馬天仲 牛艷茹 韋冰

【摘要】 目的：探討分析小鼠卵子數(shù)目和線粒體活性受重金屬耦合劑（乙二胺四乙酸和檸檬酸鈉）與抗氧化劑（硫辛酸和乙酰肉堿）的影響。方法：研究對象選定為148只G57BL/6雌性小鼠，因在飼養(yǎng)期間發(fā)生互咬等正常死亡，最終參加實驗的小鼠共144只。依據(jù)隨機分組方式將144只小鼠為四組，每組各36只。使用重金屬耦合劑（乙二胺四乙酸和檸檬酸鈉）的小鼠為重金屬組，使用抗氧化劑（硫辛酸和乙酰肉堿）的小鼠為抗氧化組，使用重金屬耦合劑與抗氧化劑小鼠為混合組，未使用兩種試劑的小鼠為對照組。雌性小鼠飼養(yǎng)3、6、9、12個月后，對比分析四組研究對象的線粒體和卵子數(shù)目的各項臨床指標。結果：四組研究小鼠飼養(yǎng)3、6個月線粒體活性比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。四組研究小鼠的卵子在3、6個月的線粒體活性均明顯高于9個月，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。抗氧化組與混合組在9個月后的線粒體活性均明顯高于重金屬組與對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。對照組在3個月時的卵子數(shù)目明顯均低于其他三組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。抗氧化組與混合組在6、9個月的卵子數(shù)目均明顯高于重金屬組與對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。抗氧化組與混合組、重金屬組與對照組在6、9、12個月時卵子數(shù)目比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論：隨年齡增長，小鼠卵子的線粒體活性降低，卵子數(shù)目減少。小鼠攝入適量抗氧化劑硫辛酸和乙酰肉堿，可延緩卵母細胞老化。對人類的抗卵子老化有一定的參考價值。

【關鍵詞】 重金屬耦合劑 卵子數(shù)目 紡錘體老化 抗氧化劑 線粒體

Effects of Heavy Metal Coupling Agents （Ethylenediaminetetraacetic Acid and Sodium Citrate） and Antioxidants （Lipoic Acid and Acetylcarnitine） on the Number of Eggs and Mitochondria in Mice/MA Tianzhong， NIU Yanru， WEI Bing. //Medical Innovation of China， 2020， 17（13）： 0-019

[Abstract] Objective： To investigate the effects of heavy metal couplants （Ethylenediaminetetraacetic Acid and Sodium Citrate） and Antioxidants （Lipoic Acid and Acetylcarnitine） on the number of eggs and mitochondrial activity in mice. Method： A total of 148 female mice of G57BL/6 were selected for the study. 144 mice were finally involved in the experiment due to normal death such as biting each other during the feeding period. 144 mice were randomly divided into 4 groups， 36 mice in each group， the heavy metal couplants group （Ethylenediaminetetraacetic Acid and Sodium Citrate）， the antioxidants group （Lipoic Acid and Acetylcarnitine）， the heavy metal couplants and antioxidants group， that did not use the two reagents in the experiment was the control group. After 3， 6， 9 and 12 months， the clinical indexes of mitochondria and egg number of four groups were compared and analyzed. Result： There were no significant differences in mitochondrial activity among the four groups after 3 and 6 months （P>0.05）. After 3 and 6 months， the activity of mitochondria in the eggs of the four groups were significantly higher than those of 9 months （P<0.05）. After 9 months， the activity of mitochondria in antioxidant group and mixed group were significantly higher than those in heavy metal group and control group （P<0.05）. The number of eggs in the control group were significantly lower than those in the other three groups at 3 months （P<0.05）. The number of eggs at 6 and 9 months in antioxidant group and mixed group were significantly higher than those of heavy metal group and control group （P<0.05）. There were no significant differences in the number of eggs between antioxidant group and mixed group， heavy metal group and control group at 6， 9 and 12 months （P>0.05）. Conclusion： With the increase of age， the mitochondrial activity and the number of eggs decreased. The aging of oocytes could be delayed by appropriate intake of lipoic acid and acetylcarnitine. It has a certain reference value for human anti egg aging.

[Key words] Heavy metal couplant Egg number Spindle aging Antioxidant Mitochondria

First-authors address： Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524001， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.13.004

反復性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）和反復種植失敗（repeated implantation failure，RIF）共同的特點都表現(xiàn)為早期流產(chǎn)，二者是生殖醫(yī)學研究的熱點，一直備受臨床醫(yī)師關注[1-3]。RSA和RIF嚴重影響育齡夫婦的生育力，極大損害婦女的身體健康，隨著流產(chǎn)次數(shù)的不斷增加使其對流產(chǎn)產(chǎn)生極度的恐懼[4-5]。因此探究非整倍體在早期流產(chǎn)發(fā)生機制，能為診治反復早期流產(chǎn)提供科學的理論依據(jù)，為患者提供合理可靠的生育指導依據(jù)[6]。反復性流產(chǎn)和反復種植失敗，50%～80%的胚胎染色體異常，均以非整倍體為主[7]。非整倍體即染色體數(shù)目異常，是指細胞中染色體的數(shù)目不是該物種正常精子或卵子中染色體數(shù)目的整數(shù)倍。隨著女性年齡增大，其體內(nèi)保障染色體精確分離的保護機制如紡錘體裝配檢驗點（Spindle Assembly Checkpoint，SAC）被“磨損”削弱，而最終導致減數(shù)分裂時染色體分離異常[8]。目前卵子染色體產(chǎn)生異常的因素還沒有探究清楚，但染色體產(chǎn)生異常分裂的重要因素之一是細胞的氧化應激，細胞的氧化應激可由重金屬造成，卵子內(nèi)抗氧化劑與活性氧的含量可造成卵子非整倍體的出現(xiàn)。本文研究探討了小鼠卵子數(shù)目和線粒體活性受重金屬耦合劑（乙二胺四乙酸和檸檬酸鈉）與抗氧化劑（硫辛酸和乙酰肉堿）的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 研究對象選定為144只G57BL/6雌性小鼠，實驗時間為2018年1月-2019年1月，依據(jù)隨機分組方式分為四組，每組各36只。實驗中使用重金屬耦合劑的小鼠為重金屬組，使用抗氧化劑的小鼠為抗氧化組，使用重金屬耦合劑與抗氧化劑的小鼠為混合組，未使用兩種試劑的小鼠為對照組。納入標準：均滿3周齡，且剛剛斷乳。排除標準：在飼養(yǎng)期間發(fā)生互咬等正常死亡的小鼠，小鼠卵子數(shù)目與線粒體膜電位在實驗前出現(xiàn)異常。

1.2 方法 將所有研究小鼠放在相同的研究室不同籠子內(nèi)培養(yǎng)，可自由飲水與覓食，保證每天光照射12 h，設置研究室的溫度為（23±2）℃，濕度保證為40%～60%。將四組研究小鼠進一步平均分為四小組，每小組9只小鼠在不同時間點。重金屬組：將0.3 mmol/L的乙二胺四乙酸（EDTA，Sigma公司）和0.15 mmol/L檸檬酸鈉（Sigma公司）加入在小鼠的日常飲用水中;抗氧化組：將40 mg/L硫辛酸和100 mg/L乙酰肉堿（GNC公司）加入在小鼠的日常飲用水中;混合組：將重金屬耦合劑和抗氧化劑同時加入在小鼠的日常飲用水中;對照組：使小鼠只引用普通飲用水。實驗所用飲用水是經(jīng)過濾滅菌的普通自來水，進行3、6、9、12個月的飼養(yǎng)，卵子實驗是不同研究組不同時間階段選的9只小鼠，在實驗結束后進行。

1.3 檢測成熟卵母細胞的線粒體膜電位變化 依據(jù)Sigma公司試劑盒操作說明應用線粒體膜電位檢測試劑盒，按照1×染色緩沖工作液比例配比純水與染色體緩沖液，并與200×JC-1儲存液混勻，將水浴箱溫度設置為37 ℃，把混合液放入箱內(nèi)預熱。制作液滴，共使用1×染色緩沖工作液50 mL，在其表面蓋滿礦物油，將培養(yǎng)箱溫度設置為37 ℃，進行預熱，混合2～3只小鼠的卵子，在MⅡ期卵子中隨機抽取15～20個，放入液滴中。將培養(yǎng)箱的溫度與體積分數(shù)設置為37 ℃、5%CO2，放入20～25 min，進行中孵育，洗滌2～3次在孵育完成后。采用Image J進行檢測。

1.4 收集卵子 完成各階段的飼養(yǎng)后，將10 IU孕馬血清（寧波第二激素廠）注入小鼠腹腔，再將10 IU人絨毛膜促性腺激素（寧波第二激素廠）在46～48 h后注入腹腔，期間正常喂予對應飲用水。12～13 h后處死，打開腹腔后剪取雙側輸卵管，并分離其他組織，馬上放入自配培養(yǎng)液中。清洗3次，將輸卵管的膨大部撕開在顯微鏡下與鑷子的作用下，用培養(yǎng)液清洗卵丘-卵母細胞復合體2次，將透明質酸酶（Vitrolife公司）稀釋為1︰9的溶液，MⅡ期裸卵在清除顆粒細胞后得到，再次清洗3次應用培養(yǎng)液，計算卵子數(shù)目在新的培養(yǎng)液液滴內(nèi)。

1.5 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行分析處理，計量資料采用（x±s）表示，比較并采用t檢驗，計數(shù)資料采用率（%）表示，比較采用字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 四組檢測卵母細胞的線粒體膜電位強度比

較 四組研究小鼠飼養(yǎng)3、6個月線粒體活性比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。四組研究小鼠的卵子在3、6個月的線粒體活性均明顯高于9個月，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。抗氧化組與混合組在9個月后的線粒體活性均明顯高于重金屬組與對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 四組不同時間段的卵子數(shù)目比較 對照組在3個月時的卵子數(shù)目均明顯低于其他三組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。抗氧化組與混合組在6、9個月的卵子數(shù)目均明顯高于重金屬組與對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。抗氧化組與混合組、重金屬組與對照組在6、9、12個月時卵子數(shù)目比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

3 討論

反復性流產(chǎn)（RSA）和反復種植失?。≧IF）共同的特點都表現(xiàn)為早期流產(chǎn)，二者是生殖醫(yī)學研究的熱點，一直備受臨床醫(yī)師關注[9]。RSA和RIF嚴重影響育齡夫婦的生育力，極大損害婦女身體健康，隨著流產(chǎn)次數(shù)的不斷增加使其對流產(chǎn)產(chǎn)生極度的恐懼。造成絕經(jīng)、不孕、生殖老化的重要因素是生殖細胞功能障礙、卵母細胞老化[10-11]。本文探討分析小鼠卵子數(shù)目、線粒體和紡錘體老化受重金屬耦合劑（乙二胺四乙酸和檸檬酸鈉）與抗氧化劑（硫辛酸和乙酰肉堿）的影響。

本研究中顯示，四組研究小鼠在被飼養(yǎng)3、

6個月的期間中線粒體活性比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。四組研究小鼠的卵子3、6個月線粒體活性均明顯高于9個月，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）?？寡趸M與混合組在9個月后的線粒體活性均明顯高于重金屬組與對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。對照組在3個月時的卵子數(shù)目均明顯低于其他三組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）?？寡趸M與混合組在6、9個月的卵子數(shù)目均明顯高于重金屬組與對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）?？寡趸M與混合組、重金屬組與對照組在6、9、12個月時卵子數(shù)目比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。這提示了使用抗氧化劑可以減慢線粒體活性降低，維持紡錘體的正常形態(tài)，增加卵母細胞的數(shù)量[12-13]?？寡趸M效果之所以優(yōu)越，是因為其可延緩卵母細胞的一系列老化，而其他組效果之所以欠缺，是因為未見其有與抗氧化組相同的作用效果[14-15]。

綜上所述，隨年齡增長小鼠卵子的線粒體活性降低，卵子數(shù)目減少。小鼠攝入適量抗氧化劑硫辛酸和乙酰肉堿，可以減慢線粒體活性降低，增加卵母細胞的數(shù)量，延緩卵母細胞老化。對人類的抗卵子老化有一定的參考意義，有待進一步研究。

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（收稿日期：2019-10-29） （本文編輯：周亞杰）