劉梅芳， 孫 悅， 李 麗

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東日照276826）

肥胖是一種以體內(nèi)脂肪含量過多為重要特征的慢性疾病，是脂肪肝、糖尿病、高血壓和心臟病的高危因素［1］。預(yù)防和治療肥胖對(duì)于維護(hù)機(jī)體健康具有重要意義。枸骨葉是冬青科冬青屬植物枸骨的干燥葉片，又稱“角刺茶”和“功勞葉”。枸骨葉與同科屬的大葉冬青和苦丁茶冬青一起作為苦丁茶的主要來源［2］?；谥袊?guó)傳統(tǒng)藥食同源的理論，苦丁茶的藥用價(jià)值已經(jīng)受到廣泛關(guān)注，很多學(xué)者對(duì)苦丁茶冬青及大葉冬青的化學(xué)成分與藥理作用做了深入研究，而對(duì)枸骨葉的研究相對(duì)較少?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，枸骨葉提取物具有抑菌、抗氧化、免疫抑制、降血壓、抑制心肌收縮力和降血脂等多種作用［3-7］。枸骨葉水提物（Ilex cornuta aqueous extract，ICAE）可以劑量依賴性降低高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥［6］，能夠抑制膽固醇合成酶，具有降血脂和抗脂肪肝的作用［7］。但是枸骨葉水提物是否具有減肥作用，是否影響脂肪分化過程尚未見報(bào)道。本研究采用高脂飲食（high-fat diet，HFD）誘導(dǎo)小鼠肥胖模型，以目前常用的減肥藥奧利司他（orlistat）作為陽性對(duì)照藥，觀察ICAE對(duì)肥胖的預(yù)防作用，并進(jìn)一步采用大鼠附睪來源的分化脂肪細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，研究ICAE對(duì)脂肪分化的影響。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，許可證號(hào)為SCXK（魯）2014-0007。6周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠6只，體重150～160 g，用于前脂肪細(xì)胞的原代培養(yǎng)。7～8周齡清潔級(jí)雄性昆明小鼠50只，體重25～30 g，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，分選出體質(zhì)量相似的小鼠39只，分成4組，采用HFD誘導(dǎo)小鼠肥胖，orlistat作為陽性對(duì)照藥［8］，觀察ICAE對(duì)肥胖的預(yù)防作用。動(dòng)物分為對(duì)照（control）組、肥胖模型（obesity model）組、orlistat治療組和ICAE治療組，除對(duì)照組外，其余3組小鼠均給予HFD。ICAE治療組給予ICAE 100 mg·kg-1·d-1（相 當(dāng) 于 生 藥 濃 度 3 g·kg-1·d-1）［6-7］，orlistat治療組給予 orlistat混懸液 60 mg·kg-1·d-1［9］于每天上午 9：00～10：00 灌胃給藥，連續(xù) 5周，對(duì)照組則灌胃等體積生理鹽水；在實(shí)驗(yàn)的第5周，連續(xù)5 d監(jiān)測(cè)各組小鼠24 h平均攝食量；末次給藥當(dāng)晚禁食，次日對(duì)動(dòng)物進(jìn)行稱重和取材。每組隨機(jī)選取3只小鼠，麻醉后經(jīng)心臟灌流4%多聚甲醛進(jìn)行組織固定，然后取材，用于后續(xù)切片染色。其余小鼠摘眼球取血，分離血清，-80℃冰箱凍存，用于血糖、血清總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglyceride，TG）的測(cè)定；取血后的小鼠脫頸椎處死后打開腹腔，取出附睪周圍脂肪、腎周脂肪、腹股溝皮下脂肪及肝臟，準(zhǔn)確稱量其濕重。

2 主要試劑和儀器

ICAE干粉和高脂飼料由本實(shí)驗(yàn)室自制；orlistat膠囊（舒爾佳）購自山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)所需低糖DMEM培養(yǎng)液和DMEM/F12培養(yǎng)液，前脂肪細(xì)胞分離和分化所需Ⅰ型膠原酶、三碘甲狀腺原氨酸（T3）、胰島素和生物素均購自Sigma；四季青胎牛血清購自浙江天杭科技有限公司；膽固醇、HE染色試劑盒、血糖、血清TG和TC測(cè)定試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗脂滴包被蛋白1（perilipin 1，Plin1）抗體和兔抗激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive lipase，HSL）抗體由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院Constantine Londos教授惠贈(zèng)；兔抗過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor 8，PPARγ）抗體購自Abcam；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔II抗購自Sigma；尼羅紅染液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

3 主要方法

3.1 ICAE的制備 枸骨葉采于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院日照校區(qū)本草園，洗凈晾干后放入烘箱烘干備用。采用煎煮法制備ICAE［5］。將干燥枸骨葉粉碎，過篩，得到細(xì)粉；稱取粉末30 g，加500 mL蒸餾水浸泡30 min后煎煮1 h，然后用紗布分離藥渣，再加500 mL蒸餾水，重復(fù)煮2次，每次1 h；合并3次煎液進(jìn)行抽濾，得到澄清水煎液，此澄清水煎液經(jīng)初步濃縮后放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)，最終形成棕黃色浸膏；將浸膏轉(zhuǎn)入坩堝內(nèi)，放入干燥箱干燥成ICAE干粉。制備2次ICAE，共得到干粉1.984g，-20℃凍存，臨前用配制。

3.2 高脂飼料的制備 誘導(dǎo)小鼠肥胖所用高脂飼料系本實(shí)驗(yàn)室手工制作而成。參考常用的高脂飼料配方［8-9］，為提高肥胖誘導(dǎo)效果并縮短造模周期我們對(duì)配方進(jìn)行了改良，提高了飼料中豬油的含量。配方如下：基礎(chǔ)飼料66%、膽固醇1%、豬油20%、蛋黃粉10%、淀粉3%。材料準(zhǔn)備：基礎(chǔ)飼料粉碎后過篩，得到細(xì)粉；雞蛋煮熟，取蛋黃，烘干后，碾碎過篩，得到蛋黃粉；用新鮮肥肉煉制豬油；用木薯淀粉做淀粉糊。制作過程：首先在容器內(nèi)將基礎(chǔ)飼料細(xì)粉和蛋黃粉混勻，將膽固醇加入豬油中溶解；然后將豬油分次加入到粉末中抓勻，最后加入淀粉糊，和成面團(tuán)，用去掉前端的5 mL注射器將面團(tuán)拓成短圓柱形，再放入烘箱50℃烘干。為防止飼料變質(zhì)，待烘干和烘干后的飼料均放在-20℃冰箱保存。

3.3 HE染色 經(jīng)灌注取材后的附睪周圍脂肪組織，放入4%多聚甲醛中繼續(xù)固定12 h，然后浸入20%蔗糖溶液中過夜，經(jīng)過脫水，透明，浸蠟，包埋成蠟塊。切片厚度設(shè)定為8μm，染色步驟遵循試劑盒說明書進(jìn)行，染色結(jié)束后進(jìn)行梯度乙醇脫水，二甲苯透明以及中性樹膠封片，晾干后拍照。

3.4 大鼠附睪周圍脂肪組織來源前脂肪細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 采用酶消化法分離大鼠附睪周圍脂肪來源的前脂肪細(xì)胞［10］。首先將SD大鼠斷頭處死，取附睪周圍脂肪墊，快速剪碎后加入膠原酶Ⅰ工作液（含0.8 g/L膠原酶Ⅰ和1%牛血清白蛋白的KRB溶液），37℃水浴搖床內(nèi)消化40～50 min使脂肪細(xì)胞完全離散。消化結(jié)束后加入DMEM培養(yǎng)液20 mL進(jìn)行稀釋，然后用100目濾網(wǎng)過濾，靜置10 min，使脂肪細(xì)胞自然上浮，吸取下層液體，此液體內(nèi)含有前脂肪細(xì)胞。用含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)液將前脂肪細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)。培養(yǎng)24 h后，換入無血清分化液（含有胰島素5 mg/L、T3 200 pmol/L和生物素33 μmol/L的DMEM/F12培養(yǎng)液）啟動(dòng)分化3 d，然后更換為無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，ICAE組加入過濾除菌后的ICAE貯備液，使終濃度為100 mg/L［5］；對(duì)照組給予同等體積的生理鹽水。給藥處理3 d后，用倒置相差顯微鏡進(jìn)行活細(xì)胞攝相。

3.5 Western blot 給藥處理3 d后的分化脂肪細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取蛋白，用于Western blot檢測(cè)［10］。蛋白分離采用10%SDS-PAGE，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉后加入I抗，4℃孵育過夜，漂洗3次，孵育辣根過氧化酶標(biāo)記的II抗，洗滌同前。用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒發(fā)光、顯影和定影。發(fā)光后的膜用膜再生液洗去結(jié)合的抗體，重新孵育抗體檢測(cè)其它蛋白。

3.6 脂滴的尼羅紅染色 尼羅紅染色觀察分化脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴的變化［10］。前脂肪細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片，在加入分化液誘導(dǎo)后的第1～6天，每日取出部分細(xì)胞爬片，經(jīng)PBS洗滌后，加入4%多聚甲醛PBS溶液室溫固定20 min，然后加入尼羅紅染液避光染色10 min分鐘，PBS洗滌2次后用75%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察和拍照。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，采用Prism 8.02軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組之間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD）法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ICAE對(duì)HFD小鼠體重、脂肪重量、肝重和攝食量的影響

與對(duì)照組相比，肥胖模型組小鼠體重，附睪、腎臟和腹股溝周圍脂肪及肝臟重量均顯著增加（P＜0.01）；ICAE治療組和orlistat治療組與肥胖模型組相比，此5項(xiàng)指標(biāo)均顯著下降（P＜0.01）。從攝食量看，ICAE治療組和肥胖模型組小鼠的攝食量顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）；ICAE治療組小鼠攝食量與肥胖模型組相比略有降低，但是無顯著性差異，而orlistat治療組小鼠攝食量顯著高于肥胖模型組和ICAE治療組（P＜0.01），與對(duì)照組相比無顯著差異，見圖1。

2 ICAE對(duì)HFD小鼠血脂的影響

肥胖模型組小鼠血清TG和TC水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），但是血糖無顯著變化；與肥胖模型組相比，orlistat治療組血清TG和TC水平顯著下降（P＜0.01），ICAE治療組血清TC和TG也降低（P＜0.05），但降低幅度較小，與orlistat治療組相比有顯著差異（P＜0.05），見圖2。

3 ICAE對(duì)HFD小鼠脂肪組織形態(tài)的影響

附睪周圍脂肪組織HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組脂肪細(xì)胞直徑小，有較多胞漿；肥胖模型組脂肪細(xì)胞顯著增大，與對(duì)照組相比直徑增加約1倍；ICAE治療組和orlistat治療組與肥胖模型組相比，脂肪細(xì)胞直徑均顯著減小，見圖3。

Figure 1.Effects of ICAEon body weight，epididymal fat weight，perirenal fat weight，inguinal fat weight，liver weight，and food intake of HFD-induced mice.Mean±SEM.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs obesity model group；△△P＜0.01 vs orlistat group.圖1 ICAE對(duì)HFD小鼠體重、附睪周圍脂肪、腎周脂肪、腹股溝脂肪、肝臟重量及攝食量的影響

Figure 2.Effects of ICAE on serum triglyceride（TG），total cholesterol（TC）and glucose levels in HDF-induced mice.Mean±SEM.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs obesity model group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs orlistat group.圖2 ICAE對(duì)HFD小鼠血清甘油三酯、總膽固醇和葡萄糖水平的影響

4 ICAE對(duì)分化脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴的影響

Figure 3.Influences of ICAE on epididymal adipose tissue of HFD-induced mice.Photomicrographs of epididymal adipose tissue of different groups with HEstaining.圖3 ICAE對(duì)HFD小鼠附睪周圍白色脂肪組織形態(tài)的影響

正常情況下，在分化液的誘導(dǎo)下大鼠前脂肪細(xì)胞可以分化成為多房脂肪細(xì)胞，分化各天細(xì)胞內(nèi)脂滴的特點(diǎn)如圖4A所示。加入分化液誘導(dǎo)1 d，細(xì)胞由原來的梭形變成多角形，胞漿內(nèi)有非常微小的脂滴；誘導(dǎo)分化2 d，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)簇狀分布的小脂滴；誘導(dǎo)分化3 d，脂滴直徑顯著增加，分布在胞漿內(nèi)。誘導(dǎo)分化3 d后，將分化液更換為無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，細(xì)胞內(nèi)脂滴繼續(xù)增大，較大的脂滴位于細(xì)胞中央。為觀察ICAE對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響，本研究在為細(xì)胞更換為無血清DMEM/F12培養(yǎng)液后，給予ICAE（終濃度為100 mg/L）處理3 d。結(jié)果顯示，對(duì)照組脂肪細(xì)胞分化程度較為一致，大部分細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)較大脂滴，符合第6天分化脂肪細(xì)胞的特點(diǎn)；而ICAE處理組大部分細(xì)胞內(nèi)脂滴較小，符合第3～4天分化脂肪細(xì)胞的特點(diǎn)，見圖4B。

Figure 4.Effects of ICAE on lipid droplet accumulation in rat differentiated adipocytes.A：the morphological changes of lipid droplets in rat differentiated adipocytes form day 1 to day 6 after induction.Preadipocytes were initiated with differentiation media for 72 h，and then the differentiated media were replaced by serum-free DMEM/F12 media.Cells were fixed and stained with Nile red and visualized with fluorescence microscopy on various days.B：effects of ICAE on the lipid accumulation of differentiated adipocytes.On day 3 of differentiation，rat differentiated adipocytes were treated with or without 100 mg/L ICAEafter medium replacement.On day 6 of differentiation，living cells were visualized by microscopy圖4 枸骨葉水提物對(duì)大鼠分化脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴積累的影響

5 ICAE對(duì)脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

利用Western blot觀察ICAE對(duì)脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，100 mg/L ICAE孵育3 d，可以顯著抑制分化脂肪細(xì)胞PPARγ的蛋白表達(dá)（P＜0.01），并且使脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志物Plin1和HSL的蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.01），見圖5。

Figure 5.Effects of ICAEon the protein expression of PPARγ，Plin1 and HSL in rat differentiation adipocytes.On day 3 of differentiation，rat differentiated adipocytes were treated with or without ICAE（100 mg/L）.On day 6 of differentiation，the protein levels of PPARγ，Plin1 and HSL were detected by Western blot.Mean±SEM.n=3.**P＜0.01 vs control group.圖5 ICAE對(duì)大鼠分化脂肪細(xì)胞PPARγ、Plin1和HSL蛋白表達(dá)的影響

討 論

1 ICAE可抑制HFD誘導(dǎo)的小鼠肥胖

肥胖已被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為影響健康的五大危險(xiǎn)因素之一。治療肥胖的常用方法是藥物治療，但是很多減肥藥具有嚴(yán)重副作用，目前orlistat是國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)的唯一一種減肥藥。近些年來，大量研究致力于從植物來源的天然產(chǎn)物中尋找新型安全有效的減肥藥物［9，12］。枸骨葉是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，有文獻(xiàn)報(bào)道ICAE具有降血脂的功效［6-7］，但其是否具有減肥作用，尚未見報(bào)道。HFD誘導(dǎo)小鼠肥胖是較為理想的肥胖動(dòng)物模型，可以模擬人類肥胖的發(fā)病過程和機(jī)制［8］。本實(shí)驗(yàn)采用改良的高脂飼料，選用成年雄性昆明小鼠進(jìn)行造模［8］，成功建立小鼠肥胖模型。HFD喂養(yǎng)5周后，肥胖模型組小鼠的體重、腹內(nèi)和皮下脂肪組織重量以及肝重均顯著高于正常對(duì)照組，這說明本研究所用高脂飼料的配方、制作和保存方法合理可行。ICAE處理組小鼠體重、附睪、腎臟、腹股溝周圍脂肪組織以及肝重，與肥胖模型組相比均顯著降低，且ICAE對(duì)上述指標(biāo)的降低作用與orlistat相比無顯著性差異。這說明ICAE作用效果與orlistat相當(dāng)。血脂測(cè)定結(jié)果顯示，ICAE可以顯著降低血清TG和TC水平，這與前人報(bào)道一致［6-7］。曾慶峰等［6］研究結(jié)果顯示ICAE可以劑量依賴性降低HFD誘導(dǎo)的大鼠高脂血癥，6 g/kg ICAE的降血脂效果與1.33 mg/kg辛伐他汀相當(dāng)。本研究觀察到ICAE降血脂的效果較弱，這可能與所用劑量較低有關(guān)。

2 ICAE對(duì)攝食量無顯著影響

攝食量是影響體重變化的重要因素。研究結(jié)果顯示，ICAE治療組小鼠的攝食量與肥胖模型組相比略有降低，但無顯著性差異，這說明ICAE對(duì)攝食量無顯著影響。肥胖模型組和ICAE治療組小鼠攝食量顯著低于對(duì)照組，這可能是由于富含脂肪、膽固醇和蛋白的飼料容易使小鼠產(chǎn)生飽腹感，并延緩胃排空。出乎意料的是，orlistat治療組小鼠攝食量顯著高于肥胖模型組和ICAE治療組。實(shí)驗(yàn)中還觀察到，orlistat治療組小鼠與其它組小鼠相比，排出的糞便量較多，質(zhì)地較軟且具有油性光澤。馮孔龍等［11］在HFD誘導(dǎo)的大鼠肥胖模型中也觀察到orlistat治療組攝食量高于肥胖模型組。這可能是由于orlistat抑制脂類食物的消化吸收，降低了食物的轉(zhuǎn)化率，導(dǎo)致動(dòng)物攝食量代償性增加。從攝食量的變化分析，ICAE的減肥機(jī)制可能與orlistat有所不同。

3 ICAE抑制脂肪細(xì)胞肥大和脂肪細(xì)胞分化

脂肪組織是機(jī)體主要的能量貯庫，長(zhǎng)期能量攝入過多，會(huì)使脂肪細(xì)胞體積和數(shù)目持續(xù)增加，最終導(dǎo)致肥胖。附睪周圍組織HE染色結(jié)果顯示，ICAE可以顯著減小附睪周圍脂肪組織脂肪細(xì)胞的直徑，其作用效果與orlistat相當(dāng)。這提示ICAE可能具有抑制脂肪細(xì)胞肥大的作用。本研究采用了大鼠附睪周圍脂肪組織來源的分化脂肪細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步研究。結(jié)果表明，ICAE可以顯著抑制分化脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴的積累，并且降低Plin1和HSL的蛋白表達(dá)。分化脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴的大小在一定程度上可以反映脂肪細(xì)胞的成熟度［12-13］；Plin1和HSL是成熟脂肪細(xì)胞表達(dá)的功能蛋白，在脂滴TG的貯存和分解中發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是脂肪細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志物［12］。所以，此結(jié)果提示ICAE具有抑制脂肪細(xì)胞分化成熟的作用。PPARγ是脂肪細(xì)胞分化過程所必需的轉(zhuǎn)錄因子，能與視黃醛X受體α形成異源二聚體，促進(jìn)大多數(shù)與脂肪發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)［13］。有文獻(xiàn)報(bào)道PPARγ基因的表達(dá)水平與脂肪細(xì)胞的大小及脂肪細(xì)胞的分化程度呈正相關(guān)［14］，PPARγ拮抗劑能阻止前脂肪細(xì)胞分化，并抵抗HFD引起的脂肪細(xì)胞過度肥大［15］。本研究顯示，ICAE可以顯著抑制分化脂肪細(xì)胞PPARγ的蛋白表達(dá)。因此ICAE抑制脂肪細(xì)胞肥大和分化的作用可能與下調(diào)PPARγ的蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究證實(shí)了ICAE對(duì)HFD誘導(dǎo)的小鼠肥胖具有預(yù)防作用，但對(duì)其攝食量無明顯影響；ICAE可以顯著抑制脂肪細(xì)胞分化，此作用可能與抑制PPARγ的蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究將為ICAE在預(yù)防和治療肥胖方面的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。