段群棚，張藝杰，2，趙碩，2，周英寧，蔣冬福，秦毅斌，盧冰霞，李斌，陳忠偉，梁家幸，趙武，何穎*

(1. 廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530001；2. 廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005)

近年來，養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)逐漸走向規(guī)?；s化，飼養(yǎng)密度越來越大，各國家各地區(qū)間貿(mào)易往來增多，豬呼吸道疫病在世界范圍內(nèi)廣泛危害養(yǎng)豬業(yè)。上世紀(jì)90年代初，我國從國外引進(jìn)種豬，從此多種呼吸道疾病傳入中國并開始大范圍流行，而我國的疫苗研制等綜合防治措施比較落后，如今豬呼吸道疫病已經(jīng)上升為規(guī)模化豬場的主導(dǎo)疾病，發(fā)病率為30%～80%左右，死亡率極高，造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。呼吸道疫病多發(fā)生于斷奶仔豬、育肥豬、保育豬和母豬等，病豬多表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、體溫升高和體重下降等，病死豬剖檢可見明顯的肺部病變[2-3]。規(guī)模豬場中豬的呼吸道疫病病因復(fù)雜，通常伴隨著多種病原的混合感染和繼發(fā)感染[4-6]。病原主要包括豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)2病毒(PCV2)、偽狂犬病毒(PRV)、豬肺炎支原體(Mhp)和胸膜肺炎放線桿菌(APP)等原發(fā)性感染病原和副豬嗜血桿菌(HP)等繼發(fā)性感染病原[2-3，7]。原發(fā)性感染病原侵入呼吸道和肺臟后，破壞呼吸道的防御屏障，造成豬呼吸道的抵抗力下降，豬體內(nèi)的內(nèi)源性繼發(fā)病原體和環(huán)境中的外源性繼發(fā)病原體進(jìn)入呼吸道，引發(fā)繼發(fā)性混合感染，暴發(fā)呼吸道疫病[2-3，8-10]。感染的病原不同靶器官也會不同，多種病原混合感染則造成多種病理變化，因此使得呼吸道疫病的臨床診斷極為困難[6]。豬呼吸道疫病在我區(qū)豬場中普遍存在，對養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了極大的影響[3]。為掌握廣西地區(qū)豬場主要呼吸道疫病的流行情況，廣西獸醫(yī)研究所病毒研究室于2015年3月至2019年2月采用RT-PCR/PCR方法和細(xì)菌分離技術(shù)對廣西地區(qū)14個地市豬場送檢的1 114份具有呼吸道癥狀病豬樣品進(jìn)行CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、Mhp、HP和APP等7種疫病病原檢測，并分析病原陽性率在不同年份、不同季節(jié)之間的差異及病原混合感染的情況，為廣西地區(qū)主要豬呼吸道疫病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料樣品來源

1 114份具有呼吸道癥狀病豬樣品為被動送檢樣品，分別于2015年3月至2019年2月采集自廣西14個地市規(guī)模豬場具有呼吸道癥狀病豬，其中南寧438份、玉林253份、桂林84份、貴港54份、百色47份、柳州43份、崇左39份、賀州32份、河池29份、北海27份、欽州23份、防城港19份、來賓18份和梧州8份。

1.1.2 主要試劑

DL2000 DNA Marker、2×TaqPCR Master Mix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit) 均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；病毒基因組DNA/RNA快速抽提試劑盒為Axygen 生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

將送檢具有呼吸道癥狀病豬的肺臟、腎臟、脾臟、肝臟、心臟和淋巴等組織樣品分別無菌操作接種于TSA血清瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂以及加有NAD的胰蛋白胨大豆?fàn)I養(yǎng)瓊脂等不同培養(yǎng)基平板，置37 ℃分別進(jìn)行需氧與厭氧培養(yǎng)，24～48 h后觀察生長情況及菌落特征，并取菌落進(jìn)行革蘭染色涂片進(jìn)行鏡檢。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank 中公開發(fā)表的各病毒的基因序列，利用Meg Align(DNAStar)，Primer Premier 7.0軟件設(shè)計引物(表1)，上述引物均送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 病料處理、病毒DNA/RNA提取和細(xì)菌DNA模板的制備

取送檢具有呼吸道癥狀的病豬肺臟、腎臟、脾臟、淋巴等組織樣品，按1∶5加入生理鹽水，在組織研磨器內(nèi)進(jìn)行研磨，反復(fù)凍融3次，4 ℃條件下10 000 r/min離心5min后取上清，進(jìn)行DNA/RNA抽提或保存于-70 ℃冰箱備用。按照 AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit使用說明書對樣品上清進(jìn)行DNA/RNA提取，所獲得的DNA/RNA直接進(jìn)行PCR/RT-PCR或置于-70 ℃保存。挑取細(xì)菌培養(yǎng)基疑似菌落，懸浮于10 μL PBS中，95 ℃ 水浴10 min，5 000 r/min離心1 min后取上清作為DNA模板，所獲得的DNA模板直接進(jìn)行PCR或置于-70 ℃保存。

表1 引物信息

病原引物序列(5'→3')GenBank登錄號退火溫度/ ℃產(chǎn)物長度/bpCSFVP1:TCGACAACCAATGAGATAGGGP2:CACAGCCCAAATCCAAAGTCATCAF09150755288PRRSVP3:AGGTGGGCAACCGTTTTAP4:CATCACTGGCGTGTAGGTAATAF102506.257738PCV2P5:CCGCGGGCTGGCTGAACTTP6:ACCCCCGCCACCGCTACCDQ220735561 154PRVP7:CAGGAGGACGAGCTGGGGCTP8:GTCCACGCCCCGCTTGAAGCTNC00615161217MhpP9:GAGCCTTCAAGCTTCACCAAGAP10:TGTGTTAGTGACTTTTGCCACCNC01750956648HPP11:GTGATGAGGAAGGGTGGTGTP12:GGCTTCGTCACCCTCTGTCP00538455826APPP13:TGGCACTGACGGTGATGAP14:GGCCATCGACTCAACCATCP00068755422

1.2.3 病毒目的基因片段擴(kuò)增

1.2.3.1 CSFV和PRRSV的RT-PCR檢測

利用特異性引物對提取的樣品RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反轉(zhuǎn)錄體系10 μL：RNA模板7 μL，5×Prime-ScriptTM稀釋液2 μL，RT Enzyme Mix 0.5 μL，下游引物0.5 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃ 40 min，94 ℃ 5 min，反應(yīng)產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增體系25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)3 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，按表2退火溫度退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果并拍照。

1.2.3.2 PCV2、PRV、Mhp、HP和APP的PCR檢測

利用特異性引物對提取的樣品DNA或細(xì)菌DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系同PCV2的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，按表2退火溫度退火40 s，72 ℃延伸70 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PRV、Mhp、HP和APP的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，按表2退火溫度退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。電泳及結(jié)果觀察同1.2.3.1。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

分析7種病原的陽性率在不同年份、季節(jié)的之間的差異和病原混合感染情況。同一份樣品只能檢測到1種病原陽性的歸為單一感染，同時檢測到2種病原陽性的歸為二重感染，同時檢測到3種病原陽性的歸為三重感染，同時檢測到4種病原陽性為四重感染，依次類推。

2 結(jié)果與分析

2.1 7種病原RT-PCR/PCR檢測

各病原經(jīng)特異性引物擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳后，在紫外線光下可分別觀察到大小為288(CSFV)、738(PRRSV)、1 154(PCV2)、217(PRV)、648(Mhp)、826(HP)和422(APP)的條帶(圖1)，與預(yù)期片段大小相符，表明本試驗設(shè)計的引物特異性強(qiáng)。

2.2 不同年份豬場送檢樣品7種病原檢測

由表2可知，2015—2019年，CSFV樣品陽性率分別為12.35%、12.99%、5.49%、8.11%和26.67%；PRRSV樣品陽性率分別為48.15%、59.32%、36.63%、43.41%和58.89%；PCV2樣品陽性率分別為56.79%、54.80%、36.63%、31.03%和42.22%；PRV樣品陽性率分別為4.94%、6.21%、8.42%、4.87%和7.78%；Mhp樣品陽性率總體呈下降趨勢，分別為9.88%、6.78%、4.03%、4.26%和1.11%；HP樣品陽性率分別為22.22%、35.03%、29.30%、18.66%和33.33%；APP樣品陽性率呈逐漸下降趨勢，分別為6.17%、3.39%、2.20%、0.81%和0。

M.DL2000 DNA Marker；1. CSFV；2. CSFV陰性對照；3. PRRSV；4. PRRSV陰性對照；5. PCV2；6. PCV2陰性對照；7. PRV；8. PRV陰性對照；9. Mhp；10. Mhp陰性對照；11. HP；12. HP陰性對照；13. APP；14. APP陰性對照

圖1 7種病原的RT-PCR/PCR電泳

2.3 不同季節(jié)豬場送檢樣品7種病原檢測

由圖2可知，CSFV樣品陽性率在冬、秋季較高，分別為11.92%和11.15%；在春、夏季較低，分別為8.37%和7.56%。PRRSV樣品陽性率在秋季最高，為53.44%；其次是春、夏季，分別為45.81%和43.28%，冬季最低，為40.99%。PCV2樣品陽性率在夏、冬季較高，分別為45.38%和41.57%；在秋、春季較低，分別為34.43%和34.36%。PRV樣品陽性率在冬季最高，為8.14%；其次是夏、春季，分別為5.88%和5.73%；秋季最低，為4.59%。Mhp樣品陽性率在夏、秋季較高，分別為7.14%和4.92%；在春、冬季較低，分別為4.41%和3.20%。HP樣品陽性率冬季最高，為30.52%；其次是秋、春季，分別為27.54%和22.47%；夏季最低，為17.65%。APP樣品陽性率在春季最高，為3.08%；其次是冬、秋季，分別為2.03%和1.64%；夏季最低，為0.84%。

表2 2015—2019年豬場呼吸道疾病樣品7種病原陽性率檢測結(jié)果 %

2.4 2015—2019年豬場送檢樣品7種病原混合感染檢測

由表3可知，2015—2019年送檢的豬呼吸道疫病樣品中，CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、Mhp、HP和APP這7種病原均存在不同程度的單一感染情況，PRRSV(16.52%)單一感染率最高，其次是PCV2(9.78%)；混合感染包括二重感染、三重感染、四重及以上感染，其中又以二重感染較為常見(29.10%)，二重感染以PRRSV+PCV2(10.77%)、PRRSV+HP(6.10%)和PCV2+HP(4.49%)為主；其次是三重感染(9.62%)，三重感染以PRRSV+PCV2+HP(4.49%)為主；四重及以上感染較少，在5年間僅檢測到22例；二重感染、三重感染、四重感染組合均形式多樣，感染情況較復(fù)雜。

圖2 2015—2019年不同季節(jié)豬場樣品7種病原檢測結(jié)果

表3 2015—2019年豬場樣品7種病原混合感染檢測結(jié)果 %

續(xù)表3

3 討論

在臨床癥狀及病理剖檢的初步診斷基礎(chǔ)上，課題組于2015年3月至2019年2月對廣西14個地市規(guī)模豬場送檢的1 114份具有呼吸道癥狀病豬樣品進(jìn)行7種豬主要呼吸道疫病病原檢測。檢測結(jié)果表明，豬呼吸道疫病在廣西普遍存在，其中 PRRSV的樣品陽性率最高，PCV2和HP次之。7種病原之間的混合感染普遍存在，其中主要以PRRSV、PCV2和HP引起的混合感染為主，除二重感染以外，還有三重和四重混合感染，甚至存在22例五重及六重混合感染情況，且不僅存在病毒與病毒間混合感染，還存在病毒與細(xì)菌、細(xì)菌與細(xì)菌間混合感染，混合感染方式多樣。1頭病豬存在多種病原混合感染，這與四川省報道的混合感染情況相一致[6]。調(diào)查結(jié)果進(jìn)一步說明混合感染已成為近年豬呼吸道疫病發(fā)病態(tài)勢，廣西地區(qū)豬呼吸道疫病仍呈多發(fā)而且以混合感染為主要態(tài)勢，疫情復(fù)雜，需引起高度重視，采取針對性有效防控措施。

2015—2019年，PRRSV的陽性率為45.87%，是廣西地區(qū)豬呼吸道疫病陽性率最高的病原，而PRRSV單一感染僅為16.52%，其余均為混合感染，且混合感染形式多樣，混合感染又以二重感染較為常見，其中PRRSV的二重感染以PRRSV+PCV2、PRRSV+HP為主，三重感染次之，三重感染以PRRSV+PCV2+HP為主。PRRSV全年均有較高的發(fā)病率，無明顯的季節(jié)性。調(diào)查結(jié)果充分說明PRRSV仍是廣西豬呼吸道疫病感染的主要病原，且以混合感染形式為主。分析可能原因：PRRSV為RNA病毒，具有高度變異的特點，基因的點突變、缺失和重組頻繁，導(dǎo)致毒株多樣性顯著，不同毒株在抗原性及致病性等方面存在一定差異，難以實現(xiàn)合理的交叉保護(hù)，且PRRSV采取多種途徑逃逸機(jī)體的免疫識別，至今還未能研制出一個理想的、能有效預(yù)防PRRSV 感染的疫苗[11-15]；PRRSV具有抗體依賴性增強(qiáng)作用(ADE)，當(dāng)機(jī)體中和抗體水平低至免疫保護(hù)水平時，PRRSV 能夠和抗體結(jié)合產(chǎn)生抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)過內(nèi)吞方式侵入宿主細(xì)胞，促進(jìn)病毒增殖。另外，PRRSV弱毒疫苗在免疫接種時也可能會出現(xiàn) ADE，主要原因在于疫苗免疫初期機(jī)體誘導(dǎo)產(chǎn)生低水平的中和抗體，這將促進(jìn)野毒株入侵宿主細(xì)胞并增值復(fù)制，進(jìn)而導(dǎo)致免疫失敗[16-18]；PRRSV可以通過其編碼蛋白來抑制干擾素的產(chǎn)生和阻礙干擾素激活的抗病毒信號通路，從而造成PRRSV在豬體內(nèi)持續(xù)性感染[19]；PRRSV可感染各種年齡段的豬群，對免疫系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致免疫抑制，從而會繼發(fā)感染許多細(xì)菌病和其他的病毒病，使疫情變的更加復(fù)雜[20-21]。

PCV2的陽性率為38.96%，也是引起廣西地區(qū)豬呼吸道疫病的主要病原。PCV2單一感染為9.78%，其余均為混合感染，說明PCV2同PRRSV一樣，主要以混合感染為主。PCV2以與PRRSV的混合感染為主，除與PRRSV等病毒混合感染外，與細(xì)菌的混合感染也較為常見，如PCV2+HP等。研究表明，PCV2單獨感染后發(fā)病或表現(xiàn)出臨床癥狀的只有10%～20%，但與其他病毒或細(xì)菌發(fā)生混合感染后可出現(xiàn)嚴(yán)重復(fù)雜的癥狀和病理變化，死亡率也大大增加，特別是與PRRSV混合感染且表現(xiàn)出PRRSV癥狀的豬幾乎都會死亡[22-24]。PCV2主要侵害感染豬的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降，引起發(fā)病豬的免疫抑制，造成多種病原的混合感染和繼發(fā)感染，導(dǎo)致更加嚴(yán)重的危害，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[25-26]。PCV2全年的發(fā)病率均處于較高水平，夏季發(fā)病率最高，可能因為廣西夏季維持時間長，豬群密度過大，使得畜舍內(nèi)空氣質(zhì)量差，有害氣體不能及時排出，豬只極易引發(fā)肺炎等呼吸道疾病，而且豬群在高濕悶熱的環(huán)境下容易產(chǎn)生應(yīng)激，使豬群整體免疫力下降，患病率也隨之升高。

CSFV單一感染較少，多發(fā)生于混合感染，其中與PRRSV和PCV2的混合感染較為常見,本病一年四季均可發(fā)生，沒有明顯的季節(jié)性，然而受氣候條件等因素影響，廣西以冬、秋兩季較為嚴(yán)重。PRV和CSFV相似，單一感染率較低，主要以混合感染為主，在寒冷的冬季感染率相對較高，因為低溫有利于病毒的存活，病毒主要通過已感染豬排毒而傳給健康豬。

Mhp作為豬主要的基礎(chǔ)性疫病病原，也是引起豬呼吸道疫病的主要因素之一，2015—2019年間僅檢測到4例Mhp的單一感染，其余均為與細(xì)菌性病原和病毒性病原的混合感染。當(dāng)前Mhp常與多種細(xì)菌、病毒及環(huán)境因素協(xié)調(diào)作用，引起豬呼吸道綜合征(PRDC)。近年來，Mhp與PRRSV?；旌细腥荆怪虏⌒赃M(jìn)一步提高，并破壞豬群的免疫功能，從而導(dǎo)致多種疫苗免疫失敗。Mhp與PRRSV是引起PRDC的主要病原，在臨床感染上存在協(xié)同效應(yīng)，尤其是當(dāng)這2種病原同時和先后感染豬時，將導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸道癥狀，病程會很長，病死率也較高[27]。本次調(diào)查Mhp檢出率偏低，分析可能跟送檢樣品的采集部位有關(guān)，因為部分送檢樣品未包含Mhp感染靶組織肺的心葉和尖葉。

調(diào)查中還發(fā)現(xiàn)，除以上4種病毒性病原和Mhp之外，還存在HP和APP等細(xì)菌性病原的感染。HP的陽性率為25.31%，除單一感染(5.57%)外，其余均為混合感染，說明細(xì)菌性病原也是誘發(fā)呼吸道疫病的主要病原；HP的混合感染多與PRRSV和PCV2有關(guān)，可能是因為豬感染PRRSV和PCV2等免疫抑制性病原后抵抗力降低，使得HP等細(xì)菌性病原極易侵入體內(nèi)，進(jìn)而影響豬群健康[28]；HP在冬季發(fā)病率較高，冬季氣溫降低，豬群整體免疫力下降，細(xì)菌性病原侵入體內(nèi)，引起呼吸道疫病。APP是引起豬傳染性胸膜肺炎 (PCP)的病原。PCP是一種豬的高度接觸性傳染性呼吸道疾病，主要表現(xiàn)為暴發(fā)性流行，以纖維素性、出血性、壞死性肺炎為特征，一年四季均可發(fā)生，但以冬春季節(jié)高發(fā),各種年齡的豬均可感染，自然條件下3月齡育肥豬最易感,病豬和亞臨床感染帶菌豬是本病的主要傳染源，可通過豬之間的直接接觸或短距離的飛沫傳播,是當(dāng)前導(dǎo)致育肥豬和種豬呼吸道疫病發(fā)病和突然死亡的主要原因，已在世界范圍內(nèi)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)APP檢出率較低可能跟送檢的樣品中以保育豬呼吸道病例居多，而易感性較高的育肥豬呼吸道病例較少有關(guān)。

從調(diào)查結(jié)果來看，廣西地區(qū)的豬呼吸道疫病感染情況嚴(yán)重且復(fù)雜，病原種類多樣，混合感染形式復(fù)雜，臨床上很難區(qū)分并作出診斷，應(yīng)盡早進(jìn)行實驗室檢測確診，針對性實施防控措施，盡可能杜絕或減少誤診漏診導(dǎo)致的防控偏差，降低經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV和PCV2是免疫抑制性病毒，是引起豬呼吸道疫病混合感染的主要因素，因此在豬的免疫預(yù)防計劃中要重點做好這2種疫病的基礎(chǔ)免疫，以保護(hù)豬免疫功能不受到損害，提高豬只抵抗力，避免受到其他細(xì)菌或病毒侵入感染[29-30]。此外，引種問題、生產(chǎn)與飼養(yǎng)管理因素、藥物的錯誤使用等也是造成或加重豬呼吸道疫病感染的重要原因。豬主要呼吸道疫病給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害了廣西養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。因此，為進(jìn)一步保障廣西養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，需要因地制宜制定科學(xué)合理預(yù)防策略以有效預(yù)防和控制豬呼吸道疫病的暴發(fā)和流行：第一，養(yǎng)豬業(yè)主應(yīng)切實做好基礎(chǔ)疫苗免疫工作；第二，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，減少高密度飼養(yǎng)和多階段混養(yǎng)，實施全進(jìn)全出管理；第三，保證飼養(yǎng)設(shè)施及場所的清潔衛(wèi)生及消毒工作，完善豬場的生物安全體系，做好日常通風(fēng)、消毒等工作，杜絕外來傳染源，切斷傳播途徑；第四，保證不同年齡、不同階段的豬能夠攝入所需營養(yǎng)量，提高免疫功能，降低患病幾率；第五，季節(jié)變化時期做好豬舍的保溫保涼工作，減少豬的應(yīng)激反應(yīng)?？傊?，豬場應(yīng)根據(jù)實際情況制定并落實一套切實可行、科學(xué)合理并且長期有效的豬主要呼吸道疫病防治方案，以有效保障豬場的經(jīng)濟(jì)效益。

綜上，調(diào)查發(fā)現(xiàn)廣西規(guī)模豬場呼吸道疫病感染較為嚴(yán)重，7種主要疫病病原均有不同程度的感染，其中PRRSV、PCV2和HP是廣西地區(qū)豬呼吸道疫病的主要病原。7種豬呼吸道病原多呈混合感染，且感染類型復(fù)雜多樣，又以PRRSV、PCV2和HP之間的混合感染最為普遍。