-Foxo3可抑制癌細(xì)胞的增殖,使細(xì)胞阻滯在G1期并誘導(dǎo)凋亡.機(jī)制研究表明,circ-Foxo3可通過調(diào)節(jié)miR-23a/PTEN軸來發(fā)揮抑癌作用.Fan等[73]通過對3例ESCC組織和對應(yīng)的正常組織進(jìn)行circRNA微陣列分析,發(fā)現(xiàn)1045個上調(diào)和1032個下調(diào)的circRNAs,其中6個circRNAs經(jīng)臨床標(biāo)本qRT-PCR驗證,結(jié)果證實與組織芯片結(jié)果相一致；另外3個circRNAs可在血漿中檢測到.作者通過對50例ESCC患者術(shù)前血漿與50例健康人血漿進(jìn)行分析及比對,發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001946在ESCC患者血漿中表達(dá)下調(diào).他們通過ROC曲線評估得出其AUC=0.894,敏感度為92%,特異度為80%,表明血液檢測hsa_circ_0001946可作為診斷ESCC的分子“Biomarker”.Kaplan-Meier分析結(jié)果表明,低表達(dá)hsa_circ_0001946的ESCC患者OS更短、預(yù)后更差.作者還通過生物信息學(xué)分析技術(shù)預(yù)測了hsa_circ_0001946可能通過靶向結(jié)合miRNA-7-5p參與食管癌細(xì)胞增殖和侵襲的調(diào)控,但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究.

3.5 胰腺癌 胰腺癌(pancreatic carcinoma,PC)是一種相對罕見的消化系惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢[74].PC惡性程度極高,其5年生存率不到5%.

Chen等[75]通過實驗證實circ-ASH2L在胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)細(xì)胞及腫瘤組織中呈高表達(dá),其表達(dá)與淋巴管浸潤和TNM分期有關(guān).多因素分析表明circ-ASH2L高表達(dá)是影響PDAC患者OS的獨立危險因素.作者還通過qRT-PCR和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實circ-ASH2L可通過ceRNA機(jī)制競爭性結(jié)合miR-34a以上調(diào)Notch1表達(dá),從而促進(jìn)腫瘤的侵襲、增殖和血管生成.Li等[76]通過微陣列分析及qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)circ-PDE8A在PC組織中表達(dá)上調(diào),其高表達(dá)與淋巴結(jié)浸潤、TNM分期及低生存率密切相關(guān).作者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)circ-PDE8A可通過ceRNA機(jī)制競爭性結(jié)合miR-338,上調(diào)MACC1的表達(dá),并激活MET/AKT或ERK信號通路而促進(jìn)PC細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT.此外,他們還發(fā)現(xiàn)高度惡性的腫瘤細(xì)胞可分泌含有circ-PDE8A的外泌體進(jìn)入低度惡性的細(xì)胞以及血液循環(huán),從而促進(jìn)腫瘤的侵襲與進(jìn)展.Li等[77]通過qRTPCR檢測證實circ-IARS在PC組織及血漿外泌體中均呈高表達(dá),其表達(dá)水平與血管浸潤、肝轉(zhuǎn)移和TNM分期呈正相關(guān).作者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)circ-IARS通過外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入人微血管內(nèi)皮細(xì)胞,通過海綿樣吸附miR-122以增強(qiáng)RhoA活性,從而上調(diào)F-actin表達(dá)以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞收縮,并下調(diào)ZO-1表達(dá)以破壞內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接,最終增加了毛細(xì)血管的通透性,促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移.Xing等[78]發(fā)現(xiàn)在PC組織和細(xì)胞系中circ-ADAM9表達(dá)升高,而miR-217表達(dá)降低,二者均與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān).作者通過裸鼠實驗發(fā)現(xiàn)沉默circ-ADAM9或過表達(dá)miR-217均可明顯抑制腫瘤生長,并且二者共同作用具有累加效應(yīng).進(jìn)一步研究表明,circ-ADAM9能夠通過ceRNA機(jī)制吸附miR-217,減少其對PRSS3的抑制作用,從而激活ERK/VEGF信號通路,促進(jìn)PC進(jìn)展.Zhang等[79]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_001653在PDAC組織中高表達(dá),它可競爭性結(jié)合miR-377,上調(diào)HOXC6的表達(dá),從而促進(jìn)PDAC細(xì)胞增殖.有趣的是,新近的一項研究表明,circRNAs可通過多種途徑起作用.Wong等[80]發(fā)現(xiàn)circFOXK2在PDAC中高表達(dá).CircFOXK2一方面作為分子誘餌吸附miR-942,解除其對下游靶標(biāo)的抑制,促進(jìn)ANK1、GDNF和PAX6表達(dá)；另一方面又與RNA結(jié)合蛋白YBX1和hnRNPK相互作用,增強(qiáng)癌基因NUF2和PDXK的表達(dá),二者共同作用的結(jié)果促進(jìn)了PC細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移.3.6 膽囊癌 膽囊癌(gallbladder cancer,GBC)是最常見的膽道上皮惡性腫瘤,其惡性程度高,且較晚出現(xiàn)臨床癥狀[81].手術(shù)切除可以使早期患者獲得根治,但對晚期GBC患者仍缺乏有效的治療方法.目前關(guān)于GBC與circRNAs的研究不多,但意義不容忽視.

Huang等[82]研究證實發(fā)現(xiàn),circERBB2在GBC組織中的表達(dá)上調(diào),其高表達(dá)與GBC患者預(yù)后差密切相關(guān).他們還發(fā)現(xiàn),不同于miRNA海綿,過表達(dá)的circERBB2在核仁中富集,通過調(diào)控PA2G4的核仁定位,增強(qiáng)TIFIA與PolI之間相互作用來調(diào)控核糖體DNA的轉(zhuǎn)錄和GBC細(xì)胞增殖.Wang等[83]通過對GBC組織和相應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行RNA序列分析,發(fā)現(xiàn)circFOXP1(hsa_circ_0008234)在GBC組織中表達(dá)明顯上調(diào),其高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及預(yù)后不良呈正相關(guān).研究表明circFOXP1通過促進(jìn)RNA結(jié)合蛋白PTBP1從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的易位,上調(diào)PKLR的表達(dá)并增強(qiáng)其穩(wěn)定性,從而促進(jìn)Warburg效應(yīng),導(dǎo)致GBC細(xì)胞惡性增生.此外,他們還證實circFOXP1可通過海綿樣吸附miR-370上調(diào)PKLR的表達(dá),促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展.

4 結(jié)論

circRNAs具有種類豐富、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、高度保守性、組織特異性及時序特異性等特征,近年來,作為非編碼RNA家族中的一個新研究熱點,其在消化系惡性腫瘤中的作用已得到越來越多研究的證實.但目前circRNAs僅有通過ceRNA機(jī)制充當(dāng)miRNA海綿發(fā)揮作用這一功能相對明確,其它的直接作用及間接調(diào)控機(jī)制我們?nèi)灾跎?對其具體的生物學(xué)功能及作用我們的認(rèn)識仍十分有限,相信在未來,隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,circRNAs作為消化系惡性腫瘤診斷及預(yù)后的“Biomarker”和新治療靶點將發(fā)揮越來越重要的作用.