胡 洋，楊 奕，楊子毅

(江南大學藥學院，江蘇 無錫 214122)

發(fā)熱是兒童臨床上的常見病和多發(fā)病。據(jù)報道，發(fā)熱病人中，兒童患者占50%，發(fā)熱患兒占兒科醫(yī)生患者的30%[1-2]，若不及時治療，易引起患兒高熱驚厥，增加呼吸負擔，甚至發(fā)生生命危險。布洛芬是一種抗炎、鎮(zhèn)痛和解熱作用的非甾體抗炎藥，廣泛用于治療發(fā)燒和輕度至中度疼痛，是推薦使用療效明確、安全性高的兒童退燒藥[3]。作用機制是通過抑制環(huán)氧化酶起作用，減少前列腺素的合成，使下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞異常升高的體溫調(diào)定點恢復到正常水平而產(chǎn)生退熱作用。這類藥物只能使發(fā)熱者的體溫下降，而對正常體溫沒有影響[4-5]。

國內(nèi)市場布洛芬劑型包括片劑、膠囊、混懸滴劑[6]，各產(chǎn)品臨床治療效果低效同質(zhì)化現(xiàn)象嚴重，部分制劑物理穩(wěn)定性較差，且國內(nèi)尚無通過一致性評價的兒童用布洛芬制劑。國外布洛芬兒童用口服制劑發(fā)展相對成熟，其中，強生公司的布洛芬混懸液“美林(Motrin?)”療效明確且市場反饋良好。因此，有必要研究美林在大鼠體內(nèi)藥代動力學，以期對國內(nèi)兒童用布洛芬制劑的開發(fā)提供參考。本研究通過灌胃給予大鼠同等劑量美林，并建立專屬性強，靈敏度和準確度高的高效液相色譜法測定布洛芬血藥濃度，考察美林體內(nèi)藥代動力學特征。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

KQ-200KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SHK-Ⅲ 循環(huán)水式多用真空泵，鄭州科泰實驗設備有限公司；Centrifuge 5424R高速冷凍離心機，德國Eppdndorf公司；Agilent 1260 高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；移液槍，DRAGONLAB公司；氮吹儀，上海那艾精密儀器有限公司；旋渦混合器，無錫沃信儀器制造有限公司；毛細管，南京金留化玻儀器有限責任公司；灌胃針，深圳市恒銘金屬制品有限公司；注射器，江蘇恒康醫(yī)療器械有限公司；空氣壓縮泵，臺州市奧突斯工貿(mào)有限公司。

美林，上海強生制藥有限公司；布洛芬，山東新華制藥股份有限公司；吲哚美辛，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲基叔丁基醚(AR)，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇(AR)，國藥集團化學試劑有限公司；肝素鈉，國藥集團化學試劑有限公司；乙腈(HPLC)，美國TEDIA公司；磷酸(AR)，國藥集團化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀，國藥集團化學試劑有限公司；娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司。

1.2 實驗動物

健康SPF級SD雄性大鼠36只，重量約為190～210 g，購買于昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司。實驗倫理審核編號為JN.No20181115S0181225[245]。

1.3 實驗方法

1.3.1 給藥方案與血漿樣品采集

給藥方案：根據(jù)兒童布洛芬混懸液Motrin?臨床給藥劑量，確定兒童劑量為6 mg/kg，折算成大鼠給藥劑量為37.5 mg/kg(以布洛芬計)，采用灌胃方式給藥，給藥前12 h禁食不禁水。根據(jù)大鼠實際體重給藥，給藥前稱重并標號。

血漿樣品采集：給藥后5 min、10 min、20 min、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h時，使用毛細管于眼底靜脈叢取血約0.3 mL，置于預先肝素化的1.5 mL尖底離心管中，4000 rpm離心10 min，移取上層血漿于未肝素化離心管中，置于-4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 血漿樣品的處理

內(nèi)標溶液的配制：精密稱取吲哚美辛0.04 g置于100 mL容量瓶中，加入適量甲醇超聲溶解，冷卻至室溫后，用甲醇定容至刻度線。用移液管吸取1 mL上述溶液至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，即得濃度為40 μg/mL的內(nèi)標溶液。

血漿樣品的處理：取內(nèi)標溶液(40 μg/mL 吲哚美辛)、布洛芬溶液20 μL加入10 mL離心管中，并加入100 μL血漿樣品，渦旋1 min混勻；加入酸化試劑(0.2 mol/L鹽酸)100 μL，渦旋2 min；再加入3 mL甲基叔丁基醚，渦旋10 min；4000 rpm離心10 min后，取上清液2.5 mL至5 mL離心管，使用氮吹儀在40 ℃下吹干；加入200 μL 70%甲醇-水復溶，渦旋5 min后12000 rpm離心10 min，取上清液100 μL進樣，采用高效液相色譜儀測定血藥濃度。

1.3.3 布洛芬體內(nèi)分析方法學考察

(1)色譜條件

采用高效液相色譜法(HPLC)測定布洛芬血藥濃度。色譜條件：Agilent?C18UPLC Proshell色譜柱(4.6×50 mm，2.7 μm)；流速：0.8 mL/min；進樣體積：10 μL；檢測波長: 220 nm；柱溫：40 ℃。流動相：磷酸二氫鉀(88 mmol/L，pH 2.5):乙腈=50:50(V/V)。

(2)專屬性實驗

按照血漿樣品處理方法，分別處理空白血漿、含藥血漿、含內(nèi)標血漿樣品，在選定的色譜條件下，分別進樣，記錄色譜圖。

(3)線性和定量限實驗

線性：分別配制濃度為4 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、500 μg/mL的布洛芬溶液，按照血漿樣品處理方法處理生物樣品。并按“2.3.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。

定量限：加入不同濃度布洛芬溶液，處理血漿樣品，按“2.3.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，計算信噪比。信噪比等于10時，血藥濃度為定量下限。

(4)精密度與準確度實驗

分別配制濃度為10 μg/mL、100 μg/mL、400 μg/mL的布洛芬溶液，按照血漿樣品處理方法處理生物樣品，配制為高、中、低三個濃度質(zhì)控(QC)樣品，血藥濃度分別為QC-L：2 μg/mL、QC-M：10 μg/mL、QC-H：80 μg/mL，每個濃度QC樣品平行處理三份，按“2.3.1”項下操作進樣，記錄色譜圖，計算精密度與準確度。

(5)提取回收率實驗

分別配制濃度為10 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL的布洛芬溶液，按血漿樣品處理方法處理生物樣品，配制不同血藥濃度的血漿樣品，分別為高(100 μg/mL)、中(20 μg/mL)、低(2 μg/mL)三個血藥濃度，每個濃度樣品平行處理三份，按“2.3.1”項下操作進樣，記錄色譜圖，此時藥物峰面積記為A1，內(nèi)標峰面積記為B1。

按照血漿樣品處方方法處理生物樣品，內(nèi)標溶液(40 μg/mL)在加入甲基叔丁基醚并離心后，再加入。按“2.3.1”項下操作進樣，記錄色譜圖，此時藥物峰面積記為A2，內(nèi)標峰面積記為B2。

藥物提取回收率=A1/A2×100%

內(nèi)標提取回收率=B1/B2×100%

(6)穩(wěn)定性試驗

酸化穩(wěn)定性：按照血漿樣品處理方法處理生物樣品，加入酸化試劑(0.2 mol/L鹽酸)后，分別于0 h、2 h、4 h加入甲基叔丁基醚，再進行渦旋、離心、吹干和復溶。按“2.3.1”項下操作進樣，記錄色譜圖，測定不同時間血藥濃度，計算RSD。

復溶穩(wěn)定性：按照血漿樣品處理方法處理生物樣品，將復溶樣品分別于復溶后0 h、4 h、8 h、12 h進樣，記錄色譜圖，測定不同時間血藥濃度，計算RSD。

1.3.4 體內(nèi)藥代動力學分析

根據(jù)大鼠灌藥后各時間點所測得的實際血藥濃度，繪制血藥濃度-時間曲線，并用藥動學軟件DAS 3.2.8軟件計算主要藥動學參數(shù)，評價兒童用布洛芬混懸液美林得體內(nèi)藥動學特征。

2 結(jié)果與討論

2.1 體內(nèi)分析方法學的建立

2.1.1 專屬性

按“1.2.3(2)”項下操作，色譜圖如圖1所示。內(nèi)標峰與藥物峰分離度>1.5，保留時間分別為7.0 min、7.7 min，與空白血漿內(nèi)源性物質(zhì)互不干擾。符合生物樣品測定要求。

圖1 專屬性色譜圖Fig.1 Specific chromatogram

2.1.2 線性與定量限

按“1.2.3(3)”項下操作，計算體內(nèi)分析方法線性范圍。以布洛芬血藥濃度為橫坐標，布洛芬與內(nèi)標(40 μg/mL 吲哚美辛)峰面積比值為縱坐標，用加權(1/X2)最小二乘法進行計算，得到標準曲線方程。經(jīng)計算得到血漿中IBU標準曲線方程分別為Y1=0.0508X1+0.0030，R2=0.9996；Y2=0.0577X2+0.0094，R2=0.9987；Y3=0.0618X3-0.0012，R2=0.9998，標準曲線中R2>0.99，符合要求，故IBU血藥濃度線性范圍為0.8～100 μg/mL。

按“1.2.3(3)”項下操作，測得IBU血藥濃度定量下限(LLOQ)為0.8 μg/mL。

2.1.3 精密度與準確度

按“1.2.3(4)”項下操作，計算質(zhì)控樣品低(QC-L)、中(QC-M)、高(QC-H)濃度樣品準確度與精密度。結(jié)果顯示，QC-L、QC-M、QC-H精密度(RSD)分別為5.37%、7.83%、3.36%，均小于15%；準確度分別為111.56%～119.14%、86.45%～100.25%、99.44%～103.67%，QC-L樣品測定結(jié)果在80%～120%范圍內(nèi)，QC-M與QC-H樣品測定結(jié)果在85%～115%范圍內(nèi)，符合質(zhì)量標準，表明體內(nèi)分析方法的精密度與準確度符合要求。

2.1.4 提取回收率

按“1.2.3(5)”項下操作處理樣品，并進樣、記錄色譜圖，計算提取回收率。結(jié)果顯示，布洛芬在低、中、高三個濃度下提取回收率為59.87%±17.71%、71.60%±9.45%、82.02%±6.57%，對應內(nèi)標提取回收率為52.46%±9.69%、56.57±8.28%、54.73%±5.39%。布洛芬與內(nèi)標提取回收率>50%，符合要求，表明甲基叔丁基醚可以用作提取溶劑。

2.1.5 穩(wěn)定性

酸化穩(wěn)定性：按“1.2.3(6)”項下操作處理樣品，并進樣、記錄色譜圖，計算血藥濃度。結(jié)果顯示，0 h、2 h、4 h血藥濃度分別為21.30 μg/mL、19.72 μg/mL、20.92 μg/mL，與0 h相比，準確度分別為92.58%、98.22%，血藥濃度較穩(wěn)定，符合要求。

復溶穩(wěn)定性：按“1.2.3(6)”項下操作處理樣品，并進樣、記錄色譜圖，計算血藥濃度。結(jié)果顯示，0 h、4 h、8 h、12 h血藥濃度分別為21.30 μg/mL、20.71 μg/mL、19.09 μg/mL、22.07 μg/mL，與0 h相比，準確度分別為97.23%、89.62%、103.62%，血藥濃度較穩(wěn)定，符合要求。

2.2 藥動學數(shù)據(jù)分析

按“1.2.1”項下方案給藥，并按“1.2.3(1)”項下操作測定大鼠體內(nèi)不同時刻血藥濃度，血藥濃度-時間數(shù)據(jù)如表1所示，藥時曲線如圖2所示。

表1 美林灌胃后大鼠各時血藥濃度Table 1 Blood concentrations of rats at various times after intragastric administration of Motrin?

圖2 大鼠灌胃后制劑的平均血藥濃度-時間曲線(Mean±SD，n=6)Fig.2 Mean plasma concentration-time curve of preparations after intragastric administration in rats (Mean ± SD, n=6)

由表1可看出制劑進入大鼠體內(nèi)的吸收行為存在個體間差異，Rat-3和Rat-4整體血藥濃度偏低。圖2可看出平均血藥濃度隨著時間變化的趨勢，表明藥物在1 h左右達到最大血藥濃度(43.98±16.49)μg/mL，藥物在胃中快速釋放并吸收。此外，對于口服Motrin?混懸液的動物組，樣品血藥濃度數(shù)據(jù)大多數(shù)均在分析方法的LLOQ之上，極少數(shù)QC樣品不合格，表明測定血藥濃度數(shù)據(jù)準確反映出體內(nèi)真實血藥濃度。時間-血藥濃度數(shù)據(jù)經(jīng)DAS 3.2.8軟件處理，主要藥動學參數(shù)如表2所示。

由表2可知，Tmax為(1.21±0.64)h，表明制劑在體內(nèi)迅速釋放并吸收；最大血藥濃度為(49.53±15.29)μg/mL，藥物半衰期為(4.51±3.20)h，0～t時間，進入人體內(nèi)藥物量為(343.49±96.16)μg/mL·h-1，0～∞時間，藥物進入人體量為(352.37±87.28)μg/mL·h-1，表明藥物在較短時間內(nèi)達到最大血藥濃度并吸收，起效快，藥效維持時間長。

3 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，布洛芬和吲哚美辛HPLC圖譜表現(xiàn)出較好的峰形，主藥峰、內(nèi)標峰和血漿內(nèi)源性物質(zhì)峰分離度好。布洛芬在血藥濃度0.8～100 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關系，精密度、準確度、提取回收率和穩(wěn)定性均符合要求。美林藥動學參數(shù)數(shù)據(jù)表明，制劑進入體內(nèi)，個體間存在吸收差異。對6只大鼠時間-血藥濃度數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，Tmax、Cmax分別為(1.21±0.64)h、(49.53±15.29)μg/mL，AUC0-t和AUC0-∞分別為(343.49±96.16)μg/mL·h-1、(352.37±87.28)μg/mL·h-1，表明制劑進入體內(nèi)能夠較快地發(fā)揮藥效、更長時間地維持較高的血藥濃度。從臨床需要來看，美林在大鼠體內(nèi)藥代動力學的初步研究可為國內(nèi)兒童用布洛芬制劑的開發(fā)提供參考。