杜改梅，孫玫，劉茂軍

(1. 金陵科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210038；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

羊支原體肺炎是由綿羊肺炎支原體引起的山羊和綿羊最為常見的一種呼吸道疾病，發(fā)病率高，死亡率低。羔羊易感性強(qiáng)，發(fā)病率和死亡率均較高[1]。感染綿羊肺炎支原體之后，羊只抵抗力降低，容易繼發(fā)感染其他病原菌，致使病情加重，死亡率升高，該病在世界多個(gè)國家地區(qū)均有流行，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害[2-3]。羊支原體肺炎的診斷方法較多，如病原分離培養(yǎng)、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷等[4-6]。但支原體培養(yǎng)條件苛刻，耗時(shí)長，不適合應(yīng)用于臨床實(shí)際[7]。血清學(xué)診斷方法中，ELISA方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，高效省時(shí)。近年來，我國雖然在該方面的研究報(bào)道較多，但目前缺乏穩(wěn)定成熟的快速、特異、高通量臨床應(yīng)用診斷試劑盒，嚴(yán)重影響了該病的有效診斷與防治工作[8-9]。因此，有效控制羊支原體肺炎，應(yīng)該建立一種敏感、穩(wěn)定的診斷方法，這不僅對(duì)本病的檢測和監(jiān)控及流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義，而且為疫苗免疫的效果評(píng)估提供了支持。

為此，本研究選擇綿羊肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株Y98全菌蛋白為羊支原體肺炎血清學(xué)診斷用特異性蛋白抗原，建立間接ELISA抗體檢測技術(shù)，為羊肺炎支原體特異性診斷試劑盒的研制提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

綿羊肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株Y98由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所儲(chǔ)岳峰博士惠贈(zèng)；Y98免疫陽性血清、陰性血清由實(shí)驗(yàn)室制備。兔抗山羊酶標(biāo)二抗購自KPL公司。綿羊肺炎支原體間接血凝試驗(yàn)(IHA)檢測試劑盒為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 間接ELISA反應(yīng)程序

在包被好的酶標(biāo)板中加入不同比例稀釋的待檢血清，100 μL/孔，37 ℃作用一定時(shí)間，用洗滌液洗板5次，每次5 min，每孔300 μL。加入一定比例稀釋的酶標(biāo)抗體IgG，100 μL/孔，37 ℃作用一定時(shí)間，同上洗滌。加入底物，100 μL/孔，室溫避光顯色數(shù)分鐘。加終止液50 μL/孔，終止反應(yīng)，酶標(biāo)檢測儀測OD450值。

1.2.2 封閉液的確定

在沒有包被抗原蛋白的酶標(biāo)板中，分別用含1%明膠、1% BSA(牛血清白蛋白)、5%牛血清、5%豬血清和5%酪蛋白的磷酸鹽緩沖液作為封閉液進(jìn)行封閉，然后按照1.2.1方法進(jìn)行ELISA檢測，根據(jù)OD450值最小時(shí)，選出最合適封閉液。將篩選的最佳封閉液稀釋為不同濃度，再按照1.2.1方法進(jìn)行ELISA檢測，根據(jù)OD450值最小時(shí)，選出封閉液的最佳濃度。

1.2.3 抗原最佳稀釋度和血清最佳稀釋度的確定

采取方陣滴定的方法來確定。取酶標(biāo)板(8×12)，橫排將抗原用包被液按1/200、1/400、1/800、1/1 600進(jìn)行倍比稀釋，每孔100 μL，4 ℃過夜，取出用洗滌液洗滌5次后，每孔加入200 μL 封閉液，37 ℃作用2 h，棄孔內(nèi)封閉液；豎排將血清按1/25、1/50、1/100和1/200稀釋。以陰性O(shè)D450值低于0.3，陽性O(shè)D450值/陰性O(shè)D450值(P/N值)最大的孔所對(duì)應(yīng)的抗原稀釋度和血清稀釋度為最佳抗原稀釋度和血清稀釋度。

1.2.4 血清最佳反應(yīng)時(shí)間的確定

加入待檢血清后，分別于37 ℃作用45、60和75 min，進(jìn)行ELISA檢測，根據(jù)P/N值最大時(shí)，確定血清的最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.5 酶標(biāo)抗體反應(yīng)濃度和時(shí)間的確定

將酶標(biāo)抗體進(jìn)行1/1 000、1/2 000、1/4 000和1/8 000梯度稀釋后，37 ℃分別作用30 min，進(jìn)行ELISA檢測，根據(jù)P/N值最大時(shí)，確定酶標(biāo)抗體的最佳反應(yīng)濃度。以最佳濃度分別37 ℃作用45、60和75 min，ELISA檢測，根據(jù)P/N值最大時(shí)，確定酶標(biāo)抗體的最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.6 底物反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

加入底物后分別作用10、15和20 min，進(jìn)行ELISA檢測，根據(jù)P/N值最大時(shí)，確定底物的最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.7 ELISA臨界值的確定

采用本研究建立的綿羊肺炎支原體抗體ELISA方法檢測22份經(jīng)綿羊肺炎支原體IHA檢測為陰性的血清。計(jì)算S/P，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

S/P=(樣品OD450-陰性對(duì)照OD450均值)/(陽性對(duì)照OD450均值-陰性對(duì)照OD450均值)。

1.2.8 臨床樣品檢測符合率研究

用實(shí)驗(yàn)室研制的綿羊肺炎支原體血清抗體ELISA檢測方法和綿羊肺炎支原體IHA共同檢測來自臨床的羊血清和綿羊肺炎支原體攻毒試驗(yàn)血清共60份。統(tǒng)計(jì)分析陽性符合率和陰性符合率。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)，以單因子方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 封閉液的篩選優(yōu)化

分別用含1%明膠、1% BSA、5%牛血清、5%豬血清和5% 酪蛋白的磷酸鹽緩沖液作為封閉液，試驗(yàn)結(jié)果表明，1% BSA的磷酸鹽緩沖液作為封閉液時(shí)，OD450值最小，為0.088，效果較好(見圖1)。故選擇含1% BSA的磷酸鹽緩沖液作為封閉液。

圖1 封閉液的篩選優(yōu)化

2.2 抗原和血清最佳稀釋度的優(yōu)化

將抗原蛋白和檢測的血清分別進(jìn)行倍比稀釋，采取方陣滴定的方法來檢測血清OD450值，選擇陰性O(shè)D450值小于0.3，且以P/N值最大時(shí)的抗原稀釋倍數(shù)和血清稀釋倍數(shù)為最佳抗原和血清的稀釋倍數(shù)，但為了提高ELISA的敏感性，降低血清的非特異反應(yīng)，同時(shí)考慮到臨床檢測操作的可行性，血清稀釋度的選擇要較為合理，因此選擇抗原最佳稀釋度為1/800，血清最佳稀釋度為1/50(圖2)。

圖2 抗原和血清最佳稀釋濃度的優(yōu)化

2.3 血清反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

加入待檢血清后，分別于37 ℃作用45、60和75 min，進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果表明，一抗反應(yīng)60 min時(shí)P/N值最大，表明血清的最佳反應(yīng)時(shí)間為37 ℃ 60 min(圖3)。

2.4 HRP-兔抗山羊IgG反應(yīng)濃度和時(shí)間的優(yōu)化

將HRP-兔抗山羊IgG分別進(jìn)行1/1 000，1/2 000，1/4 000和1/8 000稀釋，37 ℃作用30 min，進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果HRP-兔抗山羊IgG作1/4 000稀釋，血清P/N值最大，且陰性血清OD450值小于0.3，表明其最佳稀釋度為1/4 000(圖4a)。在HRP-兔抗山羊IgG作1/4 000稀釋后，37 ℃分別作用45、60和75 min，進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果反應(yīng)60 min后P/N值均最大，確定酶標(biāo)抗體的最佳反應(yīng)時(shí)間為37 ℃ 60 min(圖4b)。

圖3 血清最佳反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

圖4 二抗最佳稀釋濃度(a)和最佳作用時(shí)間(b)的優(yōu)化

2.5 最佳底物作用時(shí)間

加入底物后分別作用10、15和20 min，結(jié)果表明陽性血清OD450值在10 min時(shí)的P/N值最大，因此選擇底物的最佳反應(yīng)時(shí)間為10 min(圖5)。

圖5 底物最佳作用時(shí)間的優(yōu)化

2.6 間接ELISA臨界值的確定

2.7 臨床樣品檢測符合率

用實(shí)驗(yàn)室建立的綿羊肺炎支原體抗體ELISA檢測方法和綿羊肺炎支原體抗體IHA檢測試劑盒共同檢測來自臨床的羊血清和試驗(yàn)攻毒羊血清共60份。從表1中可以看出，綿羊肺炎支原體抗體ELISA檢測方法檢出33份陽性，22份陰性，5份可疑；綿羊肺炎支原體IHA檢出38份陽性，22份陰性；兩者共同檢出陽性33份，共同檢出陰性20頭份。陽性符合率和陰性符合率分別為86.84%和90.90%。

表1 綿羊肺炎支原體抗體ELISA檢測方法和IHA檢測試劑盒的對(duì)比結(jié)果

綿羊肺炎支原體抗體IHA檢測試劑盒+-總數(shù)綿羊肺炎支原體抗體ELISA檢測方法+33033-2(另加3個(gè)可疑)20(另加可疑2個(gè))22(另加5可疑)總數(shù) 382260

3 討論

羊支原體肺炎是由綿羊肺炎支原體引起的一種以咳嗽、氣喘、漸進(jìn)性消瘦以及肺間質(zhì)增生性炎癥為特征的慢性呼吸道傳染病，該病在世界多個(gè)國家和地區(qū)均普遍流行，給當(dāng)今養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅[10]。該病主要通過空氣和飛沫經(jīng)呼吸道傳播，流行性和接觸傳染性強(qiáng)，可提高羔羊的死亡率，降低成年羊的繁殖性能，并推遲其上市，給養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[11-12]。因此，建立快速準(zhǔn)確高通量的診斷方法，及時(shí)準(zhǔn)確地對(duì)羊群進(jìn)行監(jiān)測，及早發(fā)現(xiàn)，對(duì)有效防控該病發(fā)生起著決定性作用。病原的分離培養(yǎng)是檢測綿羊支原體性肺炎的最經(jīng)典方法，但其方法繁瑣、耗時(shí)，不適宜向基層推廣應(yīng)用[13]。PCR技術(shù)快速，準(zhǔn)確性高，綿羊肺炎支原體的PCR方法最低檢測限可達(dá)到0.01 ng綿羊肺炎支原體DNA[14-16]。但該技術(shù)成本高，需要先進(jìn)的儀器設(shè)備，更適宜于實(shí)驗(yàn)室研究。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是一種新發(fā)現(xiàn)的敏感性高的分子生物學(xué)技術(shù)，存在假陽性等問題[17]。血清學(xué)方法是目前最常用的一種檢測技術(shù)。趙萍等[10]應(yīng)用IHA方法檢測綿羊支原體肺炎，陽性檢出率高，特異性和敏感性高，但其敏感性較ELISA方法低。ELISA方法以其操作簡捷方便及良好的檢測特異性與敏感性而倍受歡迎，不僅被廣泛地應(yīng)用到科研生產(chǎn)中，也被開發(fā)成各種診斷試劑盒廣泛應(yīng)用于臨床疾病的檢測，在動(dòng)物疾病的診斷和疫情監(jiān)測中發(fā)揮了重大作用。國內(nèi)雖開展了大量有關(guān)羊肺炎支原體ELISA檢測方法的研究[18-19]，但尚無可靠穩(wěn)定的商品化試劑盒。

ELISA檢測方法操作步驟雖簡單，但影響因素較多，抗原、封閉液、樣品稀釋液以及相互之間的作用時(shí)間等都會(huì)直接影響到檢測結(jié)果。本研究選取綿羊肺炎支原體Y98標(biāo)準(zhǔn)菌株作為抗原，建立綿羊肺炎支原體的抗體ELISA檢測方法。封閉是其中最重要的影響因素之一，是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程，即讓不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些未包被間隙，從而減少ELISA后續(xù)步驟中干擾物質(zhì)的再吸附，其會(huì)直接影響ELISA檢測方法的敏感度和特異性，導(dǎo)致疾病誤診，造成不良后果。常用封閉液的種類較多，但不同封閉液和不同濃度封閉液的封閉效果均不同。本試驗(yàn)分別用不同種類封閉液進(jìn)行封閉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1% BSA封閉效果較好，以含1% BSA、0.05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液作為稀釋液，有效地降低ELISA試驗(yàn)中的非特異性反應(yīng)，使得結(jié)果判定更準(zhǔn)確、更明顯、更直觀。許多報(bào)道都以BSA為封閉液，但不同報(bào)道所選用的最佳濃度有所不同，這可能與其他諸多因素有關(guān)[20]。對(duì)包被濃度、血清稀釋倍數(shù)、酶標(biāo)二抗反應(yīng)濃度，以及血清和酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行摸索，并且對(duì)各個(gè)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了綿羊肺炎支原體抗體ELISA檢測方法。與IHA檢測結(jié)果相比，本研究的方法檢出33份陽性血清，符合率為86.84%；檢出20份陰性血清，符合率為90.90%。這表明該方法特異性好，能夠反映綿羊肺炎支原體感染情況，可應(yīng)用于臨床生產(chǎn)中，為羊支原體肺炎提供監(jiān)測和診斷工具。