謝一瀲， 楊乃彬， 王麗萍， 宣艷艷， 鄔怡怡， 錢國清， 石潔君， 史光俠， 李國祥

（寧波市第一醫(yī)院感染科，浙江寧波315000）

由缺血、藥物、外源性毒物及其代謝產物和感染等各種病因引起的急性肝損傷（acute hepatic injury，AHI）臨床上十分常見，其病情發(fā)展迅速、兇險，如果未得到及時的控制和治療，將會發(fā)展為急性肝衰竭，成為危及人類生命的重要疾病之一。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）/D-氨基半乳糖（D-galactosamine，DGalN）聯合注射更能模仿人類的急性爆發(fā)性肝衰竭的發(fā)生，因此LPS/D-GalN誘導的動物模型是研究急性肝損傷最常用的模型［1］。

姜黃素（curcumin，CUR）是從香料姜黃的根莖中提取的一種酚類化合物，其藥理作用廣泛，具有抗氧化、抗炎、抗纖維化、抗腫瘤、抗菌以及調節(jié)免疫的功能，對于各類肝損傷有不同的預防或治療效果［2］。多項研究發(fā)現，姜黃素可通過調節(jié)自噬發(fā)揮作用。Guo等［3］報道，姜黃素能激活自噬保護細胞免受過氧化氫誘導的損傷和減緩細胞凋亡。Yao等［4］認為，姜黃素可通過增強自噬、減輕凋亡，從而改善糖尿病相關心肌病變。張豪杰等［5］研究發(fā)現，姜黃素減輕小鼠腎臟再灌注損傷的作用可能與其促進再灌注后細胞自噬相關。目前國內外關于姜黃素對LPS/D-GalN誘導的急性肝損傷影響的研究較少，我們既往的研究顯示姜黃素對LPS/D-GalN誘導的大鼠急性肝損傷有一定治療作用［6］，基于此，本實驗擬從細胞自噬的角度，探討姜黃素減輕LPS/D-GalN誘導的大鼠急性肝損傷的機制。

材料和方法

1 動物

SPF級雄性SD大鼠，購入時6周齡，實驗時體重為180 g左右，購自上海斯萊克公司，購入后在SPF級動物房適應性飼養(yǎng)1周。

2 主要試劑

LPS、D-GalN、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）和姜黃素均購自Sigma；兔抗小鼠微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）和beclin 1抗體購自Cell Signaling Technology；ELISA檢測試劑盒購自eBioscience。

3 主要方法

3.1 急性肝損傷動物模型的建立及實驗分組 采用腹腔注射800μL的LPS（8μg/kg）及D-GalN（800 mg/kg）制造急性肝損傷動物模型，劑量根據我們既往的研究得出［6］。實驗動物采用隨機數字表法隨機分為5組，分別為對照（control）組、AHI組、CUR組、3-MA組和3-MA+CUR組，每組6只。對照組給予等體積生理鹽水腹腔注射，其余各組均建立急性肝損傷模型；姜黃素組每天給予姜黃素溶液120 mg/kg（溶于0.5%CMC-Na），5 mL/kg灌飼大鼠1次，連續(xù)5 d后建立急性肝損傷模型，對照組、AHI組和3-MA組每天給予等體積0.5%CMC-Na灌胃5 d。3-MA組在建立急性肝損傷模型前2 h腹腔注射2.5 mg/kg 3-MA［7］。3-MA+CUR組于肝損前5天給予120 mg/kg姜黃素溶液灌飼，然后在建立急性肝損傷模型前2 h腹腔注射2.5 mg/kg 3-MA。在肝損模型建立12 h后處死大鼠并收取血及肝組織；血清存放于-80℃冰箱，病理組織樣本浸泡于4%甲醛，肝組織經液氮瞬時冷凍后轉移至-80℃冰箱備用。

3.2 血液生化指標檢測 將獲得的血清采用全生化分析儀檢測大鼠血清谷丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平。

3.3 肝組織切片病理變化的觀察 肝組織標本于4%甲醛溶液固定后，進行脫水、浸蠟、包埋、切片和HE染色，于正置顯微鏡下觀察肝臟組織的病理學形態(tài)變化。

3.4 透射電鏡觀察自噬體 肝組織標本于2.5%戊二醛磷酸緩沖液中固定后，進行沖洗、后固定、染色、沖洗、脫水、包埋、切片，采用4%醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色，最后將染色后的超薄切片放到單孔銅網上，于透射電鏡下觀察。

3.5 Western blot檢測自噬相關蛋白的表達 取0.1 mg肝臟組織，加入裂解液充分勻漿，離心后取上清液。先用雙喹啉-4-羧酸二鈉鹽蛋白分析試劑盒測定樣本內蛋白濃度，再用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，并轉膜。室溫下封閉1 h，搖床上洗滌5 min，移入含有I抗（抗LC3和beclin 1抗體）的孵育盒中，4℃孵育過夜。再在搖床上洗滌3次，移到含II抗（goat anti-rabbit IgG和goat anti-mouse IgG，1∶5 000稀釋）的抗體孵育盒中，于室溫搖床上孵育2 h。洗滌3次后加入底物并曝光顯影。應用生物電泳圖像分析系統(tǒng)測定條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達水平。

3.6 腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的ELISA檢測 取保存的血清，按照ELISA試劑盒說明書操作檢測細胞因子TNF-α的含量。

4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示，多組樣本均數之間比較采用單因素方差分析，若各組總體方差齊同，則采用SNK-q檢驗，若方差不齊，則采用Tamhane檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 各組大鼠血清ALT和AST水平

與對照組比較，AHI組ALT和AST水平顯著升高（P＜0.05）；與AHI組比較，姜黃素組的ALT和AST水平顯著下降（P＜0.05）；與姜黃素組比較，3-MA組及3-MA+CUR組的ALT和AST水平均顯著升高（P＜0.05），但與肝損傷組比較差異均無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05），見圖1。

2 肝組織切片病理學的變化

正常對照組肝細胞輕度水腫，未見明顯病變。肝損傷組可見約50%的肝細胞壞死，壞死的肝細胞核碎裂、胞漿深染，壞死區(qū)可見較多炎細胞浸潤。姜黃素組的壞死細胞較肝損傷組顯著減少，炎細胞浸潤相對較輕。而3-MA組及3-MA+姜黃素組較肝損傷組無明顯變化，見圖2。

Figure 1.The serum levels of ALT and AST in various groups.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs AHI group；#P＜0.05 vs CUR group.圖1 大鼠血清ALT和AST水平的變化

Figure 2.Pathological changes of rat liver tissues in various groups（HEstaining，×100）.A：control group；B：AHIgroup；C：CUR group；D：3-MA group；E：3-MA+CURgroup.圖2 各組大鼠肝組織的病理變化

3 電鏡下觀察自噬體的情況

正常對照組無明顯自噬體形成，線粒體嵴和膜形態(tài)正常。AHI組可見較多自噬小體形成，線粒體膜、核膜和細胞膜不完整、線粒體嵴間隙加大、消失。姜黃素組可見大量自噬小體形成。3-MA組及3-MA+CUR組自噬體較姜黃素組明顯減少，見圖3。

Figure 3.Autophagic bodies of the liver tissue were observed by transmission electron microscopy（×10 000）.A：control group；B：AHIgroup；C：CURgroup；D：3-MA group；E：3-MA+CURgroup.圖3 各組大鼠肝組織的透射電鏡下自噬體的觀察

4 各組大鼠肝組織內自噬相關蛋白LC3及beclin 1的表達情況

與對照組比較，AHI組大鼠的LC3-Ⅱ及beclin 1蛋白表達量均上調（P＜0.01）；與AHI組比較，姜黃素組的LC3-II及beclin 1蛋白表達量均上調（P＜0.01）；與姜黃素組比較，3-MA組及3-MA+CUR組的LC3-II及 beclin 1蛋白表達量均顯著下降（P＜0.01），見圖4。

Figure 4.The protein levels of LC3 and beclin 1 in the liver tissues in variousgroupsdetected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group；△△P＜0.01 vs AHI group；##P＜0.01 vs CURgroup.圖4 肝組織自噬蛋白LC3和beclin 1蛋白水平的變化

5 各組大鼠血清TNF-α表達情況

AHI組大鼠血清TNF-α含量較對照組顯著升高（P＜0.01）；姜黃素組大鼠血清TNF-α含量較AHI組顯著下降（P＜0.01）；3-MA組及3-MA+姜黃素組大鼠的血清TNF-α含量較姜黃素組明顯增高（P＜0.01），見圖5。

討 論

Figure5.The serum levels of TNF-αin various groups detected by ELISA.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；△△P＜0.01 vs AHIgroup；##P＜0.01 vs CURgroup.圖5 各組大鼠血清TNF-α含量的比較

自噬是真核生物細胞中一種高度保守的代謝途徑，負責處理受損的細胞器和錯誤折疊的蛋白，并在惡劣條件下為機體提供充分的能量，因此，自噬對機體在應激狀態(tài)下維持細胞內平衡、細胞生存和內環(huán)境穩(wěn)定起關鍵作用。此外，自噬對炎癥有著重要的調節(jié)作用，可影響炎癥疾病的病理進程，其重要作用與肝臟、肌肉等代謝性器官密切相關［8］。

近年來許多研究表明，自噬在LPS/D-GalN誘導的急性肝損傷中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。LPS/D-GalN作用于肝臟后，可誘導肝臟巨噬細胞大量釋放促炎因子引起應激反應，過度表達的促炎因子如TNF-α、持續(xù)大量的活性氧簇（reaction oxidation species，ROS）等會造成線粒體或其它細胞器的損傷。如果受損的細胞器沒有通過適應性反應得到處理，就會發(fā)生細胞死亡或者凋亡。而自噬就是一種適應性反應。Amir［9］等發(fā)現，在 LPS/D-GalN 誘導的急性肝損傷模型中，抑制肝臟特異性自噬會加重TNF-α誘導的肝損傷；Ilyas等［10］在巨噬細胞特異性敲除Atg5模型中，用LPS/D-GalN注射，刺激急性肝損傷小鼠中發(fā)現敲除組小鼠肝損傷較對照組加重，依賴炎性小體產生的血清白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）顯著增加，提示敲除組小鼠炎癥小體活性增加，故加重了急性肝損傷。魏琳琳等［11］也發(fā)現，在LPS/D-GalN誘導的小鼠急性肝衰竭的早中期，肝細胞自噬逐漸增強，可能起保護性作用。以上研究均提示自噬參與LPS/D-GalN誘導的急性肝損傷的調控，并在其中發(fā)揮保護作用。

目前觀察自噬現象最直接、最經典的方法是通過透射電子顯微鏡發(fā)現自噬體，這是自噬檢測的“金標準”。而LC3和beclin 1是反映自噬水平的最常用的蛋白。LC3是重要細胞骨架輔助成分，分為LC3-I和LC3-Ⅱ，自噬發(fā)生時LC3-I經泛素樣加工，與自噬膜表面的脂酰乙醇胺結合形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ被募集并定位于自噬體膜上，直至自噬體和溶酶體相融合［5］。大量研究表明，beclin 1參與自噬體的形成，它能介導其他自噬蛋白定位于自噬前體，在自噬中起重要作用。beclin還可調節(jié)液泡分選蛋白34（valuolar protein sorting 34，Vps-34），誘導 beclin-Vps34-Vps15核心復合體形成，從而促進自噬［12］。LC3和beclin 1表達水平的增高常提示自噬活性的增高，因此本研究選擇觀察這兩種蛋白來評估自噬水平。

我們的研究結果顯示，LPS/D-GalN可引起大鼠急性肝損傷，表現為ALT和AST的升高，病理損傷程度的加重，電鏡顯示自噬體有所增多，Western blot顯示自噬相關蛋白LC3和beclin 1的表達增強，自噬的增強可能與肝細胞的自我保護反應有關；應用姜黃素后，肝臟功能得到明顯改善，組織病理損傷程度減輕，提示姜黃素對肝臟起保護作用，同時發(fā)現自噬體進一步增多，細胞自噬相關蛋白表達進一步增強，提示肝組織中存在活躍的自噬；3-MA作為I型磷脂酰肌醇3激酶通路抑制劑，可抑制自噬的起始階段以及自噬小體的形成，應用自噬抑制劑3-MA后，姜黃素的促進自噬作用被其阻滯，其對肝臟的保護作用也隨之消失。這些結果表明，姜黃素可能通過激活自噬減輕LPS/D-GalN誘導的急性肝損傷。

Zhao等［13］研究發(fā)現，在膿毒癥誘導的急性肺損傷中，自噬可降低促炎因子TNF-α、IL-6和IL-8的表達；而Liu等［14］發(fā)現，抑制自噬會使炎癥介質IL-1β、TNF-α、IL-6等增加，減弱抗炎效應；孫健等［15］的研究也提到，上調細胞自噬會抑制NF-κB蛋白的水平，增加其對炎癥細胞因子的抑制作用；而抑制自噬則導致NF-κB蛋白水平增加，并減弱其對炎癥細胞因子生成的抑制作用。以上研究均提示，自噬可能參與了對炎癥因子水平的調控過程。本研究中，姜黃素組自噬蛋白較AHE組增加，促炎因子TNF-α的表達水平顯著低于AHI組，而加入自噬抑制劑3-MA后則逆轉了姜黃素的作用，與文獻報道一致。

綜上所述，姜黃素對LPS/D-GalN誘導的大鼠急性肝損傷肝臟的保護作用可能與其促進自噬減輕炎癥反應相關，但仍需進一步深入的研究。