王顥潛 李夏瑩 張麗 趙新 陳銳 陳笑蕓 高芳瑞 蘭青闊

王永3 張秀杰1

（1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100176；2. 中南民族大學生命科學學院，武漢 430074；3. 天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所， 天津 300381；4. 浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，杭州 310021）

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測標準物質(zhì)在轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定性與定量檢測、檢測方法研究與標準化過程中是不可缺少的物質(zhì)基礎。應用可靠的標準物質(zhì)可有效提高轉(zhuǎn)基因檢測結(jié)果可比性、有效性和溯源性，是獲得高質(zhì)量分析測定數(shù)據(jù)的保證［1］。

轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)的研制過程復雜、技術要求高，目前國際上研制轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)的單位較少，主要有美國的油脂化學家學會（American Oil Chemists’Society，AOCS）和歐盟聯(lián)合研究中心（Joint Research Center，JRC）。此外，日本國立食品綜合研究所（National Food Resear ch Institute，NFRI）和墨西哥國家計量院（The National Center of Metrology，CENAM）［2］也生產(chǎn)少量轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)。為占領轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)研制的制高點，我國自2008年開始，在轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項的支持下，也成功研制出了一系列轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)［3］。

根據(jù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測標準物質(zhì)的形態(tài)特征，可分為基體標準物質(zhì)、基因組DNA 和質(zhì)粒DNA 標準物質(zhì)3 種類型［3］。本文主要對國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)的研制現(xiàn)狀，同類或同種轉(zhuǎn)化體標準物質(zhì)的量值表達方式進行對比分析，為我國轉(zhuǎn)基因生物檢測標準物質(zhì)研制工作的進一步開展提供支撐。

1 不同研發(fā)機構轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)研制 現(xiàn)狀

1.1 歐盟轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)研發(fā)概況

歐盟研發(fā)的標準物質(zhì)有基體標準物質(zhì)和質(zhì)粒DNA 標準物質(zhì)兩種類型。由于歐盟法規(guī)規(guī)定轉(zhuǎn)基因生物的含量是以質(zhì)量百分比（mass fraction，% m/m）來衡量，因此其量值單位大多是g/kg，一般有5 個不同梯度（https：//ec.europa.eu/jrc/en/research-topic/ reference-materials-gmo-analysis）。

歐盟研發(fā)了4 個質(zhì)粒分子標準物質(zhì)，分別為ERM-AD413、ERM-AD415、ERM-AD425 和ERMAD427。值得注意的是歐盟在標準物質(zhì)使用指南中規(guī)定，在轉(zhuǎn)基因定量檢測中，應以質(zhì)量百分比的標準物質(zhì)測定結(jié)果為準，測量結(jié)果為拷貝數(shù)百分比（DNA copy number ratio，% cpT/cpE）的應轉(zhuǎn)換為質(zhì)量百分比。歐盟在2019 年10 月針對各轉(zhuǎn)化體發(fā)布了拷貝數(shù)百分比轉(zhuǎn)化為質(zhì)量百分比的轉(zhuǎn)換系數(shù)［4］。

1.2 AOCS轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)研發(fā)概況

AOCS 研制的是純品形式的標準物質(zhì)，有基體和基因組DNA 兩種類型。從AOCS 轉(zhuǎn)基因生物標準物質(zhì)目錄及量值表（https：//www.aocs.org/crm）可以發(fā)現(xiàn)，AOCS 所賦予的量值及不確定度主要從純度的角度考慮。但是，無論是相同或不同類型的標準物質(zhì)，其量值表達方式和單位均沒有達到一致。有的量值就是該轉(zhuǎn)化體本身，也不具有不確定度；有的量值和不確定度根據(jù)抽樣檢驗的結(jié)果用統(tǒng)計分析的方法計算得來。有的標準物質(zhì)有量值單位，有的則沒有量值單位。

雖然AOCS 的標準物質(zhì)在量值方面具有不一致性，但其在研制過程中盡量保證標準物質(zhì)的純度，對原材料的身份和純度進行了充分的實驗驗證。

1.3 我國轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)研發(fā)概況

我國在轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項的支持下，目前也成功研制出了一些轉(zhuǎn)基因生物標準物質(zhì)（表1）。我國標準物質(zhì)的量值測定和不確定度評估模式與歐盟模式相似，但特性量值更多樣化，不僅有質(zhì)量百分比值，還有基因的拷貝數(shù)濃度值，基因的拷貝數(shù)百分比值。質(zhì)量分數(shù)值可由PCR 測量和重量配制兩種測量方式得來。

2 相同轉(zhuǎn)化體標準物質(zhì)量值及不確定度比較

比較國際上不同研發(fā)機構生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因生物標準物質(zhì)的特點，可綜合為以下區(qū)別。

2.1 在轉(zhuǎn)化體數(shù)量上的差異

從表2 可以看到歐盟生產(chǎn)了31 個轉(zhuǎn)化體的標準物質(zhì)，其中31 個轉(zhuǎn)化體的基體標準物質(zhì)，4 個轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA 標準物質(zhì)。AOCS 生產(chǎn)了42 個轉(zhuǎn)化體的標準物質(zhì)，其中27 個轉(zhuǎn)化體的基體標準物質(zhì)，15 個轉(zhuǎn)化體的基因組DNA 標準物質(zhì)。我國生產(chǎn)了14 個轉(zhuǎn)化體的標準物質(zhì)，其中8 個轉(zhuǎn)化體的基體標準物質(zhì)，5 個轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA 標準物質(zhì)，3 個轉(zhuǎn)化體的基因組DNA 標準物質(zhì)。

AOCS 生產(chǎn)的標準物質(zhì)轉(zhuǎn)化體較全面，歐盟在制定拷貝數(shù)百分比轉(zhuǎn)化為質(zhì)量百分比的轉(zhuǎn)化系數(shù)時，也使用了AOCS 生產(chǎn)的純品標準物質(zhì)（如MON89788 轉(zhuǎn)化系數(shù)的確定）。

2.2 在標準物質(zhì)量值表達方式上的差異

歐盟以質(zhì)量百分比作為標準物質(zhì)的量值表達方式，并堅持所有的檢測結(jié)果應轉(zhuǎn)化成質(zhì)量百分比的形式。AOCS 則以純度作為標準物質(zhì)的量值表達方式。我國研發(fā)的標準物質(zhì)的量值表達方式既有質(zhì)量百分比，也有拷貝數(shù)百分比，標準物質(zhì)既有梯度形式，也有純品形式，但在量值測定和不確定度評估方面與歐盟更接近（表3）。

表1 中國轉(zhuǎn)基因生物標準物質(zhì)目錄及量值表

表2 以轉(zhuǎn)化體計不同國家/地區(qū)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因生物標準物質(zhì)情況

3 量值差異的來源

在使用不同表達方式對轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)賦值時發(fā)現(xiàn)，對于同一個標準物質(zhì)，質(zhì)量分數(shù)比為

表3 不同國家/地區(qū)生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因生物標準物質(zhì)量值表達方式

100%時，拷貝數(shù)百分比不一定為100%［4］。對于基體標準物質(zhì)和基因組DNA 標準物質(zhì)，候選物種子的遺傳特性決定了量值的差異。在植物發(fā)育過程中，種子來自父本母本生殖細胞的融合，以及后期的組織分化，最終造成種子內(nèi)部不同部位的染色體倍性、基因組成等遺傳信息不同［5-6］。

3.1 遺傳特性

單子葉和雙子葉植物的種子具有不同的遺傳特性。單子葉的種皮發(fā)育自母本胚囊的壁，為雙倍體；胚乳來自母本的雙倍體和父本的單倍體，所以為三倍體；胚含有父本和母本各一半遺傳物質(zhì)，為二倍體；且這3 種組織中DNA 總量隨物種和品種的不同存在差異。雙子葉的種皮發(fā)育自母本胚囊壁，為二倍體；胚和胚乳（停止發(fā)育）中均含有父母本各一半遺傳物質(zhì)，為雙倍體。

3.2 種子的純合性

制種特點例如自交、雜交、遠緣雜交等影響種子的純合性，父本或母本為轉(zhuǎn)基因親本對種子產(chǎn)品的影響也不同。

大豆是自交植物，因此絕大多數(shù)為純合子；玉米為典型的雜交植物，種子為雜交種，其子代含有

非轉(zhuǎn)基因、純合轉(zhuǎn)基因和雜合轉(zhuǎn)基因（1∶2∶1）?，F(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因玉米標準物質(zhì)大多數(shù)為雜交材料（即種子），而被檢材料（籽粒）大多為混合樣品，平均含有75%的轉(zhuǎn)基因籽粒（1/3 純合，2/3 雜合）。油菜有自交植物，但是在自然條件下，雜交率在5%-30%，而且其雜交品種也越來越多。菜籽多用來榨油和飼用，樣品混合度很高。

3.3 DNA提取效率

基體標準物質(zhì)研制是由轉(zhuǎn)基因陽性材料及其受體材料充分混合，形成不同重量梯度的標準物質(zhì)。但是，如果陽性與受體材料的DNA 提取效率不同，會造成從基體標準物質(zhì)中提取DNA 總量中，陽性材料DNA 與非轉(zhuǎn)基因受體DNA 比值，與經(jīng)認證的重量比（g/kg）的結(jié)果顯著偏差，導致重量比值與拷貝數(shù)比值兩種量值方式的結(jié)果不一致。

3.4 其他因素

很多其他因素造成了外源基因含量的差異，包括食用飼用的種子組織特點、品種差異、父母本差異、種子成熟度等。

4 不同量值單位的轉(zhuǎn)換

在國際現(xiàn)行的轉(zhuǎn)基因閾值標識體系中，均使用重量法來表示，因此現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)大部分以重量法來表示特性量值。但隨著數(shù)字PCR 等檢測技術［7］，質(zhì)粒DNA［3］等標準物質(zhì)研制技術和溯源體系的進步，拷貝數(shù)比值的表達方式越來越得到共識。為了保障檢測結(jié)果的一致性和互通性，歐盟引入醫(yī)療檢驗中常用的參考測量系統(tǒng)（Reference measurement systems）的概念［8-9］，提出了轉(zhuǎn)換系數(shù)（Conversion factor，CF）的概念［10］，對52 個轉(zhuǎn)化體對應的標準物質(zhì)的轉(zhuǎn)化系數(shù)進行確定，并提供了詳細的應用說明［11］。

4.1 轉(zhuǎn)換系數(shù)的確定

轉(zhuǎn)換系數(shù)是歐盟聯(lián)合實驗室（EURL-GMFF）通過試驗手段確定的，其測量不確定度最終將輸入到轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)整體不確定度當中。

其中，CFCRM為標準物質(zhì)轉(zhuǎn)換系數(shù)，cpT為外源基因拷貝數(shù)濃度（以cpT/μL 表示），cpE為內(nèi)標準基因拷貝數(shù)濃度（以cpE/μL表示），mGM為轉(zhuǎn)基因成分含量（以重量法%表示），mnonGM為非轉(zhuǎn)基因成分含量（以重量法%表示）。

4.2 轉(zhuǎn)換系數(shù)的應用

在檢測過程中，通過數(shù)字PCR 或其他方法獲得的拷貝數(shù)比值結(jié)果，除以標準物質(zhì)轉(zhuǎn)換系數(shù)CFCRM即為百分比濃度結(jié)果。

其測量不確定度計算如下：

其中，ucomb為合成不確定度，um為拷貝數(shù)比值測量中的相對不確定度，uCF為標準物質(zhì)轉(zhuǎn)換系數(shù)的不確定度。

由于與轉(zhuǎn)換系數(shù)相關的不確定度較低，因此最終結(jié)果的擴展不確定度估計數(shù)僅略微增加。

表4 展示了對模擬混合樣品檢測結(jié)果的轉(zhuǎn)換過程。模擬樣品中含有MON-89788 -1 大豆、DAS-4?278 -9 玉米、MON-??863 -5 玉米，經(jīng)數(shù)字PCR方法檢測獲得拷貝數(shù)比值結(jié)果（%GM，cpT/cpE）。應用CFCRM，對定量結(jié)果進行轉(zhuǎn)化，獲得重量法比值結(jié)果（%GM，m/m）。

表4 轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)量值轉(zhuǎn)換系數(shù)應用示例

5 建議

5.1 集成技術成果，確定研究重點與研制策略

自2008 年開始，我國啟動了轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項“轉(zhuǎn)基因成分檢測標準物質(zhì)”，系統(tǒng)建立了涵蓋候選物鑒定、制備、聯(lián)合定值、不確定度評估、試用性評價等關鍵環(huán)節(jié)的轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)研制技術體系，發(fā)布了一系列技術標準［12-20］，成功研制出了一系列轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)［3］。Wu 等［21］在對現(xiàn)有技術成果總結(jié)的基礎上，提出了轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)研制策略，為今后標準物質(zhì)研制提供了思路和參考。其中，對于基體標準物質(zhì)，建議以純品為主，量值形式包括重量比值和拷貝數(shù)比值；對于基因組DNA 標準物質(zhì)，建議以葉片為材料，量值包括拷貝數(shù)濃度和拷貝數(shù)比值；對于質(zhì)粒DNA 標準物質(zhì)，以多靶標、定性檢測陽性對照為定位，主要用于非授權檢測。

5.2 加強合作共贏，建立國內(nèi)外交流機制

對比歐盟、美國和我國的轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)研發(fā)進展發(fā)現(xiàn)，在標準物質(zhì)類型、轉(zhuǎn)化體種類、量值表達等方面均存在差異；歐盟和美國研發(fā)的轉(zhuǎn)化體僅有1 項重復；我國研發(fā)重點在于國內(nèi)具有產(chǎn)業(yè)化前景的轉(zhuǎn)化體；但整體求同存異，并通過轉(zhuǎn)換系數(shù)等方法達到量值的統(tǒng)一。

為了維護我國轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)研發(fā)技術的先進性，避免重復研制，建議建立國內(nèi)外合作交流機制，以信息交換、聯(lián)合攻關為重點，在實現(xiàn)資源共享的同時，優(yōu)勢互補，不僅可以提高標準物質(zhì)的質(zhì)量，也對未來全球標準物質(zhì)的發(fā)展、等效一致的量傳溯源體系的推進意義重大。

5.3 緊跟上游研發(fā)，擴寬新型標準物質(zhì)領域

隨著社會和經(jīng)濟的發(fā)展，標準物質(zhì)的應用領域不斷拓展。當前國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)集中為轉(zhuǎn)基因作物，而在轉(zhuǎn)基因動物、新型轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品涉及較少。為保持技術領先地位，應緊跟轉(zhuǎn)基因新產(chǎn)品、新技術發(fā)展態(tài)勢，擴寬新型標準物質(zhì)領域，做好技術儲備。主要包括基因編輯產(chǎn)品、RNAi 產(chǎn)品、轉(zhuǎn)基因動物標準物質(zhì)等?；蚓庉嫯a(chǎn)品標準物質(zhì)的研制可以從質(zhì)粒DNA 構建上突破。李蔥蔥等［22］以MSTN基因編輯動物為研究對象，構建了編輯型和野生型質(zhì)粒對照。其中編輯型含有MSTN基因序列147 bp，野生型含有149 bp，編輯型較野生型少了2個堿基，形成一個［AG］缺失的InDel 標記，并以該InDel 標記位點為靶標，建立了基于焦磷酸測序技術的基因編輯產(chǎn)品定量檢測方法。

5.4 圍繞產(chǎn)品應用，做好技術培訓和應用指導

轉(zhuǎn)基因檢測過程復雜，特別是在轉(zhuǎn)基因定量檢測過程中，涉及DNA 提取效率、定值結(jié)果表述、測量不確定度評估等難點［23］。為更好達到測量值的準確性、一致性，轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)研發(fā)機構應做好標準物質(zhì)應用的技術培訓，在難點和細節(jié)上進行技術指導。目前國內(nèi)外的標準物質(zhì)均附有標準物質(zhì)證書及簡單的使用說明，但信息量明顯不足。建議圍繞轉(zhuǎn)基因檢測標準物質(zhì)應用，結(jié)合檢測技術標準，開展測量不確定度評估［24］、基于數(shù)字PCR 的轉(zhuǎn)基因定量檢測、拷貝數(shù)比值量值標準物質(zhì)應用等內(nèi)容的技術培訓。