萬水霞 王靜 李帆 蔣光月 徐文靜 劉祚軍

（1. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所 安徽養(yǎng)分循環(huán)與資源環(huán)境省級(jí)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230031；2. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程研究所， 合肥 230031）

玉米生產(chǎn)在我國(guó)糧食生產(chǎn)中占有非常重要的地位。玉米種植生產(chǎn)中主要依賴化學(xué)肥料，但是隨著化肥的不合理施用，玉米品質(zhì)下降、環(huán)境污染、土壤板結(jié)等一系列問題日益突出，嚴(yán)重影響我國(guó)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［1-2］。隨著農(nóng)業(yè)部化肥零增長(zhǎng)減量化行動(dòng)的實(shí)施，減少化肥用量、擴(kuò)大新型肥料使用成為勢(shì)趨。生產(chǎn)實(shí)踐證明，利用優(yōu)良促生菌研制的微生物肥料不僅具有肥效作用，還可以減少生產(chǎn)和使用農(nóng)藥、化肥帶來的環(huán)境和食品污染及非再生能源消耗［3-4］。因此，應(yīng)用微生物肥料來替代部分化肥逐漸成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)的研究熱點(diǎn)。

植物根際促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是微生物肥料重要的種質(zhì)資源，生存于植物根際或根表，可直接或間接地促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育。部分PGPR 可以通過固氮、溶磷、解鉀、分泌植物激素如吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）等促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，還可增強(qiáng)植物對(duì)病害、重金屬、鹽堿等逆境的抗性［5-6］。PGPR 在進(jìn)行生命活動(dòng)和新陳代謝的過程中，可通過降解土壤中的有機(jī)物和難溶性礦物來增加土壤的養(yǎng)分含量。如解磷細(xì)菌可分泌有機(jī)酸與部分金屬離子鰲合，將土壤中難溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷，供植物吸收，促進(jìn)植物生長(zhǎng)［7］；同時(shí)植物生長(zhǎng)素IAA 被當(dāng)作篩選PGPR 的重要指標(biāo)，根際促生菌通過分泌IAA 來促進(jìn)植物合成生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育［8］。本研究從大田玉米根際分離篩選兼有溶磷及分泌生長(zhǎng)激素的優(yōu)良PGPR 菌株，并利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對(duì)其進(jìn)行分類鑒定，以期為研制復(fù)合微生物肥料提供新的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品分別采自安徽省合肥、肥東、巢湖、桐城的玉米植株根際土壤。用抖落法獲得植物根際土壤，放入無菌封口袋中混勻、封口、編號(hào)，裝入冰盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室分離。

培養(yǎng)基：LB 培養(yǎng)基用于分離和保存根際細(xì)菌，PKO 培養(yǎng)基用于溶磷菌株的分離與純化［9-11］。 PKO 培 養(yǎng) 基：葡 萄 糖10.0 g、 酵 母 粉0.5 g、 （NH4）2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、Ca3（PO4）25.0 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·H2O 0.03 g、補(bǔ)加蒸餾水至1 L，調(diào)節(jié)pH 為 7.0，瓊脂15 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選 稱取根系土壤配制不同濃度梯度的土壤懸液，分別吸取0.1 mL 懸液涂布培養(yǎng)基平板，每個(gè)處理3 次重復(fù)，28℃恒溫培養(yǎng)5 d。挑取優(yōu)勢(shì)菌株，進(jìn)行純化和多次傳代。

1.2.2 根際溶磷細(xì)菌溶磷能力測(cè)定 將篩選出來的細(xì)菌接種于PKO 平板上，30℃ 培養(yǎng)4-6 d，觀察有無溶磷圈產(chǎn)生，測(cè)量溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d），計(jì)算溶磷圈與菌落直徑比（D/d）。比值越大，表示溶磷能力越強(qiáng)。將溶磷圈大的細(xì)菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，并設(shè)置空白對(duì)照，各處理3 次重復(fù)，30℃，180 r/min 下振蕩培養(yǎng)5 d，將發(fā)酵液離心 10 min（4℃，10 000 r/min），采用鉬銻抗比色法測(cè)定上清液中可溶性磷的含量，并測(cè)定培養(yǎng)液pH 值［12］。

1.2.3 溶磷菌株分泌IAA 特性測(cè)定 定性測(cè)定：參考Glickman 等［13］的方法，將分離純化的菌株分別接種于LB 液體培養(yǎng)基中（添加L-色氨酸，使終濃度為0.5 g/L），37℃、180 r/min 震蕩培養(yǎng)2 d，離心后取50 μL 上清液加入等體積Sackowcki’s 顯色劑在白瓷板上避光顯色30 min 后觀察，若出現(xiàn)粉紅色則為陽性，說明該菌株能夠分泌IAA。

定量測(cè)定：取陽性菌株的上清液與Sackowcki’s 顯色劑避光顯色30 min 后的混合液，測(cè)定在530 nm 的吸光值，以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，以純IAA 的吸光值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出各反應(yīng)中的陽性菌株產(chǎn)IAA 的量（μg/mL）［14］。

1.2.4 菌株鑒定 觀察菌落形態(tài)特征及革蘭氏染色特性，生理生化試驗(yàn)參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》及相關(guān)文獻(xiàn)鑒定菌株［14-15］。

分別提取菌株的總基因DNA，采用16S rDNA 通用引物27f（5′-AGAGTTT-G-ATCCTGGCTCAG-3′）和1492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′） 進(jìn) 行16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增，將PCR 產(chǎn)物送生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交至GenBank，并進(jìn)行Blast 序列比對(duì)分析，使用MEGA 7 軟件通過鄰接（Neighbour-joining）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 盆栽實(shí)驗(yàn)研究溶磷菌株的促生效應(yīng) 盆栽實(shí)驗(yàn)于2019 年5-6 月進(jìn)行，供試土壤來自安徽懷遠(yuǎn)農(nóng)田，供試作物為莧菜。試驗(yàn)共設(shè)6 個(gè)處理，重復(fù)5 次，分別為：處理1，不接種任何菌劑（CK）；處理2，接種CH07（CH07）；處理3，接種FD11（FD11）；處理4，接種FD13（FD13）；處理5，接種CH07 與FD11 的混合菌劑（復(fù)合1）；處理6，接種CH07、FD11、FD13 的混合菌劑（復(fù)合2）。

供試菌株分別活化后置于LB 培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)24 h，用無菌水調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1×108CFU/mL（OD600約0.5），采用灌根方式進(jìn)行接種，接種量10 mL/株。自然條件下室內(nèi)培養(yǎng)，每隔5 d 重復(fù)處理1 次，整個(gè)試驗(yàn)期間保持土壤濕潤(rùn)，30 d 后收獲植株測(cè)定株高及鮮重。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2010 和SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，使用最小顯著差異法（LSD）檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 溶磷菌株篩選及其溶磷能力

從安徽不同地區(qū)玉米根際土壤中共分離純化57 株細(xì)菌，其中13 株細(xì)菌具有溶磷功能，能在PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基上產(chǎn)生清晰的溶磷圈。其中，5 株來自安徽肥東（菌株標(biāo)號(hào)為FD），5 株來自巢湖（菌株標(biāo)號(hào)為CH）及3 株來自安徽桐城（菌株標(biāo)號(hào)為TC）。根據(jù)溶磷圈與菌落直徑比值的大小可以定性判定溶磷特性的大小。結(jié)果（表1）顯示，菌株FD11、CH07 具有較強(qiáng)的溶磷能力，其 D/d 比值分別為2.05、1.86。

將能產(chǎn)生溶磷圈的13 株菌株分別接種于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)5 d，測(cè)定各菌株對(duì)磷酸三鈣的溶解能力，結(jié)果顯示，這3 個(gè)樣地中分離的根際促生菌的溶磷能力差異顯著，溶磷量在88.2-368.5 mg/L 之間。其中，發(fā)酵液的有效磷含量最高 的是CH 07菌株，達(dá)368.5 mg/L；其次是FD11 菌株321.5 mg/L、CH09菌株318.9 mg/L。各菌株培養(yǎng)液pH 在4.22-5.69 之間，同時(shí)，菌株發(fā)酵液pH 值越低，速效磷含量越高，即各菌株解磷能力與發(fā)酵液pH 值呈現(xiàn)出一定負(fù)相關(guān)，相關(guān)性達(dá)到顯著水平。

2.2 溶磷菌株分泌IAA 能力分析

利用顯色法和比色法分別對(duì)此次篩選中具有溶磷能力的菌株進(jìn)行分泌生長(zhǎng)素（IAA）能力測(cè)定，結(jié)果（表2）顯示，6 株菌株具有分泌IAA 的能力。各菌株的顯色反應(yīng)與分泌IAA 的量成正比關(guān)系，即分泌量越大，顏色反應(yīng)越強(qiáng)烈。各菌株IAA 分泌量在14.71-30.95 mg/L。其中，F(xiàn)D03、CH07 菌株分泌IAA 活性顯著高于其他菌株，IAA 產(chǎn)量分別為30.95 mg/L、30.93 mg/L，且菌株FD03、CH07 相互之間差異不顯著。菌株FD11、TC11、CH13、FD07 也具有較強(qiáng)分泌IAA 活性，IAA 產(chǎn)量分別為15.93 mg/L、15.31 mg/L、14.74 mg/L、14.71 mg/L。綜合菌株的溶磷促生特性分析，F(xiàn)D03 菌株雖然分泌IAA 量最高但溶磷活性較弱，故選擇溶磷促生特性均較強(qiáng)的CH07、FD11 菌株作為目標(biāo)功能菌進(jìn)行下一步研究。

表1 13 株溶磷菌溶磷能力及培養(yǎng)液的pH 值

表2 產(chǎn)IAA 能力的測(cè)定結(jié)果

2.3 溶磷菌株鑒定

2.3.1 溶磷菌株菌落形態(tài)、生理生化特征 經(jīng)平板劃線、革蘭氏染色，觀察菌株培養(yǎng)特征及形態(tài)特征（圖1），CH07在LB平板上培養(yǎng)24 h后呈圓形不透明，表面光滑，產(chǎn)芽孢，G+，細(xì)胞直桿狀。FD11 在LB平板上培養(yǎng)24 h 后菌落小而致密，干而不透明，幼時(shí)表面光滑，邊緣整齊，繼而生長(zhǎng)成絨毛狀，表面起粉，G+，細(xì)胞直桿狀。CH07 及FD11 分離物的主要生理生化特征見表3。

圖1 菌株CH07（A）及FD11（B）的菌落形態(tài)和鏡下Gram 染色圖

2.3.2 溶磷菌株16S rDNA 分子學(xué)鑒定 將測(cè)序得到菌株的16S rDNA 序列提交NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 序列比對(duì)，并將序列提交GenBank，獲得CH07 和FD11 登錄號(hào)分別為MK474942.1 和MH021963.1。使用MEGA7 軟件，通過鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果表明，菌株CH07 與Bacillus aryabhattai的序列具有最高同源性（圖2-A），菌株FD11 與Streptomyces maritimus的序列具有最高同源性（圖2-B）。

表3 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 基于菌株CH07（A）和FD11（B）16S rDNA 的neighbor-joining 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 盆栽試驗(yàn)結(jié)果

莧菜種植30 d 后，測(cè)定不同處理組莧菜的生長(zhǎng)參數(shù)，結(jié)果見表4。接種不同菌株均不同程度地促進(jìn)了莧菜的生長(zhǎng)，其中，復(fù)合菌劑1 對(duì)莧菜的促生效果最優(yōu)。從增加莧菜的株高、莖粗、葉片數(shù)、地上部鮮重方面來看，復(fù)合菌劑1 分別比對(duì)照增加14.2%、11.2%、27.7%、59.2%；菌株CH07 促生效果次之，分別比對(duì)照增加12.7%、10.9%、20.3%、46.5%；復(fù)合菌劑2 的促生效果最低，分別比對(duì)照增加2.24%、0.66%、1.13%、1.34%。復(fù)合菌劑1 及菌株CH07 與CK 相比，除莖粗差異不顯著其他差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。復(fù)合菌劑2 與CK 差異不 顯著。

表4 不同PGPR 菌株處理莧菜生長(zhǎng)性狀

3 討論

植物根際促生菌因具有多種有益生物學(xué)作用，成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。土壤中無機(jī)磷約占總磷60%-80%，磷酸鹽中又以鈣鹽為主，因此細(xì)菌解磷酸三鈣的能力可在一定程度上反映出細(xì)菌在土壤中解磷能力的強(qiáng)弱，篩選解磷酸三鈣能力較強(qiáng)的細(xì)菌用于菌肥生產(chǎn)更適合推廣應(yīng)用［10，15］。另外，很多研究者研究發(fā)現(xiàn)溶磷圈的大小和溶磷量不完全呈正相關(guān)，溶磷圈的大小并不能完全反映溶磷能力的高低［16-17］。因此，本研究以溶磷圈法作為定性測(cè)定，鉬銻抗比色法定量測(cè)定，兩者相結(jié)合，來確定菌株的溶磷能力，降低誤差。結(jié)果表明，菌株CH07 溶磷量最高為368.5 mg/L，其次是菌株FD11，溶磷量321.5 mg/L。關(guān)于溶磷量與培養(yǎng)液pH 之間的關(guān)系，之前的研究有不同的結(jié)論。部分研究顯示，細(xì)菌因產(chǎn)酸而具備溶磷能力［18-19］。本研究結(jié)果與之一致，本研究結(jié)果表明溶磷量與溶液pH 呈顯著負(fù)相關(guān)，說明溶磷與細(xì)菌產(chǎn)酸密切相關(guān)。也有學(xué)者研究認(rèn)為溶磷量與pH之間沒有相關(guān)性［20］，究其原因，主要是由于溶磷菌的溶磷機(jī)理多元化所致。對(duì)于不同菌株發(fā)酵液中產(chǎn)生有機(jī)酸種類、濃度及酸的產(chǎn)生原因有待進(jìn)一步 研究。

IAA（1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸）是一種植物生長(zhǎng)激素，在一定濃度下能提高農(nóng)作物產(chǎn)量，菌株CH07、FD11 具有產(chǎn)IAA 能力。劉澤平等［21］篩選出的根際促生菌Bacillus ginsengisoliLZP07 IAA 分泌量53.31 mg/L，鄧振山篩選的菌株中有8 株具有分泌IAA 能力，其中菌株XYN-2 能穩(wěn)定分泌IAA 36.61 mg/L［22］。前人的報(bào)道顯示高IAA 活性的菌株大多為芽孢桿菌屬，CH07 菌株經(jīng)分子和生理生化試驗(yàn)鑒定為阿耶波多氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）IAA 分泌量為30.93 mg/L；FD11 菌株鑒定為鏈霉菌（Streptomyces maritimus）IAA 分泌量為15.93 mg/L。接種莧菜均表現(xiàn)出顯著的促生作用，目前對(duì)這2 株菌的抗逆性研究正在進(jìn)行中。

盆栽試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)從玉米根際土壤中篩選出的PGPR，尤其是CH07 及CH07 與FD11 復(fù)合菌劑對(duì)莧菜生長(zhǎng)有積極作用。CH07、FD11 混合接種優(yōu)于CH07、FD11 或FD13 的單菌接種的促生效應(yīng)。促生菌株以一定比例混合培養(yǎng)，發(fā)揮了各菌株的協(xié)同促生效應(yīng)，此結(jié)果與很多的研究相一致［10，21-22］，但多菌混合，不同菌株之間也會(huì)出現(xiàn)相互拮抗的情況。本研究中混合菌劑2 就是由3 種菌混合培養(yǎng)，但該混合菌劑的促生效果相比單一菌株要弱很多，這其中原因可能是3 種菌株混合培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生了相互抑制的物質(zhì)。當(dāng)然，促生菌促進(jìn)作物生長(zhǎng)的機(jī)理是比較復(fù)雜的，除了與溶磷或分泌IAA 有關(guān)，同時(shí)也與促生菌的固氮、分泌其他生長(zhǎng)素以及菌株之間的合理比例等因素有關(guān)［23］，本試驗(yàn)中出現(xiàn)的情況還需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本研究篩選出的2 株根際優(yōu)良促生菌株，CH07、FD11 兼具溶磷、分泌生長(zhǎng)素性能，其混合培養(yǎng)的復(fù)合菌劑對(duì)莧菜生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。說明CH07、FD11 菌株具有較強(qiáng)植物促生能力，具有開發(fā)利用潛力。研究成果將為微生物菌肥的開發(fā)與生產(chǎn)提供理論和技術(shù)支持。