祝閏琦，崔雪嬌，何長(zhǎng)生，魏建忠，孫裴，李郁*

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2. 安徽省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，安徽 合肥 230091)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以成年豬繁殖障礙、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死產(chǎn)和產(chǎn)木乃伊胎，仔豬發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病和大量死亡為特征的一種急性、高度傳染性疾病。自1987年以來(lái)至今，除瑞士、芬蘭及澳大利亞等少數(shù)地區(qū)未見(jiàn)報(bào)道外，PRRS已在世界范圍內(nèi)廣泛流行，成為嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一。

中國(guó)哈獸研郭寶清于1996年從流產(chǎn)豬的胎兒中分離到PRRSV，首次證實(shí)了PRRS在中國(guó)的存在。2006年初夏，我國(guó)出現(xiàn)和流行高致病性PRRSV (highly pathogenic PRRSV, HP-PRRSV)，發(fā)病豬以高熱、高發(fā)病率和高死亡率以及妊娠母豬嚴(yán)重的繁殖障礙為特征，此次疫情給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。2012年報(bào)道的GM2和QYYZ是弱毒疫苗株與野毒株重組的新型毒株[1]。2014年，國(guó)內(nèi)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室相繼報(bào)道了一類與美國(guó)NADC30毒株高度同源的毒株，該類毒株在Nsp2基因存在131個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失，并且極易與國(guó)內(nèi)流行的其他亞群毒株發(fā)生重組，統(tǒng)稱為PRRSV NADC30-like[2-3]。2016年，1-7-4分支PRRSV在美國(guó)首次報(bào)道，近年已開(kāi)始在我國(guó)流行。2017年，在遼寧省檢測(cè)出2株1-7-4分支PRRSV，在我國(guó)PRRSV基因分群中屬于1個(gè)新亞群，該類毒株致病性差異較大，引起的臨床癥狀也不盡相同[4]。

本研究旨在了解和掌握安徽地區(qū)豬群中PRRSV的感染現(xiàn)狀，以及臨床感染的流行毒株，從而為安徽地區(qū)PRRS的流行病學(xué)研究積累有效材料，為安徽地區(qū)PRRS的有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

共收集樣品416例，均來(lái)自于2017年8月—2018年12月安徽地區(qū)16個(gè)地市的養(yǎng)豬場(chǎng)(戶)。其中病(死)豬組織混樣299例、血清71例、精液29例、唾液17例。病(死)豬組織混樣采集肺臟、肝臟、腎臟、脾臟、腹股溝淋巴結(jié)以及腸系膜淋巴結(jié)。

1.2 主要試劑及試劑盒

TIANScript M-MLV(200 U/μL)、TIANScriptTaqDNA聚合酶(5 mol/μL)、dNTP、5×First-Strand Buffer、DNA Marker-DL2000、2×TaqPCR Master Mix均購(gòu)自于天根生物有限公司；PRRSV通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒、PRRSV(NADC30-like)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒、PRRSV美洲型經(jīng)典株和高致病性變異株雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒、PRRSV美洲株實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自于北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司；核酸提取試劑盒購(gòu)自于天隆科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中登錄的基因序列(登錄號(hào)：EF635006)，利用軟件Primer 6.0設(shè)計(jì)PRRSV ORF5基因和Nsp2部分基因的特異性引物，見(jiàn)表1。引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 PRRSV ORF5基因和Nsp2部分基因擴(kuò)增用引物

引物名稱引物序列(5'→3')擴(kuò)增長(zhǎng)度/bpORF5-FF:GTGGTGTTTGGCAATGTGTC ORF5-RR:GCACCAATGTGCCGTTAACC 603Nsp2-FF:CGGCTGAGCAGGTCGATTTANsp2-RR:GCCAAGTCAGCATGTCAACC752

1.4 樣品處理

病料組織樣品：將無(wú)菌采集的各病料組織(肺臟、肝臟、腎臟、脾臟、淋巴結(jié)等)分別稱取約1 g，剪碎混勻后取0.05 g于研磨管中，加入1 mL PBS放置研磨儀中研磨至勻漿，轉(zhuǎn)入1.5 mL滅菌離心管中，8 000 r/min離心2 min，取上清液100 μL于新的1.5 mL滅菌離心管中。

全血樣品：待血凝后將全血轉(zhuǎn)入1.5 mL滅菌離心管中，8 000 r/min離心2 min，取血清100 μL于新的1.5 mL滅菌離心管中。

唾液、精液樣品：將唾液、精液等充分混勻后，取100 μL于1.5 mL滅菌離心管中。

陽(yáng)性對(duì)照樣品：無(wú)菌采集PRRSV鑒定為陽(yáng)性的各病料組織(肺臟、肝臟、腎臟、脾臟、淋巴結(jié)等)，處理方法同1.2.1。

陰性對(duì)照樣品：無(wú)菌采集PRRSV鑒定為陰性的各病料組織(肺臟、肝臟、腎臟、脾臟、淋巴結(jié)等)，處理方法同1.2.1。

1.5 病毒RNA提取

按照天隆科技有限公司核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 PRRSV檢測(cè)

按照PRRSV通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 PRRSV毒株類型檢測(cè)

按照PRRSV美洲型經(jīng)典株和HP-PRRSV雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒、PRRSV(NADC30-like)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒、PRRSV美洲型毒株實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.8 PRRSV測(cè)序鑒定

對(duì)未能通過(guò)試劑盒檢測(cè)毒株類型的PRRSV陽(yáng)性樣品，采用RT-PCR對(duì)其ORF5基因和Nsp2部分基因進(jìn)行序列擴(kuò)增、測(cè)序、比對(duì)分析鑒定。

1.8.1 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

反轉(zhuǎn)錄體系：dNTP 3 μL、下游引物 1 μL、RNA模板 10 μL、MLV 1 μL、Stand Buffer 5 μL。反應(yīng)條件：70 ℃水浴5 min，0 ℃冰水混合物中冰浴2 min，42 ℃水浴50 min。

1.8.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

1.8.2.1 PRRSV ORF5基因序列擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系：cDNA模板2 μL、2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、上下游引物各1.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.8.2.2 PRRSV Nsp2部分基因序列擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系：cDNA模板2 μL、2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、上下游引物各1.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.8.3 序列比對(duì)分析

將PCR產(chǎn)物送至安徽通用生物系統(tǒng)有限公司進(jìn)行測(cè)序，所得的序列拼接結(jié)果與GenBank上的國(guó)內(nèi)外PRRSV參考毒株進(jìn)行序列比對(duì)及同源性分析，以鑒定毒株類型。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品檢測(cè)

2.1.1 同類型樣品的檢測(cè)

在416例被檢樣品中，檢測(cè)出PRRSV的樣品有223例，總陽(yáng)性檢出率為53.6%(223/416)。不同類型樣品中PRRSV陽(yáng)性檢出率分別為病料組織混樣56.8%(170/299)、血清43.7%(31/71)、精液41.3%(12/29)、唾液58.8%(10/17)。其中病料組織混樣與唾液之間差異不明顯，血清與精液之間差異不明顯，病料組織、唾液與血清、精液之間差異均明顯。病料組織和唾液更適合用于PRRSV的檢測(cè)。

2.1.2 不同地區(qū)樣品的檢測(cè)

416例被檢樣品源自安徽阜陽(yáng)、滁州、宿州、黃山、六安、亳州、合肥、淮南、安慶、蕪湖、巢湖、池州、淮北、宿松、宣城、蚌埠等16個(gè)地市，PRRSV陽(yáng)性檢出率分別為77.0%(47/61)、72.2%(26/36)、66.7%(4/6)、58.3%(7/12)、56.1%(27/48)、52.4%(11/21)、50.9%(57/112)、50.0%(6/12)、47.1%(8/17)、38.5%(5/13)、37.5%(3/8)、33.3%(2/6)、33.3%(4/12)、33.3%(9/27)、30.0%(3/10)、26.7%(4/15)。表明安徽多個(gè)地區(qū)均存在PRRSV不同程度的感染。

2.1.3 不同季度樣品的檢測(cè)

PRRSV陽(yáng)性檢出率在第1季度(1—3月)為72.3%(60/83)、第2季度(4—6月)64.5%(60/93)、第3季度(7—9月)55.6%(45/81)、第4季度(10—12月)36.5%(56/159)。4個(gè)季度之間差異性不明顯，未呈現(xiàn)流行的季節(jié)性。

2.1.4 不同階段樣品的檢測(cè)

PRRSV陽(yáng)性檢出率在保育豬中為69.0%(164/238)，育肥豬46.3%(19/41)，死胎和弱仔29.2%(40/137)。3個(gè)階段之間差異性均不明顯，PRRSV可以感染各年齡段的豬。

2.1.5 不同臨床癥狀樣品的檢測(cè)

源自繁殖障礙癥狀的樣品PRRSV陽(yáng)性檢出率為29.2%(40/137)，呼吸道癥狀的樣品為65.6%(183/279)。兩者之間差異明顯。

2.2 PRRSV毒株類型檢測(cè)

2.2.1 PRRSV毒株檢測(cè)

在223例檢測(cè)出PRRSV的樣品中，美洲型經(jīng)典毒株占比19.7%(44/223)，HP-PRRSV占比44.8%(100/223)，PRRSV NADC30-like 占比13.0%(29/223)，美洲型毒株占比22.4%(50/223)。4種類型毒株之間差異明顯，顯示HP-PRRSV為優(yōu)勢(shì)流行毒株。ORF5基因、Nsp2部分基因擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

M. DNA Marker DL2000；1. PRRSV陽(yáng)性對(duì)照；2. PRRSV陰性對(duì)照；4～8. 被檢樣品

圖1 PRRSV ORF5基因PCR鑒定結(jié)果

2.2.2 不同類型樣品PRRSV毒株類型檢測(cè)

4種類型毒株陽(yáng)性檢出率在病料組織混樣中分別為68.2%(30/44)、72.0%(72/100)、58.6%(17/29)、66.0%(33/50)，血清樣品分別為22.7%(10/44)、20.0%(20/100)、41.4%(12/29)、20.0%(10/50)，精液樣品分別為0、3.0%(3/100)、0、10.0%(5/50)，唾液樣品分別為9.0%(4/44)、5.0%(5/100)、0、4.0%(2/50)。不同樣品中4種類型毒株之間的占比差異明顯。

M. DNA Marker DL2000；1. PRRSV陽(yáng)性對(duì)照；2. PRRSV陰性對(duì)照；3～4. 被檢樣品

圖2 PRRSV Nsp2部分基因PCR鑒定結(jié)果

2.2.3 不同地區(qū)PRRSV毒株類型檢測(cè)

安徽16個(gè)地市檢測(cè)的PRRSV毒株類型不完全一致(表2)，其中安慶、亳州、宿州、蕪湖以美洲型經(jīng)典毒株為主，淮南、合肥、滁州、淮北以HP-PRRSV為主，池州、蚌埠、宿松、阜陽(yáng)以PRRSV NADC30-like為主，黃山、六安、巢湖、宣城以美洲型毒株為主。

表2 不同地區(qū)PRRSV毒株類型檢測(cè)結(jié)果

地市陽(yáng)性檢出率/%美洲型經(jīng)典毒株HP-PRRSVPRRSVNADC30-like美洲型毒株黃山00014.0安慶9.0008.0淮南06.000合肥18.240.020.76.0六安11.410.010.318.0滁州13.614.0012.0亳州13.65.000池州003.42.0宿州4.52.000巢湖02.004.0淮北04.000宣城003.44.0蕪湖4.53.000蚌埠006.94.0宿松05.06.94.0阜陽(yáng)27.38.048.326.0

2.2.4 不同季度PRRSV毒株類型檢測(cè)

4種類型毒株在不同季度的檢出情況見(jiàn)表3，相互之間差異均不明顯。

表3 不同季度PRRSV毒株類型檢測(cè)結(jié)果

季度陽(yáng)性檢出率/%美洲型經(jīng)典毒株HP-PRRSV PRRSVNADC30-like美洲型毒株一47.739.017.234.0二22.727.037.918.0三13.616.031.036.0四15.918.013.812.0

2.2.5 不同生長(zhǎng)階段PRRSV毒株類型檢測(cè)

由表4可見(jiàn)，4種類型毒株陽(yáng)性檢出率在死胎和弱仔、保育豬和育肥豬(除HP-PRRSV和美洲型毒株)階段相互之間差異均明顯。死胎和弱仔及保育豬多見(jiàn)HP-PRRSV，育肥豬多見(jiàn)美洲型經(jīng)典毒株。

表4 不同階段PRRSV毒株類型檢測(cè)結(jié)果

生長(zhǎng)階段陽(yáng)性檢出率/%美洲型經(jīng)典毒株HP-PRRSV PRRSVNADC30-like美洲型毒株死胎和弱仔25.032.57.520.0保育豬18.950.014.022.6育肥豬36.826.315.826.3

2.2.6 不同臨床癥狀PRRSV毒株類型檢測(cè)

由表5可見(jiàn)，臨診為繁殖障礙性疾病的樣品，4種毒株類型陽(yáng)性檢出率差異明顯，以HP-PRRSV多見(jiàn)。臨診為呼吸系統(tǒng)疾病的樣品，4種毒株類型陽(yáng)性檢出率差異性均不明顯，多種類型毒株并存。

表5 不同臨床癥狀PRRSV毒株類型檢測(cè)結(jié)果

臨床癥狀陽(yáng)性檢出率/%美洲型經(jīng)典毒株HP-PRRSV PRRSVNADC30-like美洲型毒株繁殖障礙癥狀25.032.57.535.0呼吸道癥狀20.847.514.223.0

3 討論

PRRS于1987年首先在美國(guó)發(fā)生，隨后幾年之內(nèi)在北美洲和歐洲大陸均有該病發(fā)生的報(bào)道，現(xiàn)己蔓延至許多亞太地區(qū)及國(guó)家，目前PRRS已呈世界性分布。根據(jù)臨床和血清學(xué)調(diào)查，PRRS在我國(guó)廣泛存在，而且近年來(lái)流行呈上升態(tài)勢(shì)。2008—2011年浙江豬群PRRSV陽(yáng)性檢出率為51.17%[5]。2013—2014年四川部分地區(qū)豬群PRRSV陽(yáng)性檢出率為50.7%[6]。2014—2015年河南豬群PRRSV陽(yáng)性檢出率為23.2%[7]。2014—2016年江西豬群PRRSV陽(yáng)性檢出率為52.7%[8]。2014—2016年天津豬群PRRSV陽(yáng)性檢出率為26.26%[9]。2016—2017年我國(guó)華北4省市PRRSV檢測(cè)豬群的陽(yáng)性率為44.3%[10]。本研究針對(duì)2017—2018年安徽臨床樣品PRRSV感染情況的調(diào)查，結(jié)果顯示豬群中PRRSV陽(yáng)性檢出率為53.6%。不同省份或地區(qū)，PRRSV在豬群中的感染程度存在差異，在排除被檢樣品的數(shù)量、類型、來(lái)源等影響因素，可以看出安徽同浙江、四川、江西等地的情況相似，均處于PRRSV感染較嚴(yán)重的狀態(tài)。安徽是養(yǎng)豬大省、全國(guó)10個(gè)生豬主產(chǎn)省之一，而且安徽處于我國(guó)的中部地區(qū)，從地理和養(yǎng)殖規(guī)模上來(lái)看，安徽的情況比較復(fù)雜，由于養(yǎng)殖量大以及生豬交易流動(dòng)性大，因而會(huì)導(dǎo)致安徽豬群中PRRSV較高的陽(yáng)性檢出率。PRRSV在安徽流行廣泛，不呈現(xiàn)區(qū)域性分布，也無(wú)季節(jié)性流行特點(diǎn)，各階段的豬均可感染發(fā)病，呼吸道癥狀在臨床表現(xiàn)上多見(jiàn)，病料組織和唾液更適合用于PRRSV的檢測(cè)樣品。因此，防控PRRS的最佳策略應(yīng)是全方位、全面性、全時(shí)段的實(shí)踐，包括從生物安全、疫苗免疫、繼發(fā)感染控制、監(jiān)測(cè)等措施。

本研究對(duì)臨床被檢樣品中PRRSV毒株類型的檢測(cè)結(jié)果顯示：檢出率最高的毒株為HP-PRRSV(44.8%)，目前為安徽的優(yōu)勢(shì)流行毒株。2014—2015年河南豬群中HP-PRRSV陽(yáng)性檢出率為37.9%，PRRSV NADC30-like為50%[7]。2014—2016年天津豬群中HP-PRRSV陽(yáng)性檢出率為69.23%，美洲型經(jīng)典毒株為4.81%，PRRSV NADC30-like為25.96%[9]。2014—2017年山東豬群中HP-PRRSV仍然普遍存在，PRRSV NADC30-like逐漸成為優(yōu)勢(shì)流行毒株[11]。2016—2017年我國(guó)華北4省市HP-PRRSV陽(yáng)性檢出率為47.1%，PRRSV NADC30-like為52.8%[10]。結(jié)合國(guó)內(nèi)其他省市的報(bào)道，表明目前臨床上PRRSV流行毒株仍以HP-PRRSV為主，但存在其他類型的毒株，并且在PRRSV不同類型毒株中，PRRSV NADC30-like流行趨勢(shì)逐漸增強(qiáng)，我國(guó)多個(gè)地區(qū)開(kāi)始以PRRSV NADC30-like為臨床優(yōu)勢(shì)流行毒株，目前尚沒(méi)有針對(duì)該毒株的疫苗，這也是導(dǎo)致PRRSV NADC30-like的流行逐漸呈現(xiàn)上升趨勢(shì)的主要原因。