唐曉麗，楊霖，劉悅，牛芬溪，方芳*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010

潛陽(yáng)封髓丹為潛陽(yáng)丹封髓丹合方，潛陽(yáng)丹出自《醫(yī)理真?zhèn)鳌罚馑璧ぷ钤缫?jiàn)于《御藥院方》，復(fù)方由黑附片、醋龜甲、黃柏、炙甘草和砂仁組成。臨床觀(guān)察顯示，潛陽(yáng)封髓丹漱口并口含對(duì)腎陽(yáng)不足型腫瘤患者化療后出現(xiàn)的口腔黏膜炎具有改善作用，能提高卡氏評(píng)分(KPS評(píng)分)，縮短化療致口腔黏膜炎的出現(xiàn)時(shí)間，減輕疼痛，提升患者的生活質(zhì)量[5]。本實(shí)驗(yàn)采用5-氟尿嘧啶(5-FU)聯(lián)合機(jī)械劃傷致金黃地鼠口腔黏膜炎的模型[6]，觀(guān)察潛陽(yáng)封髓丹對(duì)化療致金黃地鼠口腔黏膜炎的影響，為臨床上化療致口腔黏膜炎的病人用藥提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只SPF級(jí)金黃地鼠，雄性，8～9周齡，體質(zhì)量130～150 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0011]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物室進(jìn)行[SYXK(京)2016-0038]，每籠飼養(yǎng)4只金黃地鼠。飼養(yǎng)條件為室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度(50%±5%)，12 h/12 h光照日夜循環(huán)，動(dòng)物自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，動(dòng)物處死方式為腹主動(dòng)脈取血。動(dòng)物許可證號(hào)為NO.11400700319709。

1.2 試藥與儀器

潛陽(yáng)封髓丹提取物由首都醫(yī)科大學(xué)提供，處方組成為黑附片10 g、龜板30 g、黃柏10 g、炙甘草10 g、砂仁10 g，均購(gòu)自北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房，采用煎煮法制成1 g生藥/mL的濃縮液備用；5-FU(美國(guó)MedChem Express公司，批號(hào)：HY-90006/CS-0993)；IL-1β、TNF-αELISA測(cè)定試劑盒(武漢博士德生物公司)；MDA、SOD試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

Bead Ruptor 多樣品研磨珠均質(zhì)儀(OMIN international，USA)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(BMG LABTECH，Germany)；高速低溫離心機(jī)(Eppendorf AG，Hamburg，Germany)；全 景 掃 描 儀(3D Histech Pannoramic MIDI，Hungary)。

2 方法

2.1 分組及給藥

動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)分成5組，正常對(duì)照組、模型組、潛陽(yáng)封髓丹低劑量組(3.5 g·kg-1)、中劑量組(7 g·kg-1)、高劑量組(14 g·kg-1)。除正常對(duì)照組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液外，其余各組在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第1天和第2天分別腹腔注射60、40 mg·kg-1的5-FU。第4天除正常對(duì)照組外，將其余各組動(dòng)物的口腔頰囊外翻，用18號(hào)針頭以線(xiàn)性的方式從距離口腔邊緣5 mm處開(kāi)始由外到里進(jìn)行淺表劃傷頰囊，長(zhǎng)度為1 cm，深度為1 mm。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)各給藥組動(dòng)物分別給予相應(yīng)劑量的藥物，給藥方式為局部涂抹加灌胃，灌胃容積為1 mL·(100 g)-1體質(zhì)量，每天1次，持續(xù)到14 d即為實(shí)驗(yàn)結(jié)束，正常對(duì)照組、模型組動(dòng)物分別給予等體積的0.9%氯化鈉溶液。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，記錄動(dòng)物的進(jìn)食量和體質(zhì)量變化情況。

2.2 口腔頰囊宏觀(guān)分析及評(píng)分

給藥第7天和第14天，觀(guān)察各組金黃地鼠口腔頰囊劃傷部位的宏觀(guān)變化并拍照，根據(jù)口腔頰囊是否出現(xiàn)紅斑、血管擴(kuò)張、潰瘍、膿腫和糜爛等癥狀進(jìn)行評(píng)分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]如下：0分，頰囊表面紅潤(rùn)，無(wú)血管擴(kuò)張、膿腫、糜爛等現(xiàn)象；1分，頰囊表面可見(jiàn)少量紅斑，無(wú)膿腫、糜爛；2分，頰囊表面紅斑面積擴(kuò)散，血管出現(xiàn)擴(kuò)張，開(kāi)始出現(xiàn)糜爛面；3分，黏膜表面可見(jiàn)1個(gè)或多個(gè)潰瘍面，總面積在表面總區(qū)域面積的25%以下；4分，頰囊表面潰瘍面積占總區(qū)域面積的25%～50%；5分，頰囊表面幾乎完全潰爛。

2.3 組織病理學(xué)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取頰囊組織，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定。將頰囊組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，制片(4 μm)，HE染色后脫水封片，用全景掃描儀在20倍光鏡下截取對(duì)應(yīng)病變部位拍照，并根據(jù)口腔黏膜的病變部位進(jìn)行組織病理學(xué)分析。組織病理學(xué)評(píng)分根據(jù)是否存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌細(xì)胞間隙增大、萎縮或壞死，表皮層斷裂，真皮層局部結(jié)締組織成團(tuán)脫落等進(jìn)行綜合評(píng)分，如出現(xiàn)其中1種情況即積1分，每只累計(jì)總分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

2.4 生化指標(biāo)檢測(cè)

將動(dòng)物麻醉后進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，靜置，3500 r·min-1，離心5 min(離心半徑為18 cm)，分離血清后待測(cè)。按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定金黃地鼠血清中腫瘤壞死因子(TNF-α)和 白細(xì)胞介素1β(IL-1β)的含量。另取頰囊組織稱(chēng)質(zhì)量后，用1∶9體積0.9%氯化鈉溶液制成10%組織勻漿，離心并分離上清待測(cè)。按照生化試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定金黃地鼠口腔黏膜組織中超氧化歧化酶(SOD)活性和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以片植、孤植和綠籬三種方式栽植：一是片植，選擇苗木高度0.5-1.0m，冠幅0.3-0.5m，株行距0.6m×0.5m；二是孤植，選擇苗木高度1.2-1.5m，冠幅0.5-1.0m；三是綠籬方式，選擇苗木高度0.5-1.0m，冠幅0.3-0.5m,單排栽植，行距0.2m。

3 結(jié)果

3.1 潛陽(yáng)封髓丹對(duì)金黃地鼠體質(zhì)量和進(jìn)食量的影響

結(jié)果顯示，造模前各組動(dòng)物的體質(zhì)量未見(jiàn)明顯差異。與造模前動(dòng)物體質(zhì)量比較，正常對(duì)照組動(dòng)物體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)期間變化不明顯；模型組動(dòng)物在第7天體質(zhì)量明顯降低(P<0.05)，隨后逐漸恢復(fù)；潛陽(yáng)封髓丹高劑量組動(dòng)物體質(zhì)量變化不明顯，中劑量組動(dòng)物體質(zhì)量在第7天明顯降低，隨后逐漸恢復(fù)并明顯增加(P<0.01)，低劑量組動(dòng)物體質(zhì)量在第7、14天都明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 潛陽(yáng)封髓丹對(duì)金黃地鼠體質(zhì)量的影響 g

注：與實(shí)驗(yàn)前自身比較，*P<0.05，**P<0.01。

從表中可以看出，與正常對(duì)照組比較，模型組動(dòng)物的進(jìn)食量在第1～7天明顯降低(P<0.05)，在第8～14天體質(zhì)量雖有降低但未見(jiàn)明顯差異。與模型組比較，給予潛陽(yáng)封髓丹高、中劑量后，在第1～7天及第8～14天動(dòng)物的進(jìn)食量均有所增加，但未見(jiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表2。

表2 潛陽(yáng)封髓丹對(duì)金黃地鼠進(jìn)食量的影響 g

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 潛陽(yáng)封髓丹對(duì)金黃地鼠口腔頰囊宏觀(guān)評(píng)分的影響

宏觀(guān)觀(guān)察結(jié)果顯示，正常對(duì)照組頰囊組織完整，表面光滑，無(wú)紅斑、炎癥等變化。模型組動(dòng)物的口腔頰囊組織出現(xiàn)明顯的紅斑、血管擴(kuò)張、糜爛創(chuàng)面等病理變化，雖然從第7天開(kāi)始上述癥狀逐漸減輕，但至第14天仍可見(jiàn)紅斑、血管擴(kuò)張等現(xiàn)象存在；與模型組比較，給予潛陽(yáng)封髓丹中劑量組在第7天有降低損傷評(píng)分的作用，且在第14天評(píng)分降低更顯著(P<0.01)。潛陽(yáng)封髓丹高、低劑量組在第14天均可明顯降低口腔頰囊組織宏觀(guān)評(píng)分(P<0.01)，見(jiàn)表3，圖1。

表3 潛陽(yáng)封髓丹對(duì)金黃地鼠口腔頰囊宏觀(guān)評(píng)分的 影響

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。下同。

注：A.正常對(duì)照組第7天；B.模型組第7天；C.潛陽(yáng)封髓丹低劑量組第7天；D.潛陽(yáng)封髓丹中劑量組第7天；E.潛陽(yáng)封髓丹高劑量組第7天；A′.正常對(duì)照組第14天；B′.模型組第14天；C′.潛陽(yáng)封髓丹低劑量組第14天；D′.潛陽(yáng)封髓丹中劑量組第14天；E′.潛陽(yáng)封髓丹高劑量組第14天。圖1 潛陽(yáng)封髓丹對(duì)金黃地鼠口腔頰囊的宏觀(guān)影響

3.3 潛陽(yáng)封髓丹對(duì)金黃地鼠口腔黏膜組織病理變化的影響

HE染色后，對(duì)各組動(dòng)物的染色結(jié)果從表皮結(jié)構(gòu)、肌纖維細(xì)胞、結(jié)締組織、炎性細(xì)胞是否浸潤(rùn)等方面進(jìn)行組織病理學(xué)分析。結(jié)果顯示，正常對(duì)照組視野中表皮結(jié)構(gòu)完整，表皮下肌纖維排列緊密，肌纖維下疏松的結(jié)締組織中可見(jiàn)少量肥大細(xì)胞，組織未見(jiàn)其他明顯異常。與正常對(duì)照組相比，模型組表皮下可見(jiàn)部分肌細(xì)胞排列疏松，間隙增大，肌細(xì)胞間質(zhì)結(jié)締組織中存在少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及少量壞死肌細(xì)胞，胞核固縮深染，同時(shí)表皮層斷裂，真皮層局部結(jié)締組織成團(tuán)脫落，并可見(jiàn)其嗜酸性減弱，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較多，炎癥反應(yīng)明顯。與模型組相比，潛陽(yáng)封髓丹高、中、低劑量組組織中未見(jiàn)胞核固縮深染、表皮層斷裂、壞死肌細(xì)胞等現(xiàn)象，視野中表皮結(jié)構(gòu)完整正常，真皮層膠原纖維排列緊密，真皮層下疏松結(jié)締組織中可見(jiàn)少量肥大細(xì)胞滲出，炎癥反應(yīng)減輕，見(jiàn)圖2。組織病理學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組評(píng)分(0.833±0.41)比較，模型組評(píng)分(2.750±0.98)顯著升高(P<0.01)。與模型組評(píng)分比較，潛陽(yáng)封髓丹中劑量組(1.167±0.41)和低劑量組(1.333±0.52)評(píng)分明顯降低(P<0.01)(P<0.05)，潛陽(yáng)封髓丹高劑量組評(píng)分(1.500±0.84)雖有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.4 潛陽(yáng)封髓丹對(duì)金黃地鼠血清中促炎癥因子IL-1β、TNF-α的影響

結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組動(dòng)物血清中TNF-α含量明顯升高(P<0.01)，模型組動(dòng)物血清中的IL-1β含量有所增加(P<0.05)。與模型組動(dòng)物相比，潛陽(yáng)封髓丹低劑量組能明顯降低動(dòng)物血清中IL-1β的含量(P<0.01)，潛陽(yáng)封髓丹中劑量組能顯著降低動(dòng)物血清中TNF-α和IL-1β的含量(P<0.05，P<0.01)，而潛陽(yáng)封髓丹高劑量組雖然對(duì)動(dòng)物血清中TNF-α和IL-1β的含量均有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4。

3.5 潛陽(yáng)封髓丹對(duì)金黃地鼠口腔頰囊組織中SOD和MDA含量的影響

結(jié)果顯示，各組動(dòng)物口腔頰囊組織中的SOD活性未見(jiàn)顯著差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常對(duì)照組比較，模型組動(dòng)物口腔頰囊組織中的MDA含量有所升高(P<0.05)。與模型組相比，潛陽(yáng)封髓丹高劑量組的MDA含量有所下降(P<0.05)，潛陽(yáng)封髓丹低、中劑量組的MDA含量則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表5。

注：A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.潛陽(yáng)封髓丹低劑量組；D.潛陽(yáng)封髓丹中劑量組；E.潛陽(yáng)封髓丹高劑量組；黑色箭頭所示肥大細(xì)胞或炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；綠色箭頭所示少量壞死肌細(xì)胞和胞核固縮深染；紅色箭頭所示表皮層斷裂；黃色箭頭所示真皮層局部結(jié)締組織成團(tuán)脫落及嗜酸性減弱。圖2 潛陽(yáng)封髓丹對(duì)金黃地鼠口腔頰囊組織病理的影響(HE染色，×20倍)

表4 潛陽(yáng)封髓丹對(duì)金黃地鼠血清中TNF-α和 IL-1β的影響 pg·mL-1

表5 潛陽(yáng)封髓丹對(duì)金黃地鼠口腔頰囊組織中SOD和 MDA的影響

4 討論

化療是目前治療腫瘤的有效手段，口腔黏膜炎則是化療后常見(jiàn)的并發(fā)癥之一且發(fā)病率較高。接受標(biāo)準(zhǔn)劑量化療的患者，口腔黏膜炎的發(fā)病率為20%～80%，而接受大劑量化療后，發(fā)病率幾乎為100%[8]，在頭頸部癌放化療中，口腔黏膜炎的發(fā)生率更高。5-FU是1種細(xì)胞周期特異性對(duì)細(xì)胞具有毒性的抗癌藥物。臨床數(shù)據(jù)顯示，應(yīng)用5-FU進(jìn)行化療時(shí)口腔黏膜炎的發(fā)生率為28%左右[9]。主要是放化療損傷了口腔黏膜的基底細(xì)胞層，抑制新細(xì)胞的形成或已經(jīng)存在的細(xì)胞遷移到黏膜表面脫落，導(dǎo)致口腔黏膜變薄，出現(xiàn)紅斑進(jìn)而形成潰瘍?；熕幹饕菑酿つは陆M織的血管中滲透進(jìn)入口腔黏膜基底細(xì)胞中，對(duì)上皮基底層細(xì)胞功能有毒性作用并誘導(dǎo)凋亡，引起上皮層變薄和黏膜再生障礙，受損的上皮受到病原微生物的侵蝕，免疫功能降低，從而導(dǎo)致感染，因此口腔黏膜的病理變化是細(xì)胞毒藥物最常見(jiàn)的不良反應(yīng)之一[10]。

體質(zhì)量的降低與口腔黏膜損傷后影響進(jìn)食和吸收有關(guān)，因此體質(zhì)量變化可以用來(lái)評(píng)價(jià)模型成功及藥物治療作用的1個(gè)間接指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，造模后，動(dòng)物的體質(zhì)量明顯比用藥前降低，在第7天最顯著，而后逐漸恢復(fù)，而潛陽(yáng)封髓丹中劑量組動(dòng)物體質(zhì)量也有明顯降低，但體質(zhì)量降低程度明顯比模型組弱，恢復(fù)較快；潛陽(yáng)封髓丹高劑量組動(dòng)物體質(zhì)量無(wú)明顯變化。同樣，模型組動(dòng)物從造模到第7天的平均日進(jìn)食量明顯減少，給予潛陽(yáng)封髓丹高、中劑量后動(dòng)物的平均日進(jìn)食量比模型組高，這與體質(zhì)量的增加一致，提示給予上述藥物后對(duì)于劃傷加5-FU誘導(dǎo)的口腔黏膜炎有一定的緩解作用。

從口腔黏膜宏觀(guān)評(píng)分可以看出，在第7、14天時(shí)，模型組評(píng)分較高，說(shuō)明造模對(duì)金黃地鼠起到了一定的損傷作用，且在評(píng)分來(lái)看，作用比較明顯。在第14天時(shí)，給與潛陽(yáng)封髓丹各劑量組與模型組相比有明顯降低黏膜損傷評(píng)分的作用，說(shuō)明潛陽(yáng)封髓丹給藥可改善病理?yè)p傷變化，加快金黃地鼠的損傷恢復(fù)。HE染色結(jié)果提示，模型組動(dòng)物黏膜組織部分樣本中可見(jiàn)少量壞死肌細(xì)胞，胞核固縮深染；表皮層斷裂；真皮層局部結(jié)締組織成團(tuán)脫落，并可見(jiàn)其嗜酸性減弱，炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。從病理分析結(jié)果可以看出，模型組的損傷比較嚴(yán)重。給予藥物后各組均可見(jiàn)有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，程度比模型組輕，這提示潛陽(yáng)封髓丹給藥有改善病理?yè)p傷并且促進(jìn)愈合的作用。

放化療誘導(dǎo)口腔黏膜炎的病理機(jī)理涉及炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。TNF-α和IL-1β等細(xì)胞因子被認(rèn)為是炎癥標(biāo)記物，參與了5-FU誘導(dǎo)的口腔黏膜炎的發(fā)病機(jī)制。SOD是抗氧化系統(tǒng)中主要的酶類(lèi)抗氧化物之一，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化作用下產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化物，其含量的高低能反應(yīng)氧化應(yīng)激水平。Barbosa等[11]研究發(fā)現(xiàn)用5-FU誘導(dǎo)倉(cāng)鼠口腔黏膜炎，模型組動(dòng)物的黏膜組織中炎癥標(biāo)記物TNF-α、IL-1β等的表達(dá)上調(diào)，氨磷汀用藥可阻止其表達(dá)上調(diào)并降低TNF-α、IL-1β的免疫表達(dá)及免疫染色評(píng)分，從而證實(shí)了該藥物的抗炎作用，并暗示了其可能適用于治療口腔黏膜炎。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，造模處理明顯增加了金黃地鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量，潛陽(yáng)封髓丹用藥對(duì)金黃地鼠血清中的炎癥因子TNF-α和IL-1β有明顯降低的作用，同時(shí)能夠降低金黃地鼠口腔黏膜組織中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的含量，但對(duì)SOD的活性影響不大。提示潛陽(yáng)封髓丹可能是通過(guò)對(duì)抗金黃地鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平來(lái)改善5-FU加劃傷誘導(dǎo)的口腔黏膜炎的病理變化。

綜上所述，潛陽(yáng)封髓丹對(duì)劃傷加5-FU誘導(dǎo)的口腔黏膜炎有一定的改善作用，能夠降低金黃地鼠口腔頰囊組織宏觀(guān)評(píng)分，改善5-FU所致的頰囊組織病理?yè)p傷，其作用機(jī)制可能與降低金黃地鼠血清中炎癥標(biāo)記物TNF-α和IL-1β的含量，降低脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的含量有關(guān)。