閆鑫磊，張宏博，韓汶熒，高智慧，汪洋，何雨

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)食品檢測檢驗中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010090；3. 內(nèi)蒙古科鴻科技服務有限責任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii，T.gondii)是一種重要的人畜共患寄生蟲，其對宿主沒有選擇性，能夠寄生于幾乎所有溫血動物的有核細胞，并給人和動物造成嚴重的危害[1-3]。全球約三分之一的人口感染弓形蟲，我國人群弓形蟲抗體陽性率約為10.00%[4]。人感染弓形蟲可導致全身器官和組織異常，尤其對孕婦和新生兒危害更為嚴重[5-6]。動物感染會導致動物生殖障礙及流產(chǎn)，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[7-8]；同時弓形蟲可通過動物性產(chǎn)品直接或間接地傳播給人類，也對居民食品安全和公眾健康構(gòu)成了嚴重威脅[9-10]。

內(nèi)蒙古自治區(qū)是畜牧業(yè)大省，羊肉產(chǎn)品是當?shù)鼐用裰饕娜馐称分?，并以其?yōu)良的肉質(zhì)暢銷各地。然而羊弓形蟲感染不僅影響當?shù)匦竽翗I(yè)發(fā)展，還會對消費者的食品安全造成威脅。牛羊等反芻動物感染主要通過攝入被含有卵囊的貓糞便污染的草料、牧草和飲水[11-12]，其中羊血清陽性率明顯高于牛[13-14]。錫林郭勒盟作為內(nèi)蒙古重要的羊肉產(chǎn)品基地，目前針對該地區(qū)綿羊弓形蟲感染的系統(tǒng)報道較少。本研究深入錫林郭勒盟8個旗縣，以綿羊為研究對象展開弓形蟲感染的血清學檢測，應用間接ELISA方法檢測其弓形蟲感染率，以期為保障居民食品安全及家畜弓形蟲病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及血清分離

綿羊血液樣品采集于錫林郭勒盟東烏珠穆沁旗、西烏珠穆沁旗、蘇尼特左旗、蘇尼特右旗、太仆寺旗、正鑲白旗、多倫縣、正藍旗等8個旗縣。樣品以5 000 r/min離心15 min，取上清轉(zhuǎn)入經(jīng)高壓滅菌的1.5 mL離心管中，編號后于-20 ℃冰箱保存待用。

1.2 試劑

綿羊弓形蟲間接ELISA抗體檢測試劑盒，購自泉州市睿信生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

每次試驗均設空白對照1孔，陰性對照、陽性對照各3孔，其余為待檢樣品孔。提前將需要的板條在室溫中平衡20 min；在陰陽對照孔中加入試劑盒中的陰、陽性對照血清各50 μL，樣本孔中加入分離的血清上清液10 μL后，再加入樣本稀釋液40 μL，37 ℃恒溫箱中靜置45 min；其后將孔內(nèi)液體倒掉，每孔加入350 μL洗滌液，洗板機洗滌1 min，重復洗滌5次；每孔中加入HRP標記的檢測抗體100 μL，封板膜封孔后于37 ℃恒溫箱孵育30 min。孵育結(jié)束后倒掉液體，每孔加入350 μL洗滌液，洗板機洗滌1 min，重復洗滌5次。其后每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃度避光孵育15 min。每孔中加入50 μL終止液，15 min內(nèi)在450 nm波長處檢測各孔OD值。

1.4 結(jié)果判定

在陽性對照樣本OD值≥1且陰性對照樣本OD值≤0.15的條件下，判定結(jié)果的臨界值等于陰性對照樣本的平均OD值加0.15。若被測樣的OD值大于臨界值，被測樣為陽性；若被測樣的OD值小于臨界值，被測樣為陰性；若被測樣的OD值等于臨界值則對該樣品進行二次測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Excel 2007建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 23.0進行卡方檢驗分析，數(shù)據(jù)以感染陽性率表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 錫林郭勒盟各旗縣綿羊弓形蟲病流行病學調(diào)查情況

從錫林郭勒盟8個地區(qū)共采集樣品624份，經(jīng)弓形蟲抗體檢測，總體陽性率為12.02%。高于總體陽性率的有2個地區(qū)，其中最高為蘇尼特左旗(20.12%)；低于總體陽性率的有6個地區(qū)，其中最低為正藍旗(5.00%)。具體結(jié)果見表1。

2.2 不同性別綿羊弓形蟲病流行病學調(diào)查情況

由表2可知，所檢測的261份雄性綿羊血清中，檢測結(jié)果為陽性的有39份，陽性率為14.94%；363份雌性綿羊樣品中，陽性樣品數(shù)為36份，陽性率為9.92%。經(jīng)卡方檢驗分析，二者無顯著性差異(P>0.05)。

表1 弓形蟲血清抗體陽性率檢測結(jié)果

地區(qū)樣品數(shù)量陽性數(shù)量陽性率/%東烏珠穆沁旗6669.09西烏珠穆沁旗70811.43蘇尼特左旗1693420.12蘇尼特右旗55712.73太仆寺旗7068.57正鑲白旗5658.93多倫縣5858.62正藍旗8045.00合計6247512.02

表2 不同性別綿羊弓形蟲感染血清學檢測結(jié)果

地區(qū)雄性雌性樣品數(shù)量陽性率/%樣品數(shù)量陽性率/%東烏珠穆沁旗329.38348.82西烏珠穆沁旗3912.82319.68蘇尼特左旗5228.8511716.24蘇尼特右旗3112.902412.50太仆寺旗3312.12375.41正鑲白旗2213.64345.88多倫縣2611.54326.25正藍旗267.69543.70合計26114.943639.92

2.3 不同飼養(yǎng)方式綿羊弓形蟲病流行病學調(diào)查情況

由表3可知，在所檢測的435份放牧綿羊樣品中，弓形蟲血清抗體陽性率為8.74%；舍飼綿羊的陽性率為19.58%。對二者陽性率進行卡方檢驗，顯示差異極顯著(P<0.01)。

表3 不同飼養(yǎng)方式綿羊弓形蟲感染血清學檢測結(jié)果

地區(qū)放牧舍飼樣品數(shù)量陽性率/%樣品數(shù)量陽性率/%東烏珠穆沁旗248.33429.52西烏珠穆沁旗7011.4300.00蘇尼特左旗4411.3612523.20蘇尼特右旗339.0922 18.18太仆寺旗708.5700.00正鑲白旗568.9300.00多倫縣588.6200.00正藍旗805.0000.00合計435 8.7418919.58**

注：**表示合計組陽性率差異極顯著(P<0.01)。下同

2.4 不同年齡綿羊弓形蟲感染血清學檢測

以12月齡及以上的綿羊為成年羊，12月齡以下為未成年羊。結(jié)果顯示成年羊的陽性率為15.20%；未成年羊的陽性率為8.16%。成年的綿羊弓形蟲血清抗體陽性率大于未成年綿羊，且二者差異極顯著(P<0.01)，詳細結(jié)果見表4。

表4 不同年齡綿羊弓形蟲感染血清學檢測結(jié)果

地區(qū)12月齡以下12月齡及以上樣品數(shù)量陽性率/%樣品數(shù)量陽性率/%東烏珠穆沁旗345.8832 12.50西烏珠穆沁旗326.2538 15.79蘇尼特左旗9313.9876 27.63蘇尼特右旗306.6725 20.00太仆寺旗283.5742 11.90正鑲白旗195.2637 10.81多倫縣355.7123 13.04正藍旗110.0069 5.80合計282 8.1634215.20**

2.5 不同月份綿羊弓形蟲病流行病學調(diào)查情況

由表5可知，全年每個月份均有陽性樣品檢出。其中8月感染率最高(20.83%)，1月最低(3.57%)。綜合分析發(fā)現(xiàn)春冬季節(jié)感染率較低，夏秋季節(jié)較高的趨勢，但各月份間感染率不存在顯著性差異(P>0.05)。

表5 不同月份綿羊弓形蟲感染血清學檢測結(jié)果

月份樣品數(shù)量陽性數(shù)量陽性率/%12813.5725359.43332412.547068.5756269.6862229.097811113.588481020.8391051615.241036616.67115359.43123438.82合計6247512.02

3 討論

本研究利用間接ELISA方法檢測了錫林郭勒盟8個旗縣共624份綿羊血樣。結(jié)果顯示，弓形蟲血清陽性率為12.02%。與已報道的國內(nèi)[15-17]和自治區(qū)其他地區(qū)[18-19]調(diào)查結(jié)果相比處于相對較高水平。就研究結(jié)果而言，該地區(qū)綿羊弓形蟲感染情況需引起相關單位和人員重視。

結(jié)果顯示舍飼綿羊(19.58%)弓形蟲血清陽性率極顯著高于放牧綿羊(8.74%)，造成這種情況的原因可能是由于舍飼綿羊飼養(yǎng)密度大，聚集性高，因此易發(fā)生群體性感染。同時需要指出的是，本研究所采集的舍飼綿羊樣品來自東烏珠穆沁旗、蘇尼特左旗、蘇尼特右旗3個地區(qū)，且大多數(shù)采集于蘇尼特左旗(125/189)，這是蘇尼特左旗樣品陽性率(20.12%)高于其他旗縣的一個重要原因。此外本研究發(fā)現(xiàn)年齡也是造成弓形蟲感染的風險因素之一，研究數(shù)據(jù)顯示12個月齡及以上綿羊弓形蟲感染率(15.20%)高于12個月齡以下綿羊(8.16%)，且二者呈極顯著差異。這可能是由于隨著年齡增加，動物與外界環(huán)境接觸時間較長，接觸弓形蟲卵囊的可能性隨之增加，因此感染幾率較大。最后研究發(fā)現(xiàn)錫林郭勒盟不同月份綿陽弓形蟲血清陽性率呈現(xiàn)差異，各月間雖無顯著性差異，但可明顯看出春冬季節(jié)感染率低，夏秋季節(jié)高的趨勢，說明秋冬季節(jié)為弓形蟲感染的高發(fā)時期，提示在此期間相關人員應加強該疫病的防控力度。

總之，本研究結(jié)果為地區(qū)性動物疫病防控、畜牧業(yè)發(fā)展及居民肉類食品安全保障提供了一定數(shù)據(jù)參考。錫林郭勒盟草場面積廣大，綿羊養(yǎng)殖量很大，但本研究樣本量有限，因此上述結(jié)果仍具有一定的局限性。為獲得更加準確的數(shù)據(jù)，擴大采樣范圍及采樣量是今后研究努力的方向。