寧寶云 薛姍姍 劉 慧 劉 康 郝繼偉

（臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東臨沂276000）

蛹蟲草（Cordyecps militaris）又名北蟲草，為蟲草菌科（Cordycipitaceae）蟲草屬（Cordyceps）的子囊真菌[1]，具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值。目前，蛹蟲草已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工廠化、規(guī)?；a(chǎn)[2]。蛹蟲草菌種存在易衰老、退化等問題，導(dǎo)致菌種生產(chǎn)不穩(wěn)定，影響蛹蟲草規(guī)?；a(chǎn)[3]。

當(dāng)前，通常采用組織分離法、孢子分離法、蟲體回接法和基內(nèi)菌絲分離法等復(fù)壯退化蛹蟲草菌種[4-6]。據(jù)王殿振等[7]，張鑫等[8]研究，活蠶蛹回接法是一種復(fù)壯退化蛹蟲草菌種理想方法，但此法存在周期長，操作過程煩瑣，成本高等缺點(diǎn)，不宜頻繁應(yīng)用。組織分離法也是一種常用食用菌菌種繁殖方法，且具有操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。筆者進(jìn)一步深入研究兩種方法，并探索出一種菌種復(fù)壯方法綜合應(yīng)用的新模式，從而保證優(yōu)良蛹蟲草菌種的可持續(xù)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試蛹蟲草菌株為SC-20，來自盛成農(nóng)業(yè)科技有限公司；蠶蛹為網(wǎng)購的活蠶蛹。

1.2 培養(yǎng)基配方及制備

1.2.1 母種培養(yǎng)基

200 g馬鈴薯（去皮），20 g葡萄糖，5 g蛋白胨，1.5 g磷酸二氫鉀，1 g硫酸鎂，20 g瓊脂，定容至1 000 mL，pH自然。配制好培養(yǎng)基，分裝入180 mm×18 mm試管中，裝液量為每管15 mL，121℃滅菌30 min后，擺斜面冷卻備用。

1.2.2 液體培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基配方中除去瓊脂粉即為液體培養(yǎng)基配方。配制方法同上，將液體培養(yǎng)基分別裝入250 mL的錐形瓶中，每瓶裝入量150 mL，121℃滅菌30 min后，冷卻備用。

1.2.3 出草培養(yǎng)基

出草用大米培養(yǎng)基：大米20g，按固液比（質(zhì)量體積比）1∶1.5，加入營養(yǎng)液（葡萄糖2%，磷酸二氫鉀0.15%，硫酸鎂0.1%）。培養(yǎng)基裝入300 mL栽培瓶中，121℃滅菌60 min后備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 轉(zhuǎn)接次數(shù)試驗(yàn)

將試驗(yàn)菌種記為F0，轉(zhuǎn)接到固體斜面培養(yǎng)基上記為F1，在25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后，轉(zhuǎn)接到固體斜面培養(yǎng)基上記為F2，依次轉(zhuǎn)接到F6。每代繁殖8管，除其中1管用于繼續(xù)轉(zhuǎn)接傳代外，其余分別用于菌種保藏、退化性狀測定試驗(yàn)（培養(yǎng)第7天記錄每代菌絲生長速度，然后繼續(xù)培養(yǎng)并觀察轉(zhuǎn)色時間以及管內(nèi)出草現(xiàn)象等）以及制作液體菌種或出草試驗(yàn)等。

1.3.2 復(fù)壯方法比較試驗(yàn)

根據(jù)菌種擴(kuò)繁代數(shù)試驗(yàn)結(jié)果，以未采取任何復(fù)壯方法菌種為對照，將尚未出現(xiàn)退化現(xiàn)象菌種與已出現(xiàn)明顯退化現(xiàn)象的菌種分別采用組織分離法與活蠶蛹回接復(fù)壯法比較復(fù)壯效果。

1.3.2.1 組織分離復(fù)壯法

將選擇的傳代菌種，接種到大米培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基上長出蛹蟲草子座10 d后，選擇形態(tài)典型、長勢健壯的子座，剪取上部組織，先用70%酒精消毒再用無菌水沖洗5s，無菌濾紙吸干水后，剪成1 mm左右小段，無菌環(huán)境中接種到斜面上。22℃培養(yǎng)10 d后，接種于大米培養(yǎng)基上培養(yǎng)、出草。5次重復(fù)。

1.3.2.2 活蠶蛹復(fù)壯法

將選擇的傳代菌種接種到液體培養(yǎng)基，溫度22℃、轉(zhuǎn)速150 r/min，振蕩培養(yǎng)5 d，得液體菌種備用。選取健康活柞蠶蛹，用70%～75%酒精擦洗蠶蛹體表消毒，再用無菌水反復(fù)沖洗，置于無菌環(huán)境中晾干；用無菌注射器抽取0.3 mL液體菌種注入活蠶蛹胸腔，置已消毒的培養(yǎng)瓶中，送入培養(yǎng)室內(nèi)16～18℃培養(yǎng)。長出子座后，采用組織分離法培養(yǎng)斜面菌種，接種于大米培養(yǎng)基上培養(yǎng)、出草。

1.3.3 分離組織試驗(yàn)

采用活蠶蛹復(fù)壯菌種培養(yǎng)的子實(shí)體組織：子座生長前期（出草第10天）子座（對照），中期（出草第20天）子座，后期（出草第30天）子座，分別剪取子座上部的組織培養(yǎng)。組織塊處理及接種培養(yǎng)方法同1.3.2.1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS統(tǒng)計軟件分析，新復(fù)極差法多重比較。

圖1 F1管內(nèi)出草

圖2 F2管內(nèi)出草

圖3 F3管內(nèi)出草

2 結(jié)果與分析

2.1 回聲接次數(shù)試驗(yàn)結(jié)果

菌種轉(zhuǎn)接次數(shù)試驗(yàn)結(jié)果見圖1、圖2、圖3和表1。由表1可以看出，菌絲日均生長量隨轉(zhuǎn)接次數(shù)的增加而逐步下降，但F1、F2與F3間無顯著差異，F(xiàn)4及以后各代顯著下降。

轉(zhuǎn)色：F1、F2與F3間轉(zhuǎn)色效果無明顯差異，F(xiàn)4及以后各代轉(zhuǎn)色效果差；菌絲長勢：F1、F2、F3菌絲長勢良好，F(xiàn)4、F5、F6菌絲長勢差。

出草：F1和F2菌種蛹蟲草出草好，F(xiàn)3菌種出草能力減弱，F(xiàn)5和F6菌種沒有出草。

由此可見，蛹蟲草菌種轉(zhuǎn)接2次無退化現(xiàn)象，轉(zhuǎn)接3次稍有退化現(xiàn)象，轉(zhuǎn)接3次以上退化明顯。

2.2 不同復(fù)壯方法效果

在菌種轉(zhuǎn)接次數(shù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別選擇性狀未退化菌種（F2）與已明顯退化菌種（F4），采用組織分離法與活蠶蛹復(fù)壯法進(jìn)行比較復(fù)壯效果。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2結(jié)果可知，組織分離法與活蠶蛹回接復(fù)壯法復(fù)壯F2，出草試驗(yàn)活蠶蛹回接法鮮草產(chǎn)量最高，其次是組織分離法、對照最低，但三者間無顯著差異。由此也可以看出，組織分離法可保持菌種優(yōu)良典型性狀，降低菌種潛在的退化風(fēng)險，但復(fù)壯效果不如蠶蛹回接法。

表1 蛹蟲草菌種轉(zhuǎn)接次數(shù)試驗(yàn)結(jié)果

表2 兩種復(fù)壯方法復(fù)壯效果（產(chǎn)量）比較

由表2同樣可以看出，對明顯退化菌種（F4）活蠶蛹回接復(fù)壯效果顯著好于組織分離法。因此，蛹蟲草菌種一旦出現(xiàn)退化現(xiàn)象，活蠶蛹回接復(fù)壯方法是最佳選擇，與以往研究結(jié)果一致。

組織分離法對試驗(yàn)菌種的復(fù)壯效果，均不如活蠶蛹回接法，分析原因：一是蟲體回接可以使蟲生真菌對昆蟲的毒力得到回復(fù)，原有的生物學(xué)性狀也得以穩(wěn)定[9]；二是與組織分離法選取子座的質(zhì)量有關(guān)，子座質(zhì)量直接影響復(fù)壯效果。因此，生產(chǎn)中長期采用組織分離法分離菌種，因選擇子座良莠不齊，極易導(dǎo)致菌種退化。

2.3 分離組織試驗(yàn)結(jié)果

由表3結(jié)果可知，組織分離法復(fù)壯蛹蟲草菌種，分離組織采用生長前、中期的子座組織復(fù)壯效果好，且菌種質(zhì)量穩(wěn)定。

表3 分離組織試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)及復(fù)壯方法綜合應(yīng)用探討

試驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)良蛹蟲草菌株在轉(zhuǎn)接2次仍會較好保留原有性狀，轉(zhuǎn)接3次或以上會逐漸出現(xiàn)退化現(xiàn)象，如轉(zhuǎn)色越來越困難、菌絲生長變慢、管內(nèi)出草不明顯甚至不出草等；活蠶蛹回接復(fù)壯法對退化菌種的復(fù)壯效果明顯好于組織分離法，但組織分離法有良好的延緩菌種退化的作用。

圖4 活蠶蛹回接法與組織分離法相結(jié)合的蛹蟲草菌種綜合復(fù)壯生產(chǎn)模式

菌種的退化原因有很多，如核型的改變[10]、基因突變[11-12]、胞內(nèi)有害物質(zhì)的積累[13]以及無性繁殖體感染病毒[14]等。菌種的過度傳代、長期保藏、長期無性繁殖等均會誘發(fā)退化，最終往往是多種因素共同作用導(dǎo)致菌種的退化。因此，菌種退化初期，表現(xiàn)不明顯，只有多種引起退化因素積累到一定程度時，才會表現(xiàn)出明顯退化性狀（產(chǎn)量下降，甚至不出草）。而蛹蟲草菌種一旦退化，采用復(fù)壯效果好的活蠶蛹回接法復(fù)壯，因周期較長，會影響蛹蟲草工廠化生產(chǎn)。

為此，筆者提出了活蠶蛹回接法與組織分離法相結(jié)合的蛹蟲草菌種綜合復(fù)壯生產(chǎn)模式，其工藝流程見圖4。該模式避免了菌種的連續(xù)擴(kuò)繁傳代，可保持菌種的及時復(fù)壯更新，并可持續(xù)生產(chǎn)出質(zhì)量穩(wěn)定的優(yōu)良菌種，保證蛹蟲草工廠化生產(chǎn)的穩(wěn)定。