陳 昊, 羅巧玉, 馬秋雨, 初 旭, 袁 超, 劉 穎, 余 偉,吳松青, 王 榮, 梁光紅, 張飛萍, 胡 霞,*

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院, 福州 350002; 2. 福建農(nóng)林大學(xué), 生態(tài)公益林重大有害生物防控福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350002)

松墨天牛Monochamusalternatus，隸屬鞘翅目(Coleoptera)天?？?Cerambycidae)墨天牛屬M(fèi)onochamus，幼蟲蛀食衰弱木的樹干和大枝條，加劇樹勢衰弱，嚴(yán)重時(shí)甚至造成樹木死亡；成蟲通過取食健康松樹枝條補(bǔ)充營養(yǎng)，攜帶并傳播松材線蟲病(王玲萍, 2004; Wuetal., 2013)。松材線蟲病是由松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus感染引起的嚴(yán)重林業(yè)病害，被稱為“松樹的癌癥”(寧眺, 2004; 張鍇等, 2010)，在我國的分布范圍已擴(kuò)大至17個(gè)省市，造成巨大的林業(yè)經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重破壞了自然景觀和生態(tài)環(huán)境(潘宏陽等, 2009)。

漆酶(Laccase, EC 1.10.3.2)是藍(lán)色多酚氧化酶家族中的最大組成部分，底物范圍廣泛，可催化多種芳香化合物的氧化(Baldrian, 2006; 于孟蘭和倪金鳳, 2014)。漆酶也是兩大木質(zhì)素酶系中的重要一類，在沒有過氧化氫的情況下，漆酶可以通過溶解氧直接氧化底物(池玉杰和伊洪偉, 2007)。漆酶在自然界廣泛存在，真菌、細(xì)菌、高等植物和昆蟲中均已找到漆酶(Hulloetal., 2001; Gavnholt and Larsen, 2002; Piscitellietal., 2011; Virketal., 2012)。物種不同，漆酶功能也各有不同。植物漆酶主要參與木質(zhì)素的合成與降解(Gavnholt and Larsen, 2002)，細(xì)菌漆酶則具有黑色素生成、尿酸氧化、抗紫外線輻射等多種功能(Tamakietal., 2010; Yeetal., 2010)。真菌漆酶與色素生成和木質(zhì)素降解等功能密切相關(guān)(Januszetal., 2013; Wang SNetal., 2018)，同時(shí)真菌漆酶還可以幫助真菌病原菌克服寄主植物抗性，使病菌免受丹寧酸等植物防衛(wèi)素的影響，從而增強(qiáng)其侵染能力(Kimetal., 1995)。

在昆蟲漆酶的研究中，根據(jù)其分布、表達(dá)能力和功能的不同主要分為漆酶1(Lac1)和漆酶2(Lac2)。昆蟲Lac2廣泛存在于昆蟲的角質(zhì)層，并在蛹期和羽化階段高水平表達(dá)(Hattorietal., 2010)。Arakane等(2005)對(duì)赤擬谷盜Triboliumcastaneum漆酶2基因(TcLac2)進(jìn)行了RNA干擾實(shí)驗(yàn)(RNAi)，結(jié)果赤擬谷盜無法完成表皮硬化和色素沉著，羽化過程受到嚴(yán)重干擾。松墨天牛MaLac2的RNAi實(shí)驗(yàn)取得與赤擬谷盜TcLac2相似的結(jié)果，表明MaLac2在松墨天牛表皮硬化、色素沉著中發(fā)揮了關(guān)鍵作用(Niuetal., 2008)。昆蟲Lac1則主要分布在昆蟲的腸道、馬氏管、唾液腺和脂肪體等部位(Amenyaetal., 2010; Futahashietal., 2010)；在赤擬谷盜、煙草天蛾Manducasexta、岡比亞按蚊Anophelesgamibiae、黑尾葉蟬Nephotettixcincticeps和小菜蛾P(guān)lutellaxylostella等昆蟲中均發(fā)現(xiàn)了昆蟲Lac1基因，并認(rèn)為其可能在食物消化、食物脫毒、離子代謝、自身免疫等方面發(fā)揮了重要作用(Dittmeretal., 2004; Arakaneetal., 2005; Gormanetal., 2008; Hattorietal., 2010; Wang ZHetal., 2018)。目前對(duì)松墨天牛Lac1的研究尚無報(bào)道，其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能是否與其他昆蟲漆酶一致均有待研究。

本研究基于課題組前期獲得的松墨天牛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Wuetal., 2016)，克隆獲得了松墨天牛MaLac1基因全長序列，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，繼而利用原核表達(dá)載體合成MaLac1蛋白，并通過qPCR檢測了MaLac1基因在松墨天牛不同生長發(fā)育階段腸道中的表達(dá)情況，該結(jié)果將為揭示松墨天牛MaLac1基因功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

馬尾松蟲害木采集于福建省連江琯頭鎮(zhèn)(26.150°N, 119.593°E)，將蟲害木鋸成長約1 m的木段，置于長×寬×高=1.5 m×1.5 m×1.0 m的養(yǎng)蟲籠內(nèi)。低齡幼蟲采自蟲害木樹皮，此階段幼蟲蛀食韌皮部；老熟幼蟲和蛹直接采自受害馬尾松木段內(nèi)松墨天牛幼蟲坑道及蛹室，此階段幼蟲蛀食木質(zhì)部；成蟲則取自養(yǎng)蟲籠內(nèi)羽化10 d的成蟲，用新鮮松枝喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度26～28℃，相對(duì)濕度70%～80%。

1.2 樣品總RNA的提取及cDNA的合成

取1.1節(jié)中松墨天牛低齡幼蟲、老熟幼蟲、蛹、雌成蟲和雄成蟲各10頭，在顯微鏡下切開頭部和尾部，再用昆蟲針挑出腸道，按照Trizol試劑說明書進(jìn)行總RNA提取，RNA置于-80℃保存。以1 μg總RNA為模板，按照BestarTMqPCR RT Kit說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體系為10 μL，合成cDNA第1鏈，在-20℃條件下保存，用于后續(xù)的定量表達(dá)分析。另取松墨天牛老熟幼蟲新鮮腸道組織，按照Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書合成cDNA第1鏈，用于基因中間片段擴(kuò)增。

1.3 松墨天牛MaLac1基因中間片段的擴(kuò)增

參照轉(zhuǎn)錄組序列信息(Wuetal., 2016)，根據(jù)注釋信息篩選出松墨天牛漆酶基因，由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)并合成引物(表1)，以1.2節(jié)中合成的松墨天牛老熟幼蟲新鮮腸道組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(50 μL): ddH2O 15 μL, 2×Ex Taq Buffer(TaKaRa) 25 μL, dNTP Mix(10 mmol/L) 1 μL, Ex Taq(TaKaRa) 1 μL, cDNA第1鏈5 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1.5 μL。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性2 min; 94℃變性20 s, 58℃退火20 s, 72℃延伸30 s, 共40個(gè)循環(huán)。參照DNA純化試劑盒(OMEGA)說明書，將產(chǎn)物切膠回收并純化。將純化產(chǎn)物連接至pMD18T載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，并通過MEGA 6.0序列比對(duì)分析進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組序列驗(yàn)證。

1.4 松墨天牛MaLac1基因的全長RACE

根據(jù)1.3節(jié)中松墨天牛MaLac1基因的中間片段序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3條特異性5′RACE引物GSP-1, GSP-2和GSP-3和2條特異性3′RACE引物3′978-1和3′978-2分別克隆MaLac1基因的5′端序列和3′端序列(表1)?；虻?′RACE使用Superscript II RT 酶和引物GSP-1對(duì)總RNA合成目的基因cDNA第1鏈，再用RNase進(jìn)行處理。采用DNA Purification System: GLASSMAX DNA Isolation Spin Cartridges完成對(duì)cDNA的純化，在其末端添加多聚C，再用引物GSP-2和鉚釘引物AAP進(jìn)行PCR第1輪擴(kuò)增。反應(yīng)體系(50 μL): ddH2O 31.5 μL, 10×PCR Buffer 5 μL, MgCl2(25 μmol/L) 3 μL, dNTP Mix (10 μmol/L) 1 μL, Nested GSP-2 (10 μmol/L) 2 μL, Abridged Anchor Primer (10 μmol/L) 2 μL, dC-tailed cDNA 5 μL, Taq DNA Polymerase (5 U/μL) 0.5 μL。反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性2 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 10 min, 共35個(gè)循環(huán)。之后用引物GSP-3與通用擴(kuò)增引物AUAP進(jìn)行第2輪巢式PCR。反應(yīng)體系(50 μL): ddH2O 33.5 μL, 10×PCR Buffer 5 μL, MgCl2(25 μmol/L) 3 μL, dNTP Mix (10 μmol/L) 1 μL, Nested GSP-3 (10 μmol/L) 1 μL, AUAP或UAP (10 μmol/L) 1 μL, PCR稀釋產(chǎn)物 5 μL, Taq DNA Polymerase (5 U/μL) 0.5 μL。反應(yīng)程序與第一輪相同。純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后對(duì)陽性克隆進(jìn)行測序。

基因的3′RACE使用逆轉(zhuǎn)錄酶SMARTScribeTMReverse Transcriptase和引物3′CDS Primer A對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，之后用引物3′978-1和通用引物UPM配成的50 μL反應(yīng)體系進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍后，用引物3′978-2和UPM進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件及程序同第1輪。將產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化，并與pMD18T連接，轉(zhuǎn)化后送至上海生工直接測序。

最后使用Vector NTI10.3.0軟件將測得的5′和3′末端序列和中間序列拼接，得到MaLac1基因的全長cDNA序列，通過NCBI比對(duì)分析預(yù)測出基因的起始和終止密碼子位置。純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后對(duì)陽性克隆進(jìn)行測序。陽性克隆的測序結(jié)果與cDNA序列比對(duì)來確定成功獲得了重組載體。

表1 引物信息Table 1 Primers used in this study

下劃線序列GAATTG和CTCGAG分別為MfeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。The underlined sequences GAATTG and CTCGAG are the cleavage site ofMfeⅠandXhoⅠ, respectively.

1.5 松墨天牛MaLac1基因的生物信息學(xué)分析

使用DNAMAN軟件對(duì)目的基因編碼序列進(jìn)行預(yù)測，并用ORF Finder(www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)對(duì)松墨天牛MaLac1基因的最長開放閱讀框進(jìn)行預(yù)測。通過ProtParam(https:∥web.expasy.org/protparam/)等軟件完成MaLac1基因編碼蛋白理化性質(zhì)的預(yù)測；使用在線SignalP 4.1 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測；用TMpredServer(https:∥embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)等軟件完成對(duì)MaLac1基因編碼蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)和親水性預(yù)測；用SOPMA(http:∥scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/)等軟件完成對(duì)MaLac1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。通過NCBI檢索其他昆蟲Lac基因序列，用ClustalW2(http:∥www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)軟件完成氨基酸序列比對(duì)，再用MEGA6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，并完成1 000次bootstrap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測。

1.6 松墨天牛MaLac1蛋白的原核表達(dá)與純化

利用P1944F(包含MfeⅠ酶切位點(diǎn))和P1944R(包含XhoⅠ酶切位點(diǎn))(表1)，以pMD18T-MaLac1質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增全長CDS(Met1-Leu502)，用MfeⅠ和XhoⅠ酶切后回收，連接至pET-32a載體多克隆位點(diǎn)5′EcoRⅠ-XhoⅠ3′之間。由于Lac基因中含有EcoRⅠ位點(diǎn)，故此處使用其同尾酶MfeⅠ進(jìn)行載體構(gòu)建。連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。測序鑒定PCR篩選后的重組質(zhì)粒pET32a-MaLac1，并將鑒定好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta (DE3)中，進(jìn)行菌落PCR，之后對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。接種陽性克隆Rosetta(pET32a-MaLac1)至LB培養(yǎng)基，保持溫度為37℃，在220 r/min條件下震蕩過夜培養(yǎng)。 待OD600=0.4～0.6之間時(shí)，加入IPTG，最終濃度為0.5 mmol/L，在18℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)10 h。離心收集經(jīng)超聲破碎至透亮的重組菌體(新芝超聲破碎儀，2號(hào)探頭，功率10%，超聲時(shí)間2 s，間歇時(shí)間2 s，循環(huán)進(jìn)行4 min), 12 000 r/min 10 min離心，分別收集上清和沉淀，12% SDS-PAGE檢測融合蛋白可溶性。

將大腸桿菌Rosetta-pET32a-MaLac1菌株誘導(dǎo)后，用裂解緩沖液重懸，超聲洗滌離心后獲得包涵體，使用8 mol/L尿素將包涵體變性，然后緩慢地將變性后包涵體蛋白加入到復(fù)性緩沖液中，獲得復(fù)性后可溶MaLac1重組蛋白。離心取上清液與Ni-NTA柱結(jié)合，用洗滌緩沖液去除雜蛋白，并將目的蛋白從Ni柱上洗脫。用Millipore 15 mL 10 K(UFC910096)的超濾離心柱濃縮目的蛋白MaLac1，SDS-PAGE檢測蛋白純化時(shí)的各組分，確定融合蛋白的大小和純度。

1.7 松墨天牛MaLac1基因表達(dá)量的qPCR檢測

采用qPCR檢測MaLac1基因在松墨天牛低齡幼蟲、老熟幼蟲、蛹和雌雄成蟲腸道中的表達(dá)差異，上游引物為D-MaLac1-F，下游引物為D-MaLac1-R(表1)。以1.2節(jié)中合成的不同蟲態(tài)腸道cDNA為模板，選用在松墨天牛不同發(fā)育階段表達(dá)較穩(wěn)定的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因作為內(nèi)參基因(馮波等, 2016)，其上游引物為D-GAPDH-F，下游引物為D-GAPDH-R(表1)。反應(yīng)體系(20 μL): Bestar? SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL, cDNA模板2 μL, ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性2 min; 94℃變性20 s, 58℃退火20 s, 72℃延伸30 s, 共40個(gè)循環(huán)，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

松墨天牛MaLac1基因表達(dá)結(jié)果按照2-△△CT方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理(Livak and Schmittgen, 2001)，將所得數(shù)據(jù)用IBM SPSS Statistics 20軟件的比較均值單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤顯示。

2 結(jié)果

2.1 松墨天牛MaLac1基因的克隆及序列分析

根據(jù)課題組前期獲得的松墨天牛轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(Wuetal., 2016)，篩選出松墨天牛漆酶保守序列信息，設(shè)計(jì)并合成引物。提取松墨天牛新鮮腸道組織總RNA(圖1: A)，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板，PCR擴(kuò)增后得到該基因中間片段。根據(jù)獲得的松墨天牛漆酶基因保守序列分別設(shè)計(jì)目的基因的5′和3′RACE特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增克隆測序。根據(jù)中間片段序列、5′RACE和3′RACE結(jié)果進(jìn)行序列拼接，獲得一條總長為2 395 bp的cDNA序列，其中編碼區(qū)長度為2 067 bp(圖1: B)，5′端非編碼區(qū)118 bp(圖1: C)，3′端非編碼區(qū)210 bp(圖1: D)，命名此基因?yàn)镸aLac1(GenBank登錄號(hào): KY073340)。MaLac1基因編碼一個(gè)含688個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，編碼蛋白分子量為78.34 kD，等電點(diǎn)為5.30。 信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果表明，N端第1-15位氨基酸為信號(hào)肽區(qū)。MaLac1基因編碼多肽的原子組成為C3500H5306N940O1042S35，不穩(wěn)定系數(shù)是31.66，穩(wěn)定性強(qiáng)。MaLac1基因的編碼蛋白有80.15的脂肪系數(shù)，總平均親水性為-0.314，通過軟件ProtParam分析表明，MaLac1基因的編碼蛋白親水區(qū)域較多，為親水性蛋白。利用在線TMpred軟件對(duì)MaLac1基因編碼蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析，結(jié)果表明MaLac1基因編碼蛋白具有2個(gè)跨膜域和1個(gè)疑似跨膜域。每個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域有17～18個(gè)氨基酸殘基。使用SOPMA等軟件和Swiss-model軟件分析MaLac1基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明MaLac1編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占比57.99%，α-螺旋占比9.3%，β-折疊占比5.23%，α-螺旋與無規(guī)則卷曲間的伸展鏈占比27.47%,表明三級(jí)結(jié)構(gòu)中構(gòu)成蛋白質(zhì)的主要骨架為無規(guī)則卷曲。

圖1 松墨天牛MaLac1基因全長的克隆Fig. 1 Full length cDNA cloning of MaLac1 in Monochamus alternatus1: 松墨天牛腸道總RNA Total RNA of M. alternatus gut; 2: MaLac1基因中間片段Intermediate fragment of MaLac1 (2 067 bp); 3: 5′ RACE片段5′ RACE fragment (167 bp); 4: 3′RACE片段3′ RACE fragment (269 bp); M: DL2000.

2.2 松墨天牛MaLac1蛋白與其他已知昆蟲漆酶基因序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用ClustalX2.1軟件將MaLac1基因和其他15種昆蟲漆酶基因編碼氨基酸序列(物種名及其漆酶基因GenBank登錄號(hào)信息見圖2圖注)進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果顯示：MaLac1基因編碼產(chǎn)物與其他昆蟲漆酶類似，具有與銅離子結(jié)合有關(guān)的10個(gè)組氨酸和1個(gè)半胱氨酸，以及一段C-X-R-X-C區(qū)域，并在N末端具有若干個(gè)芳香族帶電殘基(Dittmeretal., 2004)；C-X-R-X-C區(qū)域一般擁有7個(gè)半胱氨酸，位于第一個(gè)銅離子結(jié)合組氨酸上游90個(gè)氨基酸的位置，并且在昆蟲漆酶蛋白中高度保守。使用MEGA6.0軟件對(duì)來源于15個(gè)昆蟲物種的漆酶基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)，結(jié)果顯示，MaLac1基因的氨基酸序列與赤擬谷盜Triboliumcastaneum漆酶基因TcLac1的氨基酸序列一致性為93%，具有較近的親緣關(guān)系；不同物種間Lac1基因與Lac2基因各自形成不同分支，說明同一類型的漆酶基因保守性更強(qiáng)。

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于松墨天牛漆酶MaLac1和其他昆蟲Lac氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))Fig. 2 Phylogenetic tree of MaLac1 of Monochamus alternatus and Lac proteins of other insects based on amino acid sequence(neighbor-joining method, 1 000 repeats)Lac蛋白來源物種及GenBank登錄號(hào)Origin species of Lac proteins and their GenBank accession numbers: MaLac1: 松墨天牛Monochamus alternatus (KY073340); AnLac1: 光肩星天牛Anoplophora glabripennis (XP_018580038); LdLac1: 馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata (XP_023019016); NcLac1S: 黑尾葉蟬 Nephotettix cincticeps (AB514129); BtLac1: 煙粉虱 Bemisia tabaci (AQY62684); SoLac2: 米象 Sitophilus oryzae (XP_030755871); TcLac1: 赤擬谷盜 Tribolium castaneum (NP 001034514); AmLac1: 西方蜜蜂Apis mellifera (XP_026295929); SiLac1: 紅火蟻Solenopsis invicta (XP_025992935); MsLac1: 煙草天蛾 Manduca sexta (AAN17506); HaLac1: 棉鈴蟲 Helicoverpa armigera (AKH61981); DpLac1: 黑脈金斑蝶 Danaus plexippus (OWR44647); PxLac1: 小菜蛾P(guān)lutella xylostella (KR107969); AgLac1: 岡比亞按蚊Anopheles gambiae (AY135184); MaLac2: 松墨天牛Monochamus alternatus (EU093075); TcLac2: 赤擬谷盜 Tribolium castaneum (AAX84202); MsLac2: 煙草天蛾Manduca sexta (AAN17507); RfLac6: 黃肢散白蟻Reticulitermes flavipes (GQ421909).

2.3 MaLac1基因的原核表達(dá)

SDS-PAGE電泳分析表明，在IPTG誘導(dǎo)下，含pET32a-MaLac1的大腸桿菌表達(dá)了一條大約78 kD的特異蛋白條帶(圖3: A)，符合推測大?。籒i柱親和層析純化蛋白結(jié)果顯示與表達(dá)蛋白大小一致(圖3: B)，通過純化最終得到復(fù)性蛋白(圖3: C)。

2.4 MaLac1在不同發(fā)育階段松墨天牛腸道中的表達(dá)量

qPCR結(jié)果顯示，MaLac1基因在松墨天牛腸道中廣泛表達(dá)，轉(zhuǎn)錄水平在不同發(fā)育階段存在顯著差異(F=6.82,P<0.05)。松墨天牛低齡幼蟲和老熟幼蟲腸道中MaLac1的表達(dá)水平相近，均顯著低于成蟲的(P<0.05)；在松墨天牛的蛹期腸道中，MaLac1的表達(dá)量增加，但仍顯著低于成蟲期的(P<0.05)；在松墨天牛的成蟲期，MaLac1在雌成蟲腸道中的表達(dá)量略高于雄成蟲的，均顯著高于幼蟲期和蛹期的(P<0.05)(圖4)。

圖3 松墨天牛MaLac1的原核表達(dá)及蛋白純化Fig. 3 Prokaryotic expression and protein purification of MaLac1 of Monochamus alternatusA: 重組載體pET32a-MaLac1的誘導(dǎo)表達(dá)Expression of pET32a-MaLac1. 1: 未經(jīng)IPTG的誘導(dǎo)pET32a-MaLac1的表達(dá)產(chǎn)物Expression product of pET32a-MaLac1 non-induced by IPTG; 2: IPTG誘導(dǎo)后pET32a-MaLac1的表達(dá)產(chǎn)物Expression product of pET32a-MaLac1 induced by IPTG; 3: 上清中pET32a-MaLac1的表達(dá)產(chǎn)物Expression product of pET32a-MaLac1 in supernatant solution; 4: 包涵體中pET32a-MaLac1的表達(dá)產(chǎn)物Expression product of pET32a-MaLac1 in inclusion body. B: pET32a-MaLac1表達(dá)的重組蛋白的純化 Purification of the recombinant protein expressed by pET32a-MaLac1. 5: 包涵體的裂解沉淀Sediment of inclusion body; 6: 包涵體的裂解上清Supernatant of inclusion body. C: MaLac1純化蛋白的復(fù)性Refolding of purified MaLac1 protein. 7: MaLac1復(fù)性蛋白R(shí)enaturated protein of MaLac1. M: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker.

圖4 MaLac1在不同發(fā)育階段松墨天牛腸道中的表達(dá)分析Fig. 4 Expression profiles of MaLac1 in the gut ofMonochamus alternatus at differentdevelopmental stagesEL: 低齡幼蟲Early instar larva; ML: 老熟幼蟲Mature larva; PP: 蛹Pupa; FA: 雌成蟲Female adult; MA: 雄成蟲Male adult. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同字母分別代表不同蟲態(tài)腸道中基因表達(dá)量的差異顯著性(n=3)(P<0.05, LSD法)。Data in the figure are mean±SE. Different letters above bars indicate significant difference in the gene expression level in the gut among different developmental stages (n=3)(P<0.05, LSD method).

3 討論

本研究通過篩選松墨天牛各發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Wuetal., 2016)，獲得了一個(gè)松墨天牛內(nèi)源漆酶基因，并將其命名為MaLac1。通過RACE技術(shù)成功獲得了MaLac1的全長cDNA，ORF全長2 067 bp，編碼一個(gè)含688個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，預(yù)測分子量為78.34 kD，等電點(diǎn)為5.30。與其他昆蟲漆酶的氨基酸序列比對(duì)顯示，MaLac1具有與銅離子結(jié)合有關(guān)的10個(gè)組氨酸和1個(gè)半胱氨酸、一段C-X-R-X-C密集區(qū)域、以及在N末端存在若干芳香族帶電殘基，這與昆蟲漆酶蛋白的典型特征相吻合(Dittmeretal., 2004)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明該基因氨基酸序列與赤擬谷盜TcLac1基因氨基酸序列的一致性達(dá)到93%，具有較近的親緣關(guān)系。昆蟲Lac1氨基酸序列與昆蟲Lac2氨基酸序列各自形成一個(gè)分支，表明同一類型漆酶基因保守性較強(qiáng)。

本研究構(gòu)建了MaLac1基因的原核表達(dá)載體pET32a-MaLac1，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)菌株，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，最終產(chǎn)生了一條大約78 kD的特異蛋白條帶，符合推測大小，表明成功完成了pET32a-MaLac1的表達(dá)。最終通過Ni柱親和層析純化得到了復(fù)性蛋白，為下一步蛋白功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

漆酶作為一種重要的木質(zhì)素酶，其降解功能已在其他植食性昆蟲中被發(fā)現(xiàn)。Coy等(2010)對(duì)黃肢散白蟻的漆酶RfLac進(jìn)行活性測定，發(fā)現(xiàn)RfLac對(duì)木質(zhì)素單體芥子酸、鄰苯二酚等底物具有催化活性。煙草天蛾進(jìn)行取食后，其漆酶基因MsLac1在中腸中大量表達(dá)，而在蟲體休眠后表達(dá)量降低，推測MsLac1可能與昆蟲木質(zhì)素降解有關(guān)(Dittmeretal., 2004)。在MaLac1表達(dá)定量分析中，發(fā)現(xiàn)MaLac1在松墨天牛不同發(fā)育時(shí)期的腸道中廣泛表達(dá)，在成蟲中腸道中的表達(dá)量顯著高于幼蟲和蛹中的，推測其參與了宿主昆蟲的基本生理功能，可能在松墨天牛消化木質(zhì)素的過程中發(fā)揮了一定作用。

岡比亞按蚊體內(nèi)血液含量升高時(shí)，漆酶基因AgMCO1在中腸、馬氏管、卵巢中的表達(dá)量同時(shí)上升，表明AgMCO1可能與鐵代謝有關(guān)(Nicholetal., 2002; Gormanetal., 2008)。黑尾葉蟬漆酶基因NcLac1S在唾液腺中表達(dá)顯著，推測其可能與酚類化合物解毒有關(guān)(Hattorietal., 2010)。小菜蛾漆酶基因PxLac1在蟲體受到細(xì)菌感染后，轉(zhuǎn)錄水平顯著提升，也證明了Lac1具有參與昆蟲免疫的功能(Wang ZHetal., 2018)。因此，松墨天牛MaLac1可能具有食物脫毒、離子代謝、自身免疫等方面的生理功能。

單寧酸是一種在植物體內(nèi)廣泛存在的天然多元酚化合物(Gardioletal., 1996; Wanetal., 2006)。單寧酸可以與唾液蛋白、糖蛋白等互作，產(chǎn)生苦澀味，從而降低動(dòng)物采食量，影響蛋白質(zhì)的消化吸收(邵婭等, 2017);另一方面，漆酶被認(rèn)為可以通過對(duì)單寧酸的氧化作用，提高植食性昆蟲對(duì)寄主植物的抗性(李芒, 2011)。馬尾松健康木中單寧含量較高，而在受到昆蟲侵害時(shí)，隨著危害程度的加深，其單寧含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(史先慧等, 2017)。松墨天牛多選擇衰弱木、枯死木產(chǎn)卵，在幼蟲期大量進(jìn)食，直至羽化；羽化后的成蟲則喜好取食健康松樹的嫩梢以補(bǔ)充營養(yǎng)。因此，松墨天牛成蟲在取食行為中將面臨較高的寄主植物抗性壓力，其MaLac1基因表達(dá)量的升高可能與氧化植物單寧酸，幫助昆蟲食物脫毒，克服寄主植物抗性有關(guān)。MaLac1在松墨天牛腸道中的具體作用還有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

本研究克隆了松墨天牛MaLac1基因全長序列，解析了該基因的結(jié)構(gòu)并預(yù)測其編碼蛋白生物學(xué)特性，完成了原核表達(dá)并純化目的蛋白，熒光定量PCR探明了MaLac1基因在松墨天牛不同生長發(fā)育階段的腸道中的表達(dá)差異，研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步探究松墨天牛漆酶的功能。