孫麗娜, 張懷江, 劉孝賀, 仇貴生

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所, 遼寧興城 125100)

蘋小卷葉蛾Adoxophyesorana是蘋果、桃、櫻桃、山楂、茶、棉花和豆類等多種果樹及農(nóng)作物的主要害蟲。因其為害果樹，故果樹上的蘋小卷葉蛾又稱小黃卷葉蛾、遠(yuǎn)東卷葉蛾、蘋褐帶卷蛾(何振昌, 1997)。該害蟲的幼蟲不僅取食植物幼葉、花，還可轉(zhuǎn)果為害多個果實，甚至能啃食套塑膜袋為害果實。近年來，由于果樹產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和種植模式變化使該蟲在我國北方果區(qū)發(fā)生為害逐漸加重，為害面積也不斷擴大(胡雅輝等, 2009)。適逢多雨高濕天氣，也會導(dǎo)致該蟲的暴發(fā)(孫麗娜等, 2015a)。為了減輕該蟲對果樹造成的危害，化學(xué)防治是目前防治該蟲最有效的途徑之一。田間驗證發(fā)現(xiàn)，氯蟲苯甲酰胺、蟲酰肼、甲氧蟲酰肼、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽和虱螨脲對防治蘋小卷葉蛾均具有較好防效(孫麗娜等, 2014)。然而，由于蘋小卷葉蛾潛居于卷葉中，難以完全接觸藥劑，且有些藥劑長期施用，使該蟲產(chǎn)生了抗藥性。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)越來越多地應(yīng)用于昆蟲毒理學(xué)研究領(lǐng)域，為無參考基因組害蟲研究提供了技術(shù)支持。近年來，國內(nèi)外學(xué)者先后利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，分析了衛(wèi)生害蟲(岡比亞按蚊Anophelesgambiae)、大田作物害蟲(灰飛虱Laodelphaxstriatellus、玉米螟Ostriniafurnacalis)、蔬菜害蟲(小菜蛾P(guān)lutellaxylostella)、果樹害蟲(桔小實蠅Bactroceradorsalis)、林業(yè)害蟲(舞毒蛾Lymantriadispar)等對殺蟲劑代謝、解毒及抗藥性機制，涉及不同種類殺蟲劑如有機磷、菊酯類、二酰胺類、苯基吡唑類等(Heetal., 2012; Zhangetal., 2012; Houetal., 2014; Caoetal., 2015; Cuietal., 2017; Domingosetal., 2017)。筆者前期研究表明，我國蘋小卷葉蛾的有效防治藥劑主要有蟲酰肼、甲氧蟲酰肼、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氯蟲苯甲酰胺、虱螨脲等(孫麗娜等, 2014)。蟲酰肼、甲氧蟲酰肼和虱螨脲是昆蟲生長調(diào)節(jié)劑，作用靶標(biāo)為蛻皮激素受體，甲胺基阿維菌素苯甲酸鹽作用靶標(biāo)為氯離子通道蛋白，氯蟲苯甲酰胺的靶標(biāo)為昆蟲魚尼丁受體(www.irac-online.org)。害蟲對殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的過程，與殺蟲劑靶標(biāo)的敏感性、解毒酶的活性密切相關(guān)(高希武, 2012)。

本文采用Illumina HiSeqTM2000測序平臺開展蘋小卷葉蛾的轉(zhuǎn)錄組測序研究，挖掘?qū)μO小卷葉蛾具有較好防效的殺蟲劑的作用靶標(biāo)基因及該蟲對殺蟲劑的主要解毒代謝相關(guān)基因，為相關(guān)基因的克隆、表達及功能研究及進一步開展蘋小卷葉蛾抗藥性的分子機制和治理策略奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 害蟲飼養(yǎng)

供試蟲源采自遼寧興城(40.61°N, 120.73°E)，在實驗室內(nèi)人工氣候箱中于溫度為25±1℃、相對濕度70%±5%、光周期為16L∶8D的條件下用金冠蘋果Malusdomesticacv. Golden Delicious葉片飼養(yǎng)2代后，取卵、幼蟲、蛹和成蟲混合樣為供試材料，于液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 cDNA文庫構(gòu)建和測序

用TRIzol試劑提取蘋小卷葉蛾卵約200粒、幼蟲20頭、蛹20頭、成蟲20頭總RNA(孫麗娜等, 2015b)?？俁NA的提取、質(zhì)量分析、cDNA文庫的建立及測序工作由華大基因有限公司(深圳)完成。采用Illumina HiSeqTM2000系統(tǒng)進行測序(劉長莉等, 2013)。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用Nesoni Tools程序?qū)υ紃eads進行質(zhì)量預(yù)處理，使用Trinity v 2.0.6對得到的有效讀序(clean reads)組裝unigenes，并使用Blast2go軟件將拼接的unigenes與NCBI的NR(非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫), NT(核酸數(shù)據(jù)庫), Swiss-Prot(蛋白質(zhì)注釋信息數(shù)據(jù)庫), GO(Gene Ontology), COG(Clusters of Orthologous Groups), KOG(euKaryotic Orthologous Groups), KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫比對及信息注釋(Grabherretal., 2011)。

1.4 殺蟲劑靶標(biāo)基因的鑒定及表達模式分析

根據(jù)unigenes序列與NR, NT, Swiss-Prot, GO, COG和KEGG數(shù)據(jù)庫比對進行功能注釋，在轉(zhuǎn)錄組中搜索防治蘋小卷葉蛾常用殺蟲劑靶標(biāo)基因蛻皮激素受體、乙酰膽堿酯酶、乙酰膽堿受體、鈉離子通道、氯離子通道、γ-氨基丁酸、幾丁質(zhì)酶、魚尼丁受體基因等。以核糖體蛋白S15基因為內(nèi)參基因，參照筆者之前研究方法(Sunetal., 2016)檢測6個殺蟲劑靶標(biāo)基因在蘋小卷葉蛾不同發(fā)育時期的表達水平，基因名及引物見表1。卵為1-6日齡混合樣120粒，1-5齡幼蟲各10頭，蛹分別為2, 4, 6, 8和10日齡混樣10頭，成蟲分別為1, 3和5日齡混樣10頭。試驗于Bio-Rad CFX Connect實時熒光定量PCR儀上進行，樣品重復(fù)3次，另加3個無模板的陰性對照。反應(yīng)體系(20 μL): 1 μL稀釋10倍的cDNA(20 ng), 上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, 2×SYBR Green I 10 μL, 加ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序: 95℃ 30 s; 95℃ 10 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 40個循環(huán)。每個基因分別以2齡幼蟲中的表達量為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)2-ΔΔCt相對定量法統(tǒng)計各基因在不同發(fā)育時期的表達量差異，每個發(fā)育階段重復(fù)3次(Livak and Schmittgen, 2001)。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Primers in qPCR

1.5 解毒代謝相關(guān)基因的挖掘及代謝通路、進化關(guān)系分析

通過將unigenes序列與NR, NT, Swiss-Prot, GO, COG和KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，在轉(zhuǎn)錄組中篩選與抗藥性相關(guān)的細(xì)胞色素P450、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因等。提取序列，鑒定具有完整ORF的基因，采用MEGA6序列分析軟件中鄰接法(neighbor-joining method, NJ)構(gòu)建分子進化樹(劉長莉等, 2013; Tianetal., 2018)。同時分別按照Feyereisen (2005)、Oakeshott等(1999)、Ranson和Hemingway(2005)的方法對細(xì)胞色素P450、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶進行分類。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 20.0分析系統(tǒng)，各處理平均數(shù)經(jīng)過方差分析后，用Duncan氏新復(fù)極差法進行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 蘋小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果

經(jīng)過測序質(zhì)量控制，共得到52 962 442 clean reads，最終對轉(zhuǎn)錄組的clean data進行拼接共得到48 610條unigene，平均長度為796 bp，unigene中超過1 000 bp的數(shù)量為12 694，其不同長度的具體分布圖如圖1所示。轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)提交至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫中，登錄號為SRP143426；組裝的clean data提交至NCBI TSA數(shù)據(jù)庫(GenBank登錄號: GGMW00000000)。

圖1 蘋小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組拼接后的unigenes長度分布Fig. 1 Length distribution of the assembled unigenes in the Adoxophyes orana transcriptome

2.2 蘋小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組中unigenes的功能注釋及序列特征

將組裝得到的48 610個unigenes序列與NR, NT, Swiss-Prot, GO, COG和KEGG數(shù)據(jù)庫比對，通過選擇BLAST參數(shù)E-value不大于1e-5和HMMER參數(shù)E-value不大于1e-10且有注釋信息的unigene，結(jié)果如表2所示。根據(jù)序列同源性比對，NR數(shù)據(jù)庫中的16 803個注釋基因源自300余個物種，分布如圖2所示。其中5 428個基因與甜菜夜蛾Spodopteraexigua同源，3 308個基因與家蠶Bombyxmori同源，與2物種同源的注釋基因占總注釋基因的67.61%；其后依次是與柑橘鳳蝶Papilioxuthus、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster和岡比亞蚊Anophelesgambiae同源的基因分別為464, 321和177個，分別占總注釋基因的3.59%, 2.48%和1.37%；與其他物種同源的基因占總注釋基因的24.95%。

2.3 蘋小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組中殺蟲劑靶標(biāo)基因的預(yù)測及表達模式分析

根據(jù)蘋小卷葉蛾防治中藥劑的應(yīng)用，篩選藥劑的靶標(biāo)基因。通過比對NR, NT, Swiss-Port, KEGG數(shù)據(jù)庫注釋的序列，搜索蘋小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組中殺蟲劑靶標(biāo)基因155個(表3)，與幾丁質(zhì)酶相關(guān)的基因在蘋小卷葉蛾中數(shù)目最多，占?xì)⑾x劑靶標(biāo)unigene的47.10%。155個unigene與NCBI數(shù)據(jù)庫進行在線比對，鑒定出1個蛻皮激素受體基因、2個膽堿酯酶基因、1個氯離子通道基因、1個幾丁質(zhì)酶基因和1個魚尼丁受體基因。

qPCR結(jié)果顯示，6種靶基因在蘋小卷葉蛾不同發(fā)育階段均呈現(xiàn)不同的趨勢。隨著蘋小卷葉蛾發(fā)育蛻皮激素受體基因表達逐漸下調(diào)(圖3: A)，該基因在卵期的表達量分別是1-5齡幼蟲、蛹和成蟲期的17.68, 24.62, 29.67, 27.61, 28.60, 46.76和72.61倍(P<0.05)。乙酰膽堿酯酶1基因在3齡和5齡幼蟲中表達量較高(圖3: B)(P<0.05)；乙酰膽堿酯酶2基因則蛹期表達量最高(圖3: C)(P<0.05)。而蛹和成蟲期的氯離子通道蛋白基因表達量顯著高于卵期和幼蟲期(圖3: D)(P<0.05)。幾丁質(zhì)酶基因在3-5齡幼蟲期的表達量較高，4齡幼蟲期表達量分別是卵期、蛹期和成蟲期的22.89, 35.63和450.75倍(圖3: E)(P<0.05)。魚尼丁受體基因在蘋小卷葉蛾卵、1齡幼蟲、蛹和成蟲期的表達量較高，且在幼蟲期表達逐漸下調(diào)，其在卵期的表達量分別是4和5齡幼蟲的12.27和13.39倍(圖3: F)(P<0.05)。

表2 蘋小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組unigenes注釋統(tǒng)計Table 2 Statistical of the annotated unigenes in the Adoxophyes orana transcriptome

圖2 蘋小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組unigenes在NR數(shù)據(jù)庫中的物種分布圖Fig. 2 Species distribution of unigenes in the Adoxophyes orana transcriptome in NR database

表3 蘋小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組中殺蟲劑靶標(biāo)基因數(shù)目統(tǒng)計Table 3 Number of insecticide target genes inthe Adoxophyes orana transcriptome

2.4 蘋小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組中解毒代謝相關(guān)基因的挖掘、代謝通路及進化關(guān)系分析

蘋小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)69個羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE) unigene, 66個谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathion S-transferase, GST)unigene和205個細(xì)胞色素P450 (cytochrome P450)unigene。解毒代謝相關(guān)基因中細(xì)胞色素P450基因數(shù)目占3種解毒酶基因的71.6%，遠(yuǎn)多于羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的數(shù)量，這與細(xì)胞色素P450酶在昆蟲物質(zhì)代謝過程中極其重要的地位有關(guān)。

根據(jù)NR注釋結(jié)果與KEGG通路分析，過濾掉短片段、等位基因后，發(fā)現(xiàn)20個CarE unigene與drug metabolism-other enzymes (ko00983)通路有關(guān)。其中12個CarE unigene具有完整的ORF。

在KEGG數(shù)據(jù)庫中，31個GST unigene與drug metabolism-cytochrome P450 (ko00982)通路相關(guān)，32個GST unigene與metabolism of xenobiotics by cytochrome P450 (ko00980)通路相關(guān)，差異unigene為unigene68409_All。

人工剔除不能正確翻譯、與微生物具有高度同源性和長度小于700 bp的unigene后，從205個細(xì)胞色素P450相關(guān)的unigene中鑒定出66個P450 unigene，平均長度1 762 bp。根據(jù)KO注釋結(jié)果，對P450 unigene進行分類，其中14個unigene屬于family3, 10個屬于family4， 22個屬于family6， 8個屬于family9。通過KEGG數(shù)據(jù)庫通路分析，其中30個P450 unigene均與drug metabolism-other enzymes (ko00983), drug metabolism-cytochrome P450 (ko00982)和metabolism of xenobiotics by cytochrome P450 (ko00980)通路相關(guān)。且30個P450 unigene中12個屬于family3， 10個屬于family6， 8個屬于family9。

獲得12個具有完整開放閱讀框的蘋小卷葉蛾CarE基因，通過與其他已知昆蟲的CarEs序列進行NJ聚類分析(圖4)，結(jié)果顯示，9個基因為G類，即鱗翅目保幼激素類基因；1個為D類，即moth integument esterase withDrosophilahomologs基因，1個屬于E類即β-酯酶基因，1個屬于Gliotactin類基因。

圖3 蘋小卷葉蛾6個殺蟲劑靶標(biāo)基因的發(fā)育表達模式Fig. 3 Expression profiles of six insecticide target genes in Adoxophyes orana at different developmental stagesA: 蛻皮激素受體基因Ecdysone receptor gene; B: 乙酰膽堿酯酶1基因Acetylcholinesterase 1 gene; C: 乙酰膽堿酯酶2基因Acetylcholinesterase 2 gene; D: 氯離子通道蛋白基因Chloride channel gene; E: 幾丁質(zhì)酶基因Chitinase gene; F: 魚尼丁受體基因Ryanodine receptor gene. Eg: 卵Egg; L1-5: 分別為1-5齡幼蟲1st-5th instar larva, respectively; P: 蛹Pupa; Ad: 成蟲Adult. 以核糖體蛋白S15基因為內(nèi)參基因; 以2齡幼蟲中的表達量為標(biāo)準(zhǔn)。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，柱上不同小寫字母表示基因表達量在不同發(fā)育階段間差異顯著(P<0.05, Duncan氏檢驗)。The ribosomal protein S15 gene was used as the reference gene, and the expression level of gene in the 2nd instar larva was taken as the standard. Data in the figure are mean±SE, and different small letters above bars indicate significant difference in the gene expression level among different developmental stages (P<0.05, Duncan’s test).

AoGSTs與其他昆蟲GSTs之間的進化關(guān)系的結(jié)果表明(圖5)，AoGSTs被劃分為5個亞家族，分別為Omega, Sigma, Theta, Delta和Epsilon，基因數(shù)分別為4, 5, 1, 10和10。其中尚未發(fā)現(xiàn)有基因類屬Zeta家族基因。序列比對發(fā)現(xiàn)，CL3513.contig2 unigene與同為果樹害蟲的蘋果蠹蛾CydiapomonellaGSTd1(GenBank登錄號: ACJ23087.1)的氨基酸序列一致性最高，達81.86%。

根據(jù)ORF編碼氨基酸序列，共發(fā)現(xiàn)18個完整的P450基因，與其他27個P450基因的氨基酸序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖6)。結(jié)果表明，蘋小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組中的18個P450基因全部聚到CYP3集團(CYP3 clade)，未有P450聚集到CYP2集團(CYP2 clade)，CYP4集團(CYP4 clade)和線粒體集團(mitochondrial clade)。

圖4 基于氨基酸序列的蘋小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組CarE unigene系統(tǒng)發(fā)育分析(鄰接法)Fig. 4 Phylogenetic analysis of CarE unigene in the Adoxophyes orana transcriptomebased on the amino acid sequences (neighbor-joining method)D: Moth integument esterase with Drosophila homologs; E: Diptera β-esterases with hemipteran sister group; F: Nonlepidopteran juvenile hormone esterases and like enzymes; G: Lepidopteran JHE’s and Anopheles sister group; H: Glutactin and like enzyme; K: Uncharacterized putative neuroreceptor group; M: Gliotactin; L: Neuroligins. 菱形所標(biāo)基因為蘋小卷葉蛾CarE unigene。CarE unigenes of A. orana are marked with black rhombus. 其他基因來源物種Origin species of other genes: Aaeg: 埃及伊蚊Aedes aegypti; Dmel: 黑腹果蠅Drosophila melanogaster; Bmor: 家蠶Bombyx mori; Cfum: 云杉卷葉蛾Choristoneura fumiferana; Msex: 煙草天蛾Manduca sexta; Agam: 岡比亞按蚊Anopheles gambiae; Apol: 多音天蠶Antheraea polyphemus; Tcas: 赤擬谷盜Tribolium castaneum.

圖5 基于氨基酸序列的蘋小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組GST unigene系統(tǒng)發(fā)育分析(鄰接法)Fig. 5 Phylogenetic analysis of GST unigene in the Adoxophyes orana transcriptomebased on the amino acid sequences (neighbor-joining method)黑色圓點所標(biāo)基因為蘋小卷葉蛾GSTs基因。GST unigenes of A. orana are marked with black circles. 其他基因來源物種Origin species of other genes: Sexi: 甜菜夜蛾Spodoptera exigua; Prap: 菜粉蝶Pieris rapae; Csup: 二化螟Chilo suppressalis; Bmor: 家蠶Bombyx mori; Dant: 蔥蠅Delia antiqua; Slit: 斜紋夜蛾Spodoptera litura; Cmed: 稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis; Hvit: 黃野螟Heortia vitessoides; Lmig: 東亞飛蝗Locusta migratoria; Agam: 岡比亞按蚊Anopheles gambiae; Cpom: 蘋果蠹蛾Cydia pomonella; Pxut: 柑橘鳳蝶Papilio xuthus; Ofur: 亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis; Aper: 柞蠶Antheraea pernyi.

圖6 基于氨基酸序列的蘋小卷葉蛾轉(zhuǎn)錄組P450 unigene系統(tǒng)發(fā)育分析(鄰接法)Fig. 6 Phylogenetic analysis of CYP unigene in the Adoxophyes orana transcriptomebased on the amino acid sequences (neighbor-joining method)三角號所標(biāo)基因為蘋小卷葉蛾CYP unigene。CYP unigenes from A. orana are marked with black triangles. 其他基因來源物種 Origin species of other genes: Dpas: 歐洲防風(fēng)草結(jié)網(wǎng)毛蟲Depressaria pastinacella; Slit: 斜紋夜蛾Spodoptera litura; Bmor: 家蠶Bombyx mori; Obru: 冬尺蠖Operophtera brumata; Dsim: 擬果蠅Drosophila simulans; Dbus: 巴氏果蠅Drosophila busckii; Dmel: 黑腹果蠅Drosophila melanogaster; Zcuc: 瓜實蠅Zeugodacus cucurbitae; Csec: 白蟻Cryptotermes secundus; Agos: 棉蚜Aphis gossypii; Bman: 野桑蠶Bombyx mandarina; Papo: 阿波羅絹蝶Parnassius apollo; Dple: 帝王蝶Danaus plexippus; Cmed: 稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis; Lstr: 灰飛虱Laodelphax striatella; Nden: 綠蝦Neocaridina denticulata.

3 討論

新一代高通量測序技術(shù)已廣泛用于昆蟲分子標(biāo)記、抗藥性相關(guān)基因的挖掘、昆蟲與其他生物互作研究等方面。本研究利用Illumina測序技術(shù)對蘋小卷葉蛾的轉(zhuǎn)錄組進行測序和分析。在NR數(shù)據(jù)庫中，蘋小卷葉蛾注釋到甜菜夜蛾的序列信息最多，源于兩種昆蟲均屬鱗翅目害蟲，親緣關(guān)系相對較近。此現(xiàn)象在其他物種轉(zhuǎn)錄組研究中也得到證實，如桃小食心蟲Carposinasasalii的轉(zhuǎn)錄組中6 684個基因與家蠶Bombyxmori中的同源，占比達39.8%；梨小食心蟲Grapholitamolesta的觸角轉(zhuǎn)錄組52.2%的序列注釋到帝王蝶Danausplexippus的序列(Lietal., 2015; 孫麗娜等, 2018)。目前，尚未見蘋小卷葉蛾基因組報道，對該蟲轉(zhuǎn)錄組的測定和分析，可同時獲得多個靶標(biāo)基因、解毒代謝相關(guān)基因的序列信息，加速殺蟲劑對此害蟲作用機制的研究。

本研究qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘋小卷葉蛾殺蟲劑靶標(biāo)基因的表達模式與其他害蟲存在差異。蘋小卷葉蛾EcR基因在卵期的表達量最高(圖3: A)，而茶尺蠖Ectropisobliqua和煙粉虱Bemisiatabaci的EcR基因均在成蟲期表達量最高(李良德等, 2015; 楊春紅等, 2016)。另有研究發(fā)現(xiàn)在黑腹果蠅和西方蜜蜂EcR基因分別編碼3個和2個異構(gòu)體，且功能不同(Benderetal.,1997; Melloetal., 2014)。Mello等(2014)發(fā)現(xiàn),在蜜蜂幼蟲和蛹發(fā)育過程中異構(gòu)體A高表達，而在胚胎發(fā)育過程中異構(gòu)體B高表達，這表明不同異構(gòu)體在不同發(fā)育時期可能存在不同的調(diào)控作用。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在蘋小卷葉蛾中尚未發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體，蘋小卷葉蛾中是否也存在其他異構(gòu)體，還有待進一步證實。有機磷殺蟲劑通過抑制害蟲乙酰膽堿酯酶的活性殺害昆蟲。蘋小卷葉蛾Ache1在3齡幼蟲期表達最高(圖3: B)，而Ache2在蛹期表達最高(圖3: C)。蓖麻蠶Philosamiacynthiaricini乙酰膽堿酯酶基因Pcrace2在成蟲期表達量最高(劉娟等, 2013)，褐色橘蚜Aphiscitricidus乙酰膽堿酯酶基因Tcace1和Tcace2從若蟲到成蟲期表達量逐漸升高(牟星, 2017)。對于蘋小卷葉蛾幾丁質(zhì)酶基因，其在3-5齡幼蟲期持續(xù)高表達(圖3: E)，不同于小菜蛾P(guān)xyChi基因，其在成蟲期表達量最高( 申建梅等, 2018)；與棉鈴蟲Helicoverpaarmigera和舞毒蛾相似，HaCHT4基因在棉鈴蟲2齡幼蟲期的表達量最高，舞毒蛾中該基因以2齡與4齡幼蟲期表達水平最高(劉建紅等, 2015; 麥麥提艾力·阿卜杜納斯?fàn)柕? 2019)。二酰胺類殺蟲劑是目前防治鱗翅目害蟲較流行的殺蟲劑，其作用靶標(biāo)昆蟲魚尼丁受體。該類藥劑正在果樹害蟲的防治中推廣應(yīng)用，其對蘋小卷蛾防治效果較好。蘋小卷葉蛾魚尼丁受體基因在卵中表達量最高(圖3: F)，這與已報道的果樹鱗翅目害蟲該基因的表達模式存在較大差異。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)桃小食心蟲和梨小食心蟲中，RyR基因在蛹期和成蟲期均高表達，且雄蟲中的表達量顯著高于雌蟲(孫麗娜等, 2015b; Sunetal., 2016)。殺蟲劑靶標(biāo)基因在不同發(fā)育時期的表達豐度與藥劑活性是否存在相關(guān)性，該研究也有待進一步研究。

害蟲長期暴露于殺蟲劑中易產(chǎn)生抗藥性，CarEs, GST和細(xì)胞色素P450與害蟲抗藥性密切相關(guān)，并稱為昆蟲三大解毒酶系，均屬于多基因編碼的超家族酶系。根據(jù)Oakeshott等(1999)的分類方法，對蘋小卷葉蛾羧酸酯酶的進化關(guān)系進行分析。與黑腹果蠅、岡比亞按蚊、白粉虱和飛蝗不同，本文鑒定的蘋小卷葉蛾中具有完整開放閱讀框的12個羧酸酯酶基因中的9個基因為G類基因，即鱗翅目昆蟲保幼激素酯酶基因，類屬于第二功能組，與激素降解相關(guān)；CL4070.contig2屬于E類(圖4)，即β酯酶。β酯酶、保幼激素酯酶屬于分泌型催化酯酶，β酯酶基因的數(shù)目在昆蟲中發(fā)現(xiàn)得并不多，在鱗翅目昆蟲的主要功能是降解性信息素(Durandetal., 2010; 張建琴, 2014)。研究認(rèn)為第一功能組(A-C簇)主要由α酯酶組成，這些酶類可對有毒物質(zhì)進行代謝解毒，已有報道表明一些α酯酶參與昆蟲對有機磷殺蟲劑的抗性，然而在鑒定的所有完整開放閱讀框基因中并未發(fā)現(xiàn)A-C簇的CarEs基因，故本文未把A-C簇的其他基因列入。

GST主要分3類，Ⅰ類為Delta亞家族，Ⅱ類包括Sigma, Theta, Zeta和Omega 4個亞家族，Ⅲ類為Epison亞家族(Ranson and Hemingway, 2005)。本文鑒定的AoGSTs被劃分為5個亞家族，分別為Omega, Sigma, Theta, Delta和Epsilon，多數(shù)AoGSTs分布在Delta和Epsilon家族，多于蘋果蠹蛾GSTs在兩個家族的分布(郭金夢, 2018)。通過比較敏感和抗性品系昆蟲體內(nèi)解毒酶活性發(fā)現(xiàn)，害蟲抗藥性產(chǎn)生可能與機體內(nèi)GSTs活性提高相關(guān)(Huangetal., 1998; Vontasetal., 2001; Heetal., 2009)。Li等(2007)研究發(fā)現(xiàn)，GSTs活性提高包括基因擴增和基因過量表達2種作用機制，并且介導(dǎo)昆蟲抗殺蟲劑的GSTs基因主要來自Delta和Epsilon 2個亞家族，這兩個家族被認(rèn)為是昆蟲抗藥性形成的主要原因(Shietal., 2012)。研究認(rèn)為埃及伊蚊、黑腹果蠅和岡比亞按蚊對DDT的抗藥性可能分別被AaGSTD1, DmGSTD1和AgGSTE2所誘導(dǎo)形成，家蠅Muscadomestica對有機磷類殺蟲劑的抗藥性由MdGSTD3介導(dǎo)產(chǎn)生(Wangetal., 1991; Grantetal., 1992; Tang and Tu, 1994; Lumjuanetal., 2005)。在果樹鱗翅目害蟲的抗藥性研究中，Liu等(2014)研究發(fā)現(xiàn)蘋果蠹蛾CpGSTd1基因在毒死蜱和高效氯氟氰菊酯代謝解毒過程中扮演重要角色。本研究中蘋小卷葉蛾中GST基因CL3513.contig2與CPGSTd1的氨基酸序列一致度最高，推測蘋小卷葉蛾中的CL3513.contig2在有機磷和擬除蟲菊酯類藥劑的代謝中也起到舉足輕重的作用。

P450參與多種殺蟲劑的代謝，是導(dǎo)致昆蟲產(chǎn)生抗藥性的關(guān)鍵基因之一。根據(jù)P450成員間的進化及親緣關(guān)系，P450可分為CYP2集團(CYP2 clade), CYP3集團(CYP3 clade), CYP4集團(CYP4 clade)和線粒體P450集團(mitochondrial P450 clade)(Feyereisen, 2006)。昆蟲所特有的P450家族主要有CYP6, CYP9, CYP12, CYP18和CYP28，其中CYP6, CYP9和CYP28屬于CYP3集團，CYP12屬于線粒體集團，CYP18屬于CYP2集團(Feyereisen, 2005; Lietal., 2007; Daietal., 2014)。CYP3集團是包含昆蟲P450家族最多的集團，與昆蟲代謝外源物質(zhì)相關(guān)的家族屬于此集團，本研究中鑒定的18個CYP基因均屬于CYP3集團基因，除CL1119.contig2外，其余17個分屬于CYP6和CYP9家族基因。根據(jù)所屬通路分析，這18個基因均可參與藥物代謝，與害蟲的抗藥性密切相關(guān)。