楊鎮(zhèn)州 劉剛 梁文

（上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院化學(xué)與電離輻射所生物計(jì)量實(shí)驗(yàn)室，上海 201203）

據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ISAAA）公布的數(shù)據(jù)表明，伴隨著生物技術(shù)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展，截至2018 年底，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積已達(dá)1.92 億hm2，大約為中國(guó)大陸面積的2 倍［1］；與此同時(shí)，美國(guó)在2009 年已批準(zhǔn)了8 種抗蟲(chóng)害轉(zhuǎn)基因新型玉米的商業(yè)化許可；加拿大等國(guó)也開(kāi)始批量開(kāi)發(fā)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因大豆等作物，我國(guó)在2009 年11 月也為轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻和轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米頒發(fā)了生物安全證書(shū)。由此可見(jiàn)，轉(zhuǎn)基因作物的相關(guān)研究和應(yīng)用將會(huì)越來(lái)越廣泛。因此各國(guó)家和地區(qū)開(kāi)始對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)管理，實(shí)施標(biāo)識(shí)制度，如歐盟規(guī)定合法轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)識(shí)閾值為0.9%，巴西、新西蘭標(biāo)識(shí)閾值為3%，俄羅斯、日本標(biāo)識(shí)閾值為5%等［2］。這一制度的采用，將轉(zhuǎn)基因安全管理變得更科學(xué)合理。與此同時(shí)，也對(duì)我們傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法的精確定量提出了更高要求。

轉(zhuǎn)基因檢測(cè)目前主要分為核酸檢測(cè)與蛋白檢測(cè)兩種［3］。相比于蛋白，核酸在生物細(xì)胞內(nèi)含量更穩(wěn)定、不易被破壞，且核酸檢測(cè)的操作簡(jiǎn)易、靈敏度更高，因此成為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的主流方法［4］。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)基本采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法（Realtime fluorescence quantitative PCR，qPCR）［5］， 但qPCR 只能實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量，并且只能夠分辨約兩倍的濃度差異（如5 000 拷貝與10 000 拷貝的差異），且對(duì)低濃度的拷貝數(shù)差異分辨能力更低。因此大多數(shù)的qPCR 在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法的應(yīng)用還停留在定性階段。數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）是一種對(duì)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行有限分割，在不同反應(yīng)微單元中進(jìn)行擴(kuò)增，最后根據(jù)泊松分布原理和陽(yáng)性單元的個(gè)數(shù)得出模板DNA 的起始拷貝數(shù)的技術(shù)。相較于傳統(tǒng)PCR技術(shù)，dPCR 有著高靈敏度、高精確度、絕對(duì)定量、反應(yīng)單元不易受干擾等優(yōu)勢(shì)［6］。因此，dPCR 技術(shù)在近年來(lái)發(fā)展飛速，已多次被報(bào)道用于轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測(cè)研究中。

轉(zhuǎn)基因品系大豆MON89788 是抗蟲(chóng)耐除草劑大豆的新品種，目前已在歐盟、韓國(guó)、墨西哥等國(guó)家被批準(zhǔn)用于商業(yè)化種植或食用。在我國(guó)，MON89788大豆于2008 年首次獲得農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的進(jìn)口安全證書(shū)，僅限原料加工。目前國(guó)內(nèi)該品系轉(zhuǎn)基因大豆的定量檢測(cè)方法主要使用普通PCR 法進(jìn)行定性檢測(cè)［7］。而國(guó)際上主要采用qPCR 進(jìn)行定量檢測(cè)［2］，尚未見(jiàn)采用dPCR 進(jìn)行精確定量檢測(cè)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以芯片式dPCR 為檢測(cè)平臺(tái)對(duì)轉(zhuǎn)基因MON89788 品系大豆進(jìn)行定量檢測(cè)方法研究，從提取方法、基因組DNA濃度檢測(cè)方法開(kāi)始進(jìn)行類(lèi)比分析，對(duì)dPCR 的反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)方法的重復(fù)性和定量限進(jìn)行評(píng)估，對(duì)其他轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)技術(shù)有著重要的借鑒 作用。

1 材料與方法

1.1 材料

植物基因組DNA 提取試劑盒（天根DP305，北京）；引物、探針（佰力格，上海）；3D 數(shù)字PCR系統(tǒng)（QuantStudioTM3D，ABI 公司）；核酸定量?jī)x（Nanodrop2000、Qubit3.0，thermo 公 司）；5%、1%和0.1%的轉(zhuǎn)基因MON89788 大豆粉末，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所制備。

1.2 方法

1.2.1 試劑盒法抽提轉(zhuǎn)基因大豆基因組 DNA 用植物基因組DNA 提取試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA 的抽提。在抽提過(guò)程中需要用到酚氯仿，以有效去除大豆材料中的多糖和多酚成分。

1.2.2 CTAB 法抽提轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA 參考GB/T 19495.3-2004 附 錄C 《CTAB-1 法 提 取DNA》進(jìn)行轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA 的抽提。

1.2.3 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件 從國(guó)內(nèi)通用的大豆 MON89788 定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中篩選品系特異序列和內(nèi)源基因的引物探針，并建立各自的PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。轉(zhuǎn)基因大豆品系的芯片dPCR反應(yīng)體系（總體積為20 μL）中，內(nèi)外源基因的正反向引物終濃度均為500 nmol/L，探針終濃度為250 nmol/L。Master mix 體 積 為10 μL，H2O 體 積 為5.5 μL。3D 芯 片dPCR 的反應(yīng)條件為：酶激活和預(yù)變性階段：96℃，10 min；循環(huán)擴(kuò)增階段：98℃/30 s，60℃/2 min，共40 個(gè)循環(huán)。升溫速率為0.8℃/s，降溫速率為1.2℃/s。

1.2.4 檢測(cè)方法的重復(fù)性 隨機(jī)抽取10 瓶轉(zhuǎn)基因含量為5%的大豆MON89788 樣品，每瓶獨(dú)立提取3 次，根據(jù)1.2.1 和1.2.2 的方法進(jìn)行DNA 抽提，隨后根據(jù)

1.2.3 的反應(yīng)體系及條件進(jìn)行dPCR。

1.2.5 方法的定量檢測(cè)限 提取轉(zhuǎn)基因含量分別為5%、1%和0.1%大豆粉末，控制基因組DNA 的濃度在100 ng/μL 左右，根據(jù)1.2.3 的反應(yīng)體系及條件進(jìn)行dPCR，每個(gè)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，并計(jì)算測(cè)得平行數(shù)據(jù)的RSD 值，以RSD＜25%作為有效定量數(shù)據(jù)的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 提取方法的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別選擇了傳統(tǒng)的CTAB 法和較通用的植物基因組抽提層析柱試劑盒法進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果見(jiàn)表1。核酸溶液在紫外260 nm 處有特征吸收峰，若A260/A280在1.8-2.0 之間，說(shuō)明核酸的純度較好。A260/A280＜1.8，說(shuō)明溶液中可能含有機(jī)試劑或蛋白雜質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，層析柱法提取大豆基因組DNA的純度顯著優(yōu)于CTAB-1 法，CTAB-1 提取的核酸A260/A280=1.68，提示可能有有機(jī)溶劑的污染。同樣的樣品量（約100 mg），層析柱法提取的濃度是傳統(tǒng)CTAB-1 法的2 倍。因此后續(xù)試驗(yàn)均采用層析柱法進(jìn)行樣品基因組提取。

表1 采用不同方法提取的轉(zhuǎn)基因MON89788 品系大豆基因組DNA

2.2 DNA模板濃度的控制

數(shù)字PCR 法的模板DNA 濃度應(yīng)該在47 000-99 723 拷貝范圍內(nèi)，從而避免低轉(zhuǎn)基因含量樣本出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因片段漏取樣的情況，也避免DNA 拷貝數(shù)過(guò)高，陽(yáng)性過(guò)載使數(shù)據(jù)精確度下降的情況。為了準(zhǔn)確調(diào)控模板的濃度范圍，必須對(duì)模板濃度進(jìn)行預(yù)估。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使用微量紫外分光光度計(jì)法及熒光檢測(cè)法分別檢測(cè)提取轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA 的濃度，并與數(shù)字PCR 結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，采用紫外分光檢測(cè)的濃度結(jié)果高于熒光檢測(cè)的濃度，可能因?yàn)樽贤夥止夥ㄊ懿糠值鞍谆蛴袡C(jī)溶劑的干擾使?jié)舛戎灯?，而熒光檢測(cè)法能特異性的與雙鏈DNA結(jié)合。但熒光檢測(cè)法定量依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立，而標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和樣品與熒光基團(tuán)的結(jié)合能力不同導(dǎo)致濃度定量的偏差，有時(shí)表現(xiàn)出濃度偏低的現(xiàn)象。

紫外分光法測(cè)定濃度和數(shù)字PCR 實(shí)際測(cè)定濃度的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為0.94，而熒光檢測(cè)法的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為0.69，說(shuō)明紫外分光法檢測(cè)濃度與數(shù)字PCR法檢測(cè)濃度相關(guān)性更好。

圖1 使用不同檢測(cè)方法測(cè)定DNA 的濃度與數(shù)字PCR 定值的線(xiàn)性關(guān)系圖

確定紫外分光法作為初步濃度預(yù)估方法后，可以根據(jù)質(zhì)量濃度和拷貝數(shù)濃度的轉(zhuǎn)換公式，計(jì)算核酸溶液的拷貝數(shù)濃度，見(jiàn)公式1：

其中C 為體積為1 μL 體積DNA 模板的拷貝數(shù)，m為1 μL 體積DNA 模板的質(zhì)量，M 為大豆的基因組DNA 的分子量（約為6.6×1011），NA 為阿伏伽德羅常數(shù)。

最終，控制模板DNA 濃度，使20 μL 反應(yīng)體系中模板DNA 拷貝數(shù)總量落在47 000-99 723 個(gè)拷貝的范圍內(nèi)。

2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)將實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法中的引物探針應(yīng)用到數(shù)字PCR 上，并對(duì)數(shù)字PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。標(biāo)準(zhǔn)方法中的引物探針序列見(jiàn)表2。數(shù)字PCR 采用終點(diǎn)法判定PCR 微反應(yīng)單元為陰性或陽(yáng)性，陽(yáng)性信號(hào)的熒光值是否足夠高十分關(guān)鍵。本文使用Quanstudio 3D 芯片數(shù)字PCR 平臺(tái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。轉(zhuǎn)基因大豆MON89788 外源基因用FAM 熒光基團(tuán)標(biāo)記，大豆內(nèi)源基因1-lectin 采用FAM 熒光基團(tuán)標(biāo)記，2-lectin 采用VIC 熒光基團(tuán)標(biāo)記，結(jié)果見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同樣來(lái)自GB 19495.5-2018 標(biāo)準(zhǔn)中的大豆內(nèi)源基因lectin 的引物探針，采用適合芯片數(shù)字PCR 的擴(kuò)增條件，在數(shù)字PCR 上的擴(kuò)增熒光信號(hào)的區(qū)分效果有很大差異。1-lectin 引物探針對(duì)的區(qū)分效果很差，陰性和陽(yáng)性信號(hào)有大量的重疊現(xiàn)象。而2-lectin 引物探針對(duì)由于陽(yáng)性孔中PCR 擴(kuò)增效果好，PCR 擴(kuò)增孔的熒光信號(hào)很高，足以和陰性信號(hào)有效區(qū)分。

2.4 方法的重復(fù)性

圖2 轉(zhuǎn)基因大豆MON89788 的芯片dPCR 擴(kuò)增圖

表2 靶基因引物探針序列

隨機(jī)抽取10 瓶含量為5%的MON89788 轉(zhuǎn)基因大豆樣品，每組獨(dú)立取3 次樣品，并獨(dú)立進(jìn)行內(nèi)源基因和外源基因dPCR 實(shí)驗(yàn)，計(jì)算并統(tǒng)計(jì)每組的轉(zhuǎn)基因含量，結(jié)果見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將本方法應(yīng)用于樣品檢測(cè)中，在考慮了提取效率對(duì)轉(zhuǎn)基因定量結(jié)果的影響下，10 組樣品中檢測(cè)重復(fù)RSD 最大的9.97%，最小的僅1.17%，均滿(mǎn)足轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)行業(yè)公認(rèn)的檢測(cè)平行數(shù)據(jù)RSD 可接受誤差25%的要求［8］，說(shuō)明本方法重復(fù)性?xún)?yōu)異。該樣品的轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)值為5%，檢測(cè)結(jié)果的示值誤差僅0.05%。

表3 5%轉(zhuǎn)基因大豆MON89788 檢測(cè)的重復(fù)性

2.5 方法的定量檢測(cè)限

提取轉(zhuǎn)基因含量為5%、1%、0.1%的MON89788 轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA，并進(jìn)行dPCR 檢測(cè)，結(jié)果 （表4）分別為5.20%、0.94%和0.11%，相對(duì)偏差分別為0.3%、-0.06%和0.01%，RSD 分別為6.2%、3.6%和15.2%。檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)偏差和RSD 均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)行業(yè)規(guī)定的偏差小于25%，因此該方法可以用于轉(zhuǎn)基因的定量檢測(cè)［9］。

3 討論

本文研究了一種芯片數(shù)字PCR 定量檢測(cè)大豆MON89788 的方法，研究?jī)?nèi)容涵蓋基因組DNA 提取方法及濃度檢測(cè)方法、引物探針的序列選擇設(shè)計(jì)、引物探針的最佳濃度、PCR 反應(yīng)過(guò)程的時(shí)間、溫度 等。運(yùn)用該方法進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)，10 組5%的轉(zhuǎn)基因大豆樣品的檢測(cè)重復(fù)性RSD 在1.17%-9.97%之間。0.1%的轉(zhuǎn)基因大豆樣品的定量示值誤差為0.01%，定量重復(fù)性RSD 為15.2%，定量限滿(mǎn)足歐盟的0.9%轉(zhuǎn)基因定量標(biāo)識(shí)限要求。

在樣品前處理階段，本方法采用試劑盒提取大豆基因組DNA，其效果優(yōu)于CTAB 法，可能的原因是：試劑盒中吸附柱更容易甩脫雜質(zhì)，而CTAB 提取方法中異丙醇與水層顏色區(qū)分不明顯、吸取DNA 不準(zhǔn)確，易帶來(lái)有機(jī)溶劑雜質(zhì)。在基因組DNA 濃度估算中，相比于熒光檢測(cè)Qubit 法，紫外分光法定量檢測(cè)提取得到的基因組DNA 濃度與數(shù)字PCR 結(jié)果一致性更高。當(dāng)基因組DNA 純度滿(mǎn)足A260/280在1.8-2.0之間時(shí)，用微量紫外分光光度計(jì)估算核酸的拷貝數(shù)濃度更可靠。

在PCR 反應(yīng)階段，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的反應(yīng)體系不能照搬到數(shù)字PCR 的反應(yīng)體系中，而陰性和陽(yáng)性信號(hào)的區(qū)分是數(shù)字PCR 定量結(jié)果準(zhǔn)確性和重復(fù)性的可靠保證。如果熒光信號(hào)閾值的拖動(dòng)會(huì)造成陽(yáng)性反應(yīng)單元數(shù)有5%以上的變動(dòng)，定量結(jié)果重復(fù)性會(huì)更差，此時(shí)需注意優(yōu)化PCR 方法。優(yōu)化數(shù)字PCR方法，優(yōu)先考慮更換引物探針序列；其次是優(yōu)化引物探針濃度，優(yōu)化PCR 反應(yīng)的延伸時(shí)間，退火溫度等反應(yīng)過(guò)程。

在轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)中，相比傳統(tǒng)的qPCR，dPCR 不需要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)［10］，也避免了昂貴的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用，以及PCR 擴(kuò)增效率差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響［11］。將該方法用于轉(zhuǎn)基因大豆的定量檢測(cè)，能為規(guī)范我國(guó)轉(zhuǎn)基因監(jiān)管工作的實(shí)施提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐和方法依靠。

表4 轉(zhuǎn)基因大豆MON89788 dPCR 定量檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)結(jié)果