段群棚，張藝杰，2，趙碩，2，周英寧，蔣冬福，秦毅斌，盧冰霞，李斌，陳忠偉，梁家幸，趙武，何穎*

(1. 廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室，廣西 南寧 530001；2. 廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530005)

近年來，養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)逐漸走向規(guī)模化集約化，飼養(yǎng)密度越來越大，各國家各地區(qū)間貿易往來增多，豬呼吸道疫病在世界范圍內廣泛危害養(yǎng)豬業(yè)。上世紀90年代初，我國從國外引進種豬，從此多種呼吸道疾病傳入中國并開始大范圍流行，而我國的疫苗研制等綜合防治措施比較落后，如今豬呼吸道疫病已經(jīng)上升為規(guī)?；i場的主導疾病，發(fā)病率為30%～80%左右，死亡率極高，造成了極大的經(jīng)濟損失[1]。呼吸道疫病多發(fā)生于斷奶仔豬、育肥豬、保育豬和母豬等，病豬多表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、體溫升高和體重下降等，病死豬剖檢可見明顯的肺部病變[2-3]。規(guī)模豬場中豬的呼吸道疫病病因復雜，通常伴隨著多種病原的混合感染和繼發(fā)感染[4-6]。病原主要包括豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)2病毒(PCV2)、偽狂犬病毒(PRV)、豬肺炎支原體(Mhp)和胸膜肺炎放線桿菌(APP)等原發(fā)性感染病原和副豬嗜血桿菌(HP)等繼發(fā)性感染病原[2-3，7]。原發(fā)性感染病原侵入呼吸道和肺臟后，破壞呼吸道的防御屏障，造成豬呼吸道的抵抗力下降，豬體內的內源性繼發(fā)病原體和環(huán)境中的外源性繼發(fā)病原體進入呼吸道，引發(fā)繼發(fā)性混合感染，暴發(fā)呼吸道疫病[2-3，8-10]。感染的病原不同靶器官也會不同，多種病原混合感染則造成多種病理變化，因此使得呼吸道疫病的臨床診斷極為困難[6]。豬呼吸道疫病在我區(qū)豬場中普遍存在，對養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了極大的影響[3]。為掌握廣西地區(qū)豬場主要呼吸道疫病的流行情況，廣西獸醫(yī)研究所病毒研究室于2015年3月至2019年2月采用RT-PCR/PCR方法和細菌分離技術對廣西地區(qū)14個地市豬場送檢的1 114份具有呼吸道癥狀病豬樣品進行CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、Mhp、HP和APP等7種疫病病原檢測，并分析病原陽性率在不同年份、不同季節(jié)之間的差異及病原混合感染的情況，為廣西地區(qū)主要豬呼吸道疫病的防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料樣品來源

1 114份具有呼吸道癥狀病豬樣品為被動送檢樣品，分別于2015年3月至2019年2月采集自廣西14個地市規(guī)模豬場具有呼吸道癥狀病豬，其中南寧438份、玉林253份、桂林84份、貴港54份、百色47份、柳州43份、崇左39份、賀州32份、河池29份、北海27份、欽州23份、防城港19份、來賓18份和梧州8份。

1.1.2 主要試劑

DL2000 DNA Marker、2×TaqPCR Master Mix、反轉錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit) 均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；病毒基因組DNA/RNA快速抽提試劑盒為Axygen 生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 細菌分離培養(yǎng)

將送檢具有呼吸道癥狀病豬的肺臟、腎臟、脾臟、肝臟、心臟和淋巴等組織樣品分別無菌操作接種于TSA血清瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂以及加有NAD的胰蛋白胨大豆營養(yǎng)瓊脂等不同培養(yǎng)基平板，置37 ℃分別進行需氧與厭氧培養(yǎng)，24～48 h后觀察生長情況及菌落特征，并取菌落進行革蘭染色涂片進行鏡檢。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成

根據(jù)GenBank 中公開發(fā)表的各病毒的基因序列，利用Meg Align(DNAStar)，Primer Premier 7.0軟件設計引物(表1)，上述引物均送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 病料處理、病毒DNA/RNA提取和細菌DNA模板的制備

取送檢具有呼吸道癥狀的病豬肺臟、腎臟、脾臟、淋巴等組織樣品，按1∶5加入生理鹽水，在組織研磨器內進行研磨，反復凍融3次，4 ℃條件下10 000 r/min離心5min后取上清，進行DNA/RNA抽提或保存于-70 ℃冰箱備用。按照 AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit使用說明書對樣品上清進行DNA/RNA提取，所獲得的DNA/RNA直接進行PCR/RT-PCR或置于-70 ℃保存。挑取細菌培養(yǎng)基疑似菌落，懸浮于10 μL PBS中，95 ℃ 水浴10 min，5 000 r/min離心1 min后取上清作為DNA模板，所獲得的DNA模板直接進行PCR或置于-70 ℃保存。

表1 引物信息

病原引物序列(5'→3')GenBank登錄號退火溫度/ ℃產(chǎn)物長度/bpCSFVP1:TCGACAACCAATGAGATAGGGP2:CACAGCCCAAATCCAAAGTCATCAF09150755288PRRSVP3:AGGTGGGCAACCGTTTTAP4:CATCACTGGCGTGTAGGTAATAF102506.257738PCV2P5:CCGCGGGCTGGCTGAACTTP6:ACCCCCGCCACCGCTACCDQ220735561 154PRVP7:CAGGAGGACGAGCTGGGGCTP8:GTCCACGCCCCGCTTGAAGCTNC00615161217MhpP9:GAGCCTTCAAGCTTCACCAAGAP10:TGTGTTAGTGACTTTTGCCACCNC01750956648HPP11:GTGATGAGGAAGGGTGGTGTP12:GGCTTCGTCACCCTCTGTCP00538455826APPP13:TGGCACTGACGGTGATGAP14:GGCCATCGACTCAACCATCP00068755422

1.2.3 病毒目的基因片段擴增

1.2.3.1 CSFV和PRRSV的RT-PCR檢測

利用特異性引物對提取的樣品RNA進行RT-PCR擴增，反轉錄體系10 μL：RNA模板7 μL，5×Prime-ScriptTM稀釋液2 μL，RT Enzyme Mix 0.5 μL，下游引物0.5 μL。反轉錄條件：42 ℃ 40 min，94 ℃ 5 min，反應產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆?。PCR擴增體系25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，反轉錄產(chǎn)物(cDNA)3 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴增反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，按表2退火溫度退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應結束后取10 μL PCR擴增產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)上觀察結果并拍照。

1.2.3.2 PCV2、PRV、Mhp、HP和APP的PCR檢測

利用特異性引物對提取的樣品DNA或細菌DNA模板進行PCR擴增，PCR擴增體系同PCV2的PCR擴增反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，按表2退火溫度退火40 s，72 ℃延伸70 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PRV、Mhp、HP和APP的PCR擴增反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，按表2退火溫度退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。電泳及結果觀察同1.2.3.1。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

分析7種病原的陽性率在不同年份、季節(jié)的之間的差異和病原混合感染情況。同一份樣品只能檢測到1種病原陽性的歸為單一感染，同時檢測到2種病原陽性的歸為二重感染，同時檢測到3種病原陽性的歸為三重感染，同時檢測到4種病原陽性為四重感染，依次類推。

2 結果與分析

2.1 7種病原RT-PCR/PCR檢測

各病原經(jīng)特異性引物擴增，PCR產(chǎn)物電泳后，在紫外線光下可分別觀察到大小為288(CSFV)、738(PRRSV)、1 154(PCV2)、217(PRV)、648(Mhp)、826(HP)和422(APP)的條帶(圖1)，與預期片段大小相符，表明本試驗設計的引物特異性強。

2.2 不同年份豬場送檢樣品7種病原檢測

由表2可知，2015—2019年，CSFV樣品陽性率分別為12.35%、12.99%、5.49%、8.11%和26.67%；PRRSV樣品陽性率分別為48.15%、59.32%、36.63%、43.41%和58.89%；PCV2樣品陽性率分別為56.79%、54.80%、36.63%、31.03%和42.22%；PRV樣品陽性率分別為4.94%、6.21%、8.42%、4.87%和7.78%；Mhp樣品陽性率總體呈下降趨勢，分別為9.88%、6.78%、4.03%、4.26%和1.11%；HP樣品陽性率分別為22.22%、35.03%、29.30%、18.66%和33.33%；APP樣品陽性率呈逐漸下降趨勢，分別為6.17%、3.39%、2.20%、0.81%和0。

M.DL2000 DNA Marker；1. CSFV；2. CSFV陰性對照；3. PRRSV；4. PRRSV陰性對照；5. PCV2；6. PCV2陰性對照；7. PRV；8. PRV陰性對照；9. Mhp；10. Mhp陰性對照；11. HP；12. HP陰性對照；13. APP；14. APP陰性對照

圖1 7種病原的RT-PCR/PCR電泳

2.3 不同季節(jié)豬場送檢樣品7種病原檢測

由圖2可知，CSFV樣品陽性率在冬、秋季較高，分別為11.92%和11.15%；在春、夏季較低，分別為8.37%和7.56%。PRRSV樣品陽性率在秋季最高，為53.44%；其次是春、夏季，分別為45.81%和43.28%，冬季最低，為40.99%。PCV2樣品陽性率在夏、冬季較高，分別為45.38%和41.57%；在秋、春季較低，分別為34.43%和34.36%。PRV樣品陽性率在冬季最高，為8.14%；其次是夏、春季，分別為5.88%和5.73%；秋季最低，為4.59%。Mhp樣品陽性率在夏、秋季較高，分別為7.14%和4.92%；在春、冬季較低，分別為4.41%和3.20%。HP樣品陽性率冬季最高，為30.52%；其次是秋、春季，分別為27.54%和22.47%；夏季最低，為17.65%。APP樣品陽性率在春季最高，為3.08%；其次是冬、秋季，分別為2.03%和1.64%；夏季最低，為0.84%。

表2 2015—2019年豬場呼吸道疾病樣品7種病原陽性率檢測結果 %

2.4 2015—2019年豬場送檢樣品7種病原混合感染檢測

由表3可知，2015—2019年送檢的豬呼吸道疫病樣品中，CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、Mhp、HP和APP這7種病原均存在不同程度的單一感染情況，PRRSV(16.52%)單一感染率最高，其次是PCV2(9.78%)；混合感染包括二重感染、三重感染、四重及以上感染，其中又以二重感染較為常見(29.10%)，二重感染以PRRSV+PCV2(10.77%)、PRRSV+HP(6.10%)和PCV2+HP(4.49%)為主；其次是三重感染(9.62%)，三重感染以PRRSV+PCV2+HP(4.49%)為主；四重及以上感染較少，在5年間僅檢測到22例；二重感染、三重感染、四重感染組合均形式多樣，感染情況較復雜。

圖2 2015—2019年不同季節(jié)豬場樣品7種病原檢測結果

表3 2015—2019年豬場樣品7種病原混合感染檢測結果 %

續(xù)表3

3 討論

在臨床癥狀及病理剖檢的初步診斷基礎上，課題組于2015年3月至2019年2月對廣西14個地市規(guī)模豬場送檢的1 114份具有呼吸道癥狀病豬樣品進行7種豬主要呼吸道疫病病原檢測。檢測結果表明，豬呼吸道疫病在廣西普遍存在，其中 PRRSV的樣品陽性率最高，PCV2和HP次之。7種病原之間的混合感染普遍存在，其中主要以PRRSV、PCV2和HP引起的混合感染為主，除二重感染以外，還有三重和四重混合感染，甚至存在22例五重及六重混合感染情況，且不僅存在病毒與病毒間混合感染，還存在病毒與細菌、細菌與細菌間混合感染，混合感染方式多樣。1頭病豬存在多種病原混合感染，這與四川省報道的混合感染情況相一致[6]。調查結果進一步說明混合感染已成為近年豬呼吸道疫病發(fā)病態(tài)勢，廣西地區(qū)豬呼吸道疫病仍呈多發(fā)而且以混合感染為主要態(tài)勢，疫情復雜，需引起高度重視，采取針對性有效防控措施。

2015—2019年，PRRSV的陽性率為45.87%，是廣西地區(qū)豬呼吸道疫病陽性率最高的病原，而PRRSV單一感染僅為16.52%，其余均為混合感染，且混合感染形式多樣，混合感染又以二重感染較為常見，其中PRRSV的二重感染以PRRSV+PCV2、PRRSV+HP為主，三重感染次之，三重感染以PRRSV+PCV2+HP為主。PRRSV全年均有較高的發(fā)病率，無明顯的季節(jié)性。調查結果充分說明PRRSV仍是廣西豬呼吸道疫病感染的主要病原，且以混合感染形式為主。分析可能原因：PRRSV為RNA病毒，具有高度變異的特點，基因的點突變、缺失和重組頻繁，導致毒株多樣性顯著，不同毒株在抗原性及致病性等方面存在一定差異，難以實現(xiàn)合理的交叉保護，且PRRSV采取多種途徑逃逸機體的免疫識別，至今還未能研制出一個理想的、能有效預防PRRSV 感染的疫苗[11-15]；PRRSV具有抗體依賴性增強作用(ADE)，當機體中和抗體水平低至免疫保護水平時，PRRSV 能夠和抗體結合產(chǎn)生抗原抗體復合物，經(jīng)過內吞方式侵入宿主細胞，促進病毒增殖。另外，PRRSV弱毒疫苗在免疫接種時也可能會出現(xiàn) ADE，主要原因在于疫苗免疫初期機體誘導產(chǎn)生低水平的中和抗體，這將促進野毒株入侵宿主細胞并增值復制，進而導致免疫失敗[16-18]；PRRSV可以通過其編碼蛋白來抑制干擾素的產(chǎn)生和阻礙干擾素激活的抗病毒信號通路，從而造成PRRSV在豬體內持續(xù)性感染[19]；PRRSV可感染各種年齡段的豬群，對免疫系統(tǒng)造成嚴重損傷，導致免疫抑制，從而會繼發(fā)感染許多細菌病和其他的病毒病，使疫情變的更加復雜[20-21]。

PCV2的陽性率為38.96%，也是引起廣西地區(qū)豬呼吸道疫病的主要病原。PCV2單一感染為9.78%，其余均為混合感染，說明PCV2同PRRSV一樣，主要以混合感染為主。PCV2以與PRRSV的混合感染為主，除與PRRSV等病毒混合感染外，與細菌的混合感染也較為常見，如PCV2+HP等。研究表明，PCV2單獨感染后發(fā)病或表現(xiàn)出臨床癥狀的只有10%～20%，但與其他病毒或細菌發(fā)生混合感染后可出現(xiàn)嚴重復雜的癥狀和病理變化，死亡率也大大增加，特別是與PRRSV混合感染且表現(xiàn)出PRRSV癥狀的豬幾乎都會死亡[22-24]。PCV2主要侵害感染豬的免疫系統(tǒng)，導致機體抵抗力下降，引起發(fā)病豬的免疫抑制，造成多種病原的混合感染和繼發(fā)感染，導致更加嚴重的危害，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[25-26]。PCV2全年的發(fā)病率均處于較高水平，夏季發(fā)病率最高，可能因為廣西夏季維持時間長，豬群密度過大，使得畜舍內空氣質量差，有害氣體不能及時排出，豬只極易引發(fā)肺炎等呼吸道疾病，而且豬群在高濕悶熱的環(huán)境下容易產(chǎn)生應激，使豬群整體免疫力下降，患病率也隨之升高。

CSFV單一感染較少，多發(fā)生于混合感染，其中與PRRSV和PCV2的混合感染較為常見,本病一年四季均可發(fā)生，沒有明顯的季節(jié)性，然而受氣候條件等因素影響，廣西以冬、秋兩季較為嚴重。PRV和CSFV相似，單一感染率較低，主要以混合感染為主，在寒冷的冬季感染率相對較高，因為低溫有利于病毒的存活，病毒主要通過已感染豬排毒而傳給健康豬。

Mhp作為豬主要的基礎性疫病病原，也是引起豬呼吸道疫病的主要因素之一，2015—2019年間僅檢測到4例Mhp的單一感染，其余均為與細菌性病原和病毒性病原的混合感染。當前Mhp常與多種細菌、病毒及環(huán)境因素協(xié)調作用，引起豬呼吸道綜合征(PRDC)。近年來，Mhp與PRRSV?；旌细腥?，使致病性進一步提高，并破壞豬群的免疫功能，從而導致多種疫苗免疫失敗。Mhp與PRRSV是引起PRDC的主要病原，在臨床感染上存在協(xié)同效應，尤其是當這2種病原同時和先后感染豬時，將導致嚴重的呼吸道癥狀，病程會很長，病死率也較高[27]。本次調查Mhp檢出率偏低，分析可能跟送檢樣品的采集部位有關，因為部分送檢樣品未包含Mhp感染靶組織肺的心葉和尖葉。

調查中還發(fā)現(xiàn)，除以上4種病毒性病原和Mhp之外，還存在HP和APP等細菌性病原的感染。HP的陽性率為25.31%，除單一感染(5.57%)外，其余均為混合感染，說明細菌性病原也是誘發(fā)呼吸道疫病的主要病原；HP的混合感染多與PRRSV和PCV2有關，可能是因為豬感染PRRSV和PCV2等免疫抑制性病原后抵抗力降低，使得HP等細菌性病原極易侵入體內，進而影響豬群健康[28]；HP在冬季發(fā)病率較高，冬季氣溫降低，豬群整體免疫力下降，細菌性病原侵入體內，引起呼吸道疫病。APP是引起豬傳染性胸膜肺炎 (PCP)的病原。PCP是一種豬的高度接觸性傳染性呼吸道疾病，主要表現(xiàn)為暴發(fā)性流行，以纖維素性、出血性、壞死性肺炎為特征，一年四季均可發(fā)生，但以冬春季節(jié)高發(fā),各種年齡的豬均可感染，自然條件下3月齡育肥豬最易感,病豬和亞臨床感染帶菌豬是本病的主要傳染源，可通過豬之間的直接接觸或短距離的飛沫傳播,是當前導致育肥豬和種豬呼吸道疫病發(fā)病和突然死亡的主要原因，已在世界范圍內造成了巨大的經(jīng)濟損失。本次調查發(fā)現(xiàn)APP檢出率較低可能跟送檢的樣品中以保育豬呼吸道病例居多，而易感性較高的育肥豬呼吸道病例較少有關。

從調查結果來看，廣西地區(qū)的豬呼吸道疫病感染情況嚴重且復雜，病原種類多樣，混合感染形式復雜，臨床上很難區(qū)分并作出診斷，應盡早進行實驗室檢測確診，針對性實施防控措施，盡可能杜絕或減少誤診漏診導致的防控偏差，降低經(jīng)濟損失。PRRSV和PCV2是免疫抑制性病毒，是引起豬呼吸道疫病混合感染的主要因素，因此在豬的免疫預防計劃中要重點做好這2種疫病的基礎免疫，以保護豬免疫功能不受到損害，提高豬只抵抗力，避免受到其他細菌或病毒侵入感染[29-30]。此外，引種問題、生產(chǎn)與飼養(yǎng)管理因素、藥物的錯誤使用等也是造成或加重豬呼吸道疫病感染的重要原因。豬主要呼吸道疫病給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟損失，嚴重危害了廣西養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。因此，為進一步保障廣西養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，需要因地制宜制定科學合理預防策略以有效預防和控制豬呼吸道疫病的暴發(fā)和流行：第一，養(yǎng)豬業(yè)主應切實做好基礎疫苗免疫工作；第二，加強飼養(yǎng)管理，減少高密度飼養(yǎng)和多階段混養(yǎng)，實施全進全出管理；第三，保證飼養(yǎng)設施及場所的清潔衛(wèi)生及消毒工作，完善豬場的生物安全體系，做好日常通風、消毒等工作，杜絕外來傳染源，切斷傳播途徑；第四，保證不同年齡、不同階段的豬能夠攝入所需營養(yǎng)量，提高免疫功能，降低患病幾率；第五，季節(jié)變化時期做好豬舍的保溫保涼工作，減少豬的應激反應。總之，豬場應根據(jù)實際情況制定并落實一套切實可行、科學合理并且長期有效的豬主要呼吸道疫病防治方案，以有效保障豬場的經(jīng)濟效益。

綜上，調查發(fā)現(xiàn)廣西規(guī)模豬場呼吸道疫病感染較為嚴重，7種主要疫病病原均有不同程度的感染，其中PRRSV、PCV2和HP是廣西地區(qū)豬呼吸道疫病的主要病原。7種豬呼吸道病原多呈混合感染，且感染類型復雜多樣，又以PRRSV、PCV2和HP之間的混合感染最為普遍。